间歇式反应器中反硝化聚磷菌的筛选、鉴定和性能研究-毕业论文

摘 要在生物脱氮过程中，反硝化能利用NO3-作为电子受体，而在实际应用中，生物除磷可以结合生物脱氮，利用NO3-作为电子受体氧化胞内贮存PHB产生能量,从而进行过量吸磷，仅少量文章报道过此类研究。本试验研究在间歇式反应器中，以NO3-为电子受体的反硝化聚磷菌（DPB）的生理生化特性、好氧吸磷功能，同时对其反硝化聚磷性能进行了考察。试验结果表明：(1)好氧聚磷菌（PAO）经驯化诱导后不但具有反硝化产氮特性，而且具有好氧聚磷特性；(2)在传统的A2/O 工艺中存在有以NO3-为电子受体的反硝化聚磷菌；(3)在驯化过程中分离到的兼性厌氧微生物有棒状杆菌属、假白喉棒杆菌、葡萄球菌属及莫拉氏菌属，且都有不同程度的反硝化聚磷功能。关键词：硝酸盐 反硝化聚磷菌 好氧吸磷 目 录1 前言 42 试验材料与方法 52.1 试验设备及装置 52.2 试验材料 62.2.1 菌种来源 62.2.2 培养基的配方 62.2.3 好氧吸磷试验用液 62.2.4 吸磷试验用液 72.3 试验方法 72.3.1 好氧吸磷试实验操作步骤 72.3.2 吸磷试验操作步骤 72.3.3 反硝化聚磷菌的生理生化指标 72.3.4 各菌株的鉴定归属112.3.5 试验分析方法113 结果与讨论113.1 反硝化聚磷菌的筛选113.2 反硝化聚磷菌的生理生化鉴定113.2.1 第一阶段(A/O)细菌的鉴定 113.2.2 第二阶段(A/N)细菌的鉴定 133.2.3 第三阶段(A/N)细菌的鉴定 153.2.4 各阶段菌属PO43-P的平均去除率的对比173.3 反硝化聚磷菌的特性研究183.3.1 第一阶段(A/O)菌株的吸磷试验 183.3.2 第二阶段(A/N)菌株的吸磷试验 193.3.3 第三阶段(A/N)菌株的吸磷试验 203.3.4 各阶段各菌属PO43-P去除率的分析214 结论22致谢23参考文献24英文摘要25学生承诺书26成绩评定表271 前言传统的工艺认为生物反硝化脱氮和生物除磷是两个独立、相互竞争的生理过程。微生物除磷的基本原理是利用聚磷菌（Phosphorus Accumulating Organism, 简称PAO）在“厌氧放磷,好氧吸磷”的生理特点,使活性污泥交替处于厌氧、好氧的状态下达到除磷目的。微生物脱氮的基本原理是利用反硝化菌在“好氧硝化、亚硝化,缺氧反硝化”的生理特点,把各形态氮转化为氮气，达到脱氮的目的。但在实际的研究过程中，何为反硝化菌，何为聚磷菌，不同的研究者有不同的论点。有研究认为反硝化菌包括变形杆菌、微球菌属、芽孢杆菌属、产碱杆菌属、黄杆菌属等，但也有研究认为莫拉氏菌属、假单胞菌属、气单胞菌属等才是主要的反硝化菌1。对于聚磷菌，Fuhs和Chen早于1975年进行了研究,他们认为生物除磷菌是不动杆菌2，但后期研究者认为属于莫拉氏菌属、假单胞菌属、气单胞菌属等1。Megnack 3、清华大学周岳溪等人4、华东师范大学朱怀兰等人5研究结果却表明,除磷菌有假单胞菌属、气单胞菌属、棒状菌群和肠杆菌科。硝酸盐还原性和超量吸磷只是两种并不冲突的细菌生化特性，也可同时拥有这两种生化特性。因此，反硝化菌和聚磷菌之间并无严格区分，可相互交叉，其交叉点是反硝化聚磷菌DPB(denitrifying phosphorus removing bacteria，简称DPB)。由细菌完成的生物脱氮和生物除磷是两个既相对独立又相互交叉的生理过程，其交叉点是同时拥有硝酸盐还原性和超量吸磷这两种生化特性的细菌（DPB）进行的反硝化除磷脱氮生化反应1。最近一些研究表明，至少存在一部分聚磷菌可以在缺氧条件下利用硝酸盐作为电子受体进行吸磷。 因此Kerrn-Jespersen把聚磷菌划分为两类，一类仅仅可以利用氧作为电子受体;而另一类既可以利用氧，也可以利用硝酸盐为电子受体6。国内外学者纷纷提出反硝化聚磷过程是可以相互结合的，以达到处理工艺减少曝气量，节省能耗，减少运行费用，剩余污泥少等，但大多的学者研究反硝化聚磷是针对污泥这个复合菌体，而针对单菌株的反硝化聚磷的研究比较少。本研究的目的是对经过驯化试验的反硝化聚磷菌的筛选、分离及纯化，并对分离出的细菌进行生化指标的鉴定，以确定反硝化聚磷菌的菌属，并研究单菌株的吸磷特性。2 试验材料与方法2.1 试验设备及装置试验设备见表1，实验采用静态的厌氧/缺氧装置见图1.表1 设备详细资料表 Tab1 Equipment设 备型 号厂 家单人单面净化工作台SWCJIFD苏州净化设备有限公司上皿电子天平FA1004上海天平仪器厂压力蒸汽消毒器YX280B上海三申医疗器械有限公司生化培养箱LRH-250A广东省医疗器械厂全温振荡器HZQ-QX型哈尔滨东联电子技术开发有限公司氮气瓶（工业氮）广钢集团广州气体厂有限公司离心沉淀器80-1型江苏国华仪器厂微孔滤膜孔径：0.45m浙江省海宁市盐宫钱江医疗器材厂离子分析仪PXST-216型上海精密科学仪器有限公司磁力搅拌器JB-1A上海精密科学仪器有限公司铂电极213型上海精密科学仪器有限公司硝酸根选择电极手提式氧化还原测定仪TS-2上泰仪器（昆山）有限公司参比电极213型上海精密科学仪器有限公司紫外可见分光光度计752C型上海第三分析仪器厂冰箱BCD-215HC华凌 图1 静态厌/缺氧反应装置图 Fig1 the anoxic and anaerobic installation 1.氮气瓶 2.加药管 3.取样口 4.反应瓶 5.水封2.2 试验材料2.2.1 菌种来源试验采用间歇式反应器，活性污泥取自某污水处理厂生物反应池厌氧段中段的污泥，分3个阶段，对在缺氧环境下利用NO3-作为电子受体的反硝化聚磷菌(DPB)进行选择和富集。第一阶段以厌氧/好氧(A/O)方式启动运行，每天运行4周期，每个周期6小时，共运行20周期。目的是使系统中的活性污泥中在此条件下具有高效的好氧除磷效果污泥。第二阶段采用厌氧/缺氧(A/N)方式运行，每天运行3周期，每个周期8小时，共运行103周期。该阶段的目的是对反硝化聚磷菌进行选择和富集。进入缺氧阶段时系统内氮源磷源的投加量按N:P=2:17投加。NO3-以分段的形式向体系流加。第二阶段污泥浓度为35004000 mg/L，污泥龄控制在16天左右。第三阶段采用厌氧/缺氧(A/N)沉淀运行方式，每天运行3周期，每个周期8小时，共运行20周期。本试验采用第一、二、三阶段最后一周期污泥为种泥，经分离纯化后的纯菌株作为研究对象。2.2.2 培养基的配方（1）牛肉浸膏蛋白胨培养基 配方：牛肉浸膏 1.5g，琼脂 9g，蛋白胨 5g，氯化钠 2.5g，蒸馏水 500ml，pH=7.07.2，121灭菌20min。 用途：用于活化菌株。（2）聚磷菌筛选培养液8 配方：无水乙酸钠 2.5g，KH2PO4 0.125g，MgSO4-7H2O 0.25g，CaCl2-H2O 0.1g，（NH4）2SO4 1.0g，微量元素 0.5ml，蒸馏水 500ml，pH=7.07.2，121灭菌30min。 用途：用于好氧吸磷和吸磷试验。2.2.3 好氧吸磷试验用液将各阶段最后一周期分离、纯化得到的纯菌株，经过革兰氏染色和菌落特征观察合并后得到的纯菌株活化（30培养24h），在无菌操作室内将活化好的菌挑取三环于灭好菌的聚磷菌筛选培养液内。2.2.4 吸磷试验用液将通过好氧吸磷试验具有较强好氧聚磷功能的PAO活化（30培养24h），在无菌操作室内将活化好的菌挑取三环于灭好菌的聚磷菌筛选培养液（500ml）内。2.3 试验方法2.3.1 好氧吸磷试实验操作步骤8 （1）将2.2.3的试验用液置于30，140rpm/min，摇床预培养24h。（2）将（1）步中的培养液在无菌操作室内测量其OD值，并用无菌水调节OD使培养液中细菌数为1010个/ml，然后取10ml接入灭好菌的聚磷菌培养液。将其置于30，140rpm/min，进行好氧吸磷试验，在0,24,48,72h分别取少量培养液测量其ORP，然后4000转离心20min后取上清液，测量其当时的TP、PO43-P、COD值。2.3.2 吸磷试验操作步骤将2.2.4的试验用液置于自制厌氧/缺氧密封装置中，往试验用液中先通入氮气，起搅拌和驱赶反应液中氧气的作用，在0 min取样后快速测定其ORP值，然后用离心沉淀器将菌与水样分开，取上清液置于布式漏斗过0.45m的微孔滤膜，测定滤液中的COD值、PO43-P和NO3-N的浓度；然后向装置投加硝酸盐以提供NO3-作为电子受体，其中硝酸盐的投加量是根据试验用液中的PO43-P的含量进行投加，其N：P比则根据需要按一定的比例投加。（注意：投药时直接用医用滴管投加，以减少空气进入反应装置影响试验）。继续通氮气进行缺氧反硝化吸磷实验，在2、5、10、20、30、45、60、90、120、150min分别取样后快速测定其ORP值，然后用离心沉淀器将菌与水样分开，取上清液置于布式漏斗过0.45m的微孔滤膜，测定滤液中的COD、PO43-P和NO3-N的浓度。注：ORP值为200100mV，为好氧环境；ORP值为100-100mV，为缺氧环境；ORP值为-100-200mV，为厌氧环境。2.3.3 反硝化聚磷菌的生理生化指标9（1）革兰氏染色染剂：结晶紫的混合液，碘液， 95%的乙醇，番红染液。操作：用接种环挑取少量待测的菌苔，涂布在干净玻片上的一滴无菌水或蒸馏水中，风干或用酒精灯烘干（切勿温度太高）固定 用结晶紫的混合液染1min后，用水冲洗 碘液作用1min，水洗，吸干 用95%乙醇溶液脱色，流滴至洗脱液至无色（约30s） 用番红溶液染1min，水洗，风干 镜检（油镜）。结果观察：深紫色为革兰氏阳性细菌；红色为革兰氏染色阴性细菌。注意：染色用的菌种要培养1824h的菌苔，目的是防止芽孢的生长影响染色的结果。且染色要用已知革兰氏染色结果的菌种（G+，苏云金杆菌和G-，大肠杆菌）与待测定的菌种做对比。（2）硝酸盐还原测试培养基：牛肉膏0.75g，蛋白胨1.25g，KNO3 0.25g，蒸馏水250ml，pH=7.07.6。每管分装45ml，121蒸气灭菌1520min。试剂： 格里斯氏试剂 A液：对氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸（10%左右）150ml； B液：萘胺0.1g，蒸馏水20ml，稀醋酸（10%左右）150ml； 二苯胺试剂 二苯胺0.5 g溶于100ml浓硫酸中，用20ml蒸馏水稀释。接种：将测定的菌种接种于硝酸盐液体培养基中，置适温培养1，3，5天。另留一管不接种作对照。操作：取一支干净的空试管，倒入少许培养1，3，5天的培养液，各加一滴A液和B液，在对照管中同样加入A液，B液各一滴。结果观察：当培养液滴入A，B液后，溶液如变成粉红色，玫瑰红色，橙色，棕色等表示亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，则可加入一、二滴二苯胺试剂，此时如有蓝色反应，则表示培养基中仍有硝酸盐，又无亚硝酸盐反应，表示无硝酸盐还原作用；如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都已还原成其他物质，故仍应按硝酸盐还原阳性处理。（3）亚硝酸盐还原测试亚硝酸盐培养基的制备：牛肉膏10g，蛋白胨5g，蒸馏水1000ml，亚硝酸钠1g，pH=7.37.4。分装试管，121蒸气灭菌15min。试剂：同硝酸盐相同接种：将测定的菌种接种于亚硝酸盐液体培养基中，置30培养1，3，7天后测定。结果观察：加试剂A液和B液各一滴，如红色消失而产氨则为阳性，加试剂为红色说明不分解亚硝酸盐为阴性。（4）葡萄糖氧化发酵测定休和利夫森二氏培养基：蛋白胨2g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.2g，葡萄糖10.0g，琼脂6.0g，溴百里酚蓝1%水溶液3ml（先用少量95%乙醇溶解后，再加水配成1%的水溶液），蒸馏水1000ml。pH=7.07.2，分装试管，培养基高度约为4.5cm，115蒸气灭菌20min。接种：以1824h待测的幼龄菌种作种子，穿刺接种，每株2支。其中一支用灭菌的凡士林石蜡油（熔化的2/3凡士林中加入1/3液体石蜡，高压灭菌）封盖，以隔绝空气为闭管。另一支不封油为开管。同时还要有不接种的闭管和开管作对照。适温培养1，2，3，7天观察结果。结果观察：只有开管产酸变黄者为氧化型；开管和闭管均产酸变黄者为发酵型。（5）吲哚的测定培养基：1%胰蛋白胨水溶液；调pH=7.27.6，分装1/31/4试管，115蒸气灭菌30min。接种：把新鲜的待测菌种接种于上述培养基中，于适温培养。试剂：对二甲基氨基苯甲醛8g，乙醇（95%）760ml，浓盐酸160ml。测定：培养1，2，4，7天的培养液，沿管壁缓缓加入35mm高的试剂于培养液表面，在液层界面发生红色，即为阳性反应。若颜色不明显，可加45滴乙醚至培养液，摇匀，使乙醚分散于液体中，将培养液静置片刻，待乙醚浮至液面后再加入吲哚试剂。如培养液中有吲哚时，吲哚可被提取在乙醚层中，浓缩的吲哚和试剂反应，则颜色明显。（6）异染粒的测定染剂：甲液，甲苯胺蓝0.15g，孔雀绿0.20g，冰醋酸1ml，乙醇（95%）2ml，蒸馏水100ml；乙液，碘2g，碘化钾3g，蒸馏水300ml操作：用接种环挑取少量待测的菌苔，涂布在干净玻片上的一滴无菌水或蒸馏水中，风干或用酒精灯烘干（切勿温度太高）固定 用甲液染5min 倾去甲液，用乙液冲去甲液，并染1min 水洗，吸干 镜检（油镜）结果观察：异染粒呈黑色，其他部分呈暗绿色或浅绿色。注意：染色用的菌种要培养1824h的菌苔，目的是防止芽孢的生长影响染色的结果。且染色要用已知异染粒结果的菌种做对比。（7）氧化酶的测定试剂：盐酸二甲基对苯二胺1%水溶液操作：在干净的培养皿中放入一张滤纸，滴上盐酸二甲基对苯二胺1%水溶液，仅使滤纸湿润即可，不可过湿。用白金丝接种环取1824h的菌苔，涂抹在湿润的滤纸上。结果观察：在10s内涂抹的菌苔现红色者为阳性，1060s现红色者为延迟反应，60s以上现红色者不计，按阴性处理。（8）反硝化培养基：普通肉汁胨培养液 100ml，KNO3 1g,调pH7.27.4，分装试管，每管培养基高度约5cm，121蒸气灭菌30min。接种：用肉汁胨斜面菌苔为菌种，用接种环接种后用凡士林油封管，同时要以封油的不含硝酸钾的培养基做对照。结果观察：培养1-7天，观察含有硝酸钾的培养基中有无生长和是否产生起泡，如产生起泡表示有反硝化作用产生氮气，是阳性反应；但如果不含硝酸钾的对照培养基也产生起泡则只能按可疑或阴性处理，不产生起泡则为阴性。（9）产氨试验培养基：蛋白胨 5g，蒸馏水 1000ml，调节pH7.2, 分装试管， 121C灭菌 15-20min。试剂：将20g碘化钾溶于50ml水中，并在此溶液中加碘化汞小粒至溶液饱和为止（约32g）此后再加460ml水和134g氢氧化钾，将上清液贮于暗色瓶中备用。接种：以幼龄种子接种，置适温培养1, 3, 5天。 结果观察：取培养液少许，加入试剂数滴，出现黄褐色沉淀为阳性。 （10）运动性（半固体琼脂穿刺法）培养基：半固体培养基牛肉浸膏 3g，琼脂3g，蛋白胨 10g，氯化钠 5g，蒸馏水 1000ml，pH=7.07.2，分装试管，121蒸气灭菌20min。接种：用直针穿刺接种试验菌于半固体培养基内，适温培养。结果观察：细菌的运动性可用透射光目测，如生长物只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表示试验菌无运动性；如生长物由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘呈云雾状，则表示试验菌有运动性。对生长快的细菌应培养1天后观察，如第一天不能判定可在第23天再观察。如23天时仍不能判定是否有运动性，可延迟56天再观察一次。因为游动力弱的细菌，在半固体培养基中第12天中尚不能从穿刺线游开，故需多培养几天观察。如试验菌在半固体培养基中产气，气泡会将穿刺线上的生长物扩散的情况，不可误将不运动的细菌判为有运动性。如试验菌是好氧细菌，穿刺线上生长物很少，可检查从培养基表面向下渗入的生长物的情况。2.3.4 各菌株的鉴定归属根据2.3.3的生理生化指标，利用常见细菌系统鉴定手册9对反硝化聚磷菌进行鉴定归属。2.3.5 试验分析方法（1） ORP采用TS-2手提式氧化还原电位仪（2） NO3-N采用硝酸根选择电极法（3） PO43-P采用钼酸铵分光光度法（GB 11893-89）（4） COD采用快速测定法3 结果与讨论3.1 反硝化聚磷菌的筛选3.1.1 第一阶段最后一周期的污泥通过分离、纯化后得到纯菌株8株，经过革兰氏染色和菌落特征的观察，合并为4株，标记为A1、A2、A3、A4。3.1.2 第二阶段最后一周期的污泥通过分离、纯化后得到纯菌株9株，经过革兰氏染色和菌落特征的观察，合并为6株，标记为B1、B2、B3、B4、B5、B6。3.1.3 第三阶段最后一周期的污泥通过分离、纯化后得到纯菌株10株，经过革兰氏染色和菌落特征的观察，合并为5株，标记为C1、C2、C3、C4、C5。3.2 反硝化聚磷菌的生理生化鉴定3.2.1 第一阶段（A/O）细菌的鉴定利用反硝化聚磷菌培养液从第一阶段（A/O）筛选出来的4株菌，经过生理生化特性的鉴定，检索19初步将这4株菌鉴定到属，其结果如表2所示。 表2 第一阶段（A/O）细菌生化特性鉴别Tab2 the characteristics of PAO during the first period（A/O）测试项目A1A2A3A4革兰氏染色氧化酶硝酸盐还原葡萄糖氧化发酵ffff反硝化+吲哚异染颗粒亚硝酸盐还原产氨试验-运动性-细胞长度（10-6m）3.850.953.91.03.21.02.10.85细胞形态实心中长杆，棒状实心中长杆，棒状实心中长杆，棒状实心中长杆，棒状需氧性试验兼性厌氧兼性厌氧兼性厌氧兼性厌氧菌落特征中等大小中等大小中等大小中等大小鉴定结果棒状杆菌属棒状杆菌属棒状杆菌属棒状杆菌属备注11.24 (91.07%)11.29 (39.74%)11.24 (91.07%)11.24 (91.07%) 注：+，90%菌株为阳性；-，90%菌株为阴性；f，发酵；11.24，表示取 样时间；(91.07%)，表示磷的去除率。结合好氧吸磷试验的结果（图2），4株菌在好氧吸磷过程中都有吸磷效果，棒状杆菌属A1、A2、A3、A4的PO43-P浓度的去除率分别为11.34%、13.75%、13.01%、66.70%。可见，棒状杆菌属在好氧条件下都有不同程度的吸磷功能，其中A4的除磷能力最强，其次为A2和A3，最弱为A1。出现除磷效能的强弱差异，主要归因于这些菌株未经过驯化培养，其除磷功能未被诱导出来，且棒状杆菌属的种间特性也有差异。综上所述，由于这4株菌是用筛选培养基在好氧条件下培养出来的，结合好氧吸磷试验是在好氧环境下进行的，以及异染粒显性为阳性，可以认为这4株菌具有好氧聚磷特性，该结论与罗宁1的观点一致。其次，根据表2中的生理生化指标，该阶段的4株菌的反硝化显性为阳性，硝酸盐还原为阳性，产氨试验为阴性，即可推断其具有反硝化产氮特性，因此这些菌不但具有反硝化产氮特性而且具有好氧聚磷特性。3.2.2 第二阶段(A/N)细菌的鉴定利用反硝化聚磷菌培养液从第二阶段（A/N）筛选出来的6株菌，经过生理生化特性的鉴定，检索19初步将这6株菌鉴定到属，其结果如表3(1)和表3(2)所示。表3(1) 第二阶段（A/N）细菌生化特性鉴别Tab3(1) the characteristics of PAO during the second period（A/N）测试项目B1B2B3革兰氏染色+氧化酶-硝酸盐还原+葡萄糖氧化发酵fff反硝化+吲哚+异染颗粒+亚硝酸盐还原+产氨试验-运动性-细胞长度（10-6m）2.21.23.10.953.21.1细胞形态实心中长杆，棒状实心中长杆，棒状实心中长杆，棒状需氧性试验兼性厌氧兼性厌氧兼性厌氧菌落特征中等大小中等大小中等大小鉴定结果棒状杆菌属棒状杆菌属棒状杆菌属备注11.29 (39.74%)11.29 (39.74%)12.28 (83.29%)注：+，90%菌株为阳性；-，90%菌株为阴性；f，发酵；11.24，表示取样时间；(91.07%)，表示磷的去除率。从表3的生理生化鉴定表可以看出，第二阶段的细菌归属为两类：棒状杆菌属和假白喉棒杆菌。棒状杆菌属的鉴定结果与罗宁1的报道一致；而假白喉棒杆菌的鉴定结果则尚属首次，与周康群11在反硝化聚磷一体化设备中分离出来的菌株不一致，该结果与Fuhs和Chen等人提出废水生物除磷完全是由不动杆菌属组成的观点也是不一致的。我们认为，污水生物脱氮除磷过程中活性污泥混合液内微生物组成表3(2) 第二阶段（A/N）细菌生化特性鉴别Tab3(2) the characteristics of PAO during the second period（A/N）测试项目B4B5B6革兰氏染色+氧化酶-+硝酸盐还原+葡萄糖氧化发酵fff反硝化+吲哚+异染颗粒+亚硝酸盐还原+产氨试验-运动性-+细胞长度（10-6m）3.01.03.01.23.01.1细胞形态实心中长杆，棒状实心中长杆，棒状实心中长杆，棒状需氧性试验兼性厌氧兼性厌氧兼性厌氧菌落特征中等大小中等大小中等大小鉴定结果棒状杆菌属假白喉棒杆菌假白喉棒杆菌备注12.28 (83.29%)12.28 (83.29%)12.28 (83.29%)注：+，90%菌株为阳性；-，90%菌株为阴性；f，发酵；11.24，表示取样时间；(91.07%)，表示磷的去除率。的差异，是由于所采用的处理工艺的类型、进水水质和运行条件等不同所致。进一步说明掌握系统中微生物的变化、组成，对于更好的控制生物除磷系统的运行，取得良好的除磷效果是很重要的11。再结合好氧吸磷试验的结果，见图3（1）和图3（2），其中5株菌（B1、B2、B3、B4、B6）在好氧吸磷过程中都表现出较强的吸磷效果，其PO43-P的去除率都在20%以上，分别为37.73%、23.69%、42.29%、58.98%、25.19%；仅假白喉棒杆菌B5的好氧吸磷效果较差，PO43-P浓度的去除率只有11.61%；而棒状杆菌属B4的PO43-P浓度从102.82mg/L降为9.57mg/L，去除率最高达90.69%，但在48h72h中，PO43-P浓度上升为42.18mg/L，这种从吸磷状态转为放磷状态的现象有待于在机理方面作进一步研究。棒状杆菌属的PO43-P浓度的平均去除率为51.55%，而假白喉棒杆菌的PO43-P浓度的平均最大去除率为34.63%，从好氧吸磷试验的结果来看，棒状杆菌属的好氧吸磷功能较强；而属于假白喉棒杆菌的B5和B6菌株的吸磷功能就相差较远，B5的去除率只有11.61%，而B6的去除率却达到了57.64%，说明这2株菌的种间聚磷功能差异较大。综上所述，由于这6株菌是用筛选培养基在好氧条件下培养出来的，结合好氧吸磷试验是在好氧环境下进行的，以及异染粒显性为阳性，可认为这6株具有好氧聚磷特性，该结论与罗宁1的观点一致。而假白喉棒杆菌具有好氧聚磷特性为首次报道。其次，根据表3中的生理生化指标，该阶段的6株菌的反硝化显性为阳性，硝酸盐还原为阳性，产氨试验为阴性，即可推断其具有反硝化产氮特性，因此这些菌不但具有反硝化产氮特性而且具有好氧聚磷特性。3.2.3 第三阶段(A/N)细菌的鉴定利用反硝化聚磷菌培养液从第三阶段（A/N）筛选出来的5株菌，经过生理生化特性的鉴定，检索19初步将这5株菌鉴定到属，其结果如表4所示。从表4可以看出，第三阶段的细菌归属为三类：棒状杆菌属、葡萄球菌属和莫拉氏菌属。结合好氧吸磷试验的结果，见图4(1)和图4(2)，5株菌在好氧吸磷过程中都表现为有吸磷效果，其中4株菌的PO43-P的最大去除率都在30%以上，棒状杆菌属C1 表4 第三阶段（A/N）细菌生化特性鉴别Tab4 the characteristics of PAO during the third period（A/N）测试项目C1C2C3C4C5革兰氏染色+-氧化酶-+硝酸盐还原+葡萄糖氧化发酵fffff反硝化+吲哚+-异染颗粒+亚硝酸盐还原+产氨试验-运动性-细胞长度（10-6m）3.31.12.91.10.60.60.60.60.50.5细胞形态实心中长杆，棒状实心中长杆，棒状球形球形球形需氧性试验兼性厌氧兼性厌氧兼性厌氧兼性厌氧兼性厌氧菌落特征中等大小中等大小中等大小针尖大小针尖大小鉴定结果棒状杆菌属棒状杆菌属葡萄球菌属莫拉氏菌属莫拉氏菌属备注1.5 (73.42%)1.21 (93.85%)1.5 (73.42%)1.21 (93.85%)1.21 (93.85%)注：+，90%菌株为阳性；-，90%菌株为阴性；f，发酵；11.24，表示取样时间；(91.07%)，表示磷的去除率。的最大去除率仅8.55%；葡萄球菌属C3的PO43-P浓度从108.66mg/L降为33.67mg/L，去除率最高达69.01%，但在24h72h中，PO43-P的浓度从33.67 mg/L上升为60.37 mg/L，这种从吸磷状态转为放磷状态的现象有待于在机理方面作进一步研究。总的来说，葡萄球菌属C3的吸磷效果最强，莫拉氏菌属C4和C5的效果较差，其次为棒状杆菌属C2，棒状杆菌属C1的吸磷效果最差。这种差异，主要由不同菌属的特性不同，以及相同菌属的种间特性不同造成的。由此可见，由于这5株菌都是用筛选培养基在好氧条件下培养出来的，结合好氧吸磷试验是在好氧环境下进行的，以及异染粒显性为阳性，可认为这5株菌具有好氧聚磷特性，该结论与罗宁1的观点一致。其次，根据表4中的生理生化指标，该阶段的5株菌的反硝化显性为阳性，硝酸盐还原为阳性，产氨试验为阴性，即可推断其具有反硝化产氮特性，因此这些菌不但具有反硝化产氮特性而且具有好氧聚磷特性。3.2.4 各阶段菌属PO43-P的平均去除率的对比 表5 各阶段各菌属PO43-P的平均去除率Tab5 the removing rate of PAO during three periods棒状杆菌属假白喉棒杆菌葡萄球菌属莫拉氏菌属第一阶段26.20%-第二阶段40.67%35.12%-第三阶段30.93%-44.44%32.87%由表5可以看出，就三个阶段都存在的棒状杆菌属而言，PO43-P的平均去除率从第一阶段的26.20%，上升到第二阶段的40.67%，再下降到第三阶段的30.93%，其好氧聚磷特性由启动期的活化，经过第二阶段的筛选和富集，再到第三阶段稳定期的下降，说明棒状杆菌属的好氧聚磷特性在慢慢减弱，也说明了驯化达到了预期的效果：减弱反硝化聚磷菌（DPB）的好氧聚磷特性，加强其缺氧过量摄磷的能力。对于除棒状杆菌属以外的三个菌属，其PO43-P的平均去除率都比第一阶段的高，由此可以证明：DPB在经过了驯化诱导后，其反硝化聚磷性能都得到了提高。3.3 反硝化聚磷菌的特性研究3.3.1 第一阶段(A/O)菌株的吸磷试验 将该第一阶段分离出来的4株纯菌都进行吸磷试验。由图5（1）和图5（2）可见，第一阶段的菌株在吸磷试验中A1、A2，A3，A4的PO43-P浓度的去除率分别为28.57%、23.53%、26.67%、33.33%，NO3-N浓度的去除率分别为45.51%、65.71%、37.93%、81.25%，具有较弱的反硝化聚磷效果。由数据分析可知，第一阶段菌株的NO3-N浓度的去除率较高，主要体现出反硝化特性，分析其原因有：细菌的培养环境为厌氧/好氧，属于驯化的启动期，细菌的反硝化聚磷特性未被诱导出来。依据其微弱的反硝化聚磷效果又表明，以NO3-为电子受体的反硝化聚磷菌存在于传统的A2/O 工艺中,此结论与李勇智10的观点一致。3.3.2 第二阶段(A/N)菌株的吸磷试验将该阶段的5株菌进行吸磷试验，而对于好氧吸磷效果最差的B5菌则不进行吸磷试验。由图6（1）和图6（2）可见，第二阶段的菌株在吸磷试验中PO43-P和NO3-N的同步性较第一阶段好。其中棒状杆菌属B3的同步性最好，在520min期间PO43-P和NO3-N浓度的去除率分别有38.28%和49.47%，之后都下降得比较缓慢，并趋于平缓，PO43-P和NO3-N总的去除率分别为64.71%和82.64%。而棒状杆菌属B4的PO43-P和NO3-N总的去除率分别为34.21%和61.07%。棒状杆菌属B2的PO43-P和NO3-N总的去除率分别为30.77%和75.47%。棒状杆菌属B1的PO43-P和NO3-N总的去除率分别为21.05%和89.66%。第二阶段的棒状杆菌属和第一阶段比较，其反硝化聚磷现象得到显著提高，说明通过诱导后其性能得到了加强，这种驯化方式将运用于传统工艺的改良和新工艺的开发。假白喉棒杆菌B6在210min期间NO3-N的浓度持续上升，该现象有待于机理方面的进一步研究；在1020min期间，B6的NO3-N的浓度陡降，从171mg/L降为76mg/L，去除率达到55.56%，PO43-P和NO3-N总的去除率分别为42.50%和82.80%，表现出较好的反硝化聚磷性能。说明经过驯化可以诱导出新的具有良好的反硝化聚磷效果的细菌，我们应该很好的进一步研究假白喉棒杆菌的生长特点及其生长因子，为开发新的工艺奠定理论基础。 由此可知，第二阶段的菌株是在厌氧/缺氧条件下培养出来的，其反硝化聚磷现象较第一阶段得到了显著的提高，棒状杆菌属B3的反硝化聚磷效果最佳，其次为B4和B2,而B1的效果较差；好氧吸磷效果良好的假白喉棒杆菌B6，其反硝化聚磷效果也较好，说明在经过了驯化后，菌株的反硝化聚磷特性已经在一定程度上得到了提高。相同的菌属，却表现出不同的反硝化聚磷效果，这表明：部分棒状杆菌属在经过驯化诱导后，其反硝化聚磷效果得到了加强，但由于种间特性的不同，部分棒状杆菌属的反硝化聚磷效果则较差。再结合3.2.2的生理生化指标和好氧吸磷试验，进一步说明这些菌株为反硝化聚磷菌（DPB）。3.3.3 第三阶段（A/N）菌株的吸磷试验将该阶段的4株菌进行吸磷试验，而对于好氧吸磷效果最差的C1菌则不进行吸磷试验。由图7（1）和图7（2）可见，第三阶段的菌株在吸磷试验中PO43-P和NO3-N的去除同步性较第一、二阶段好。其中葡萄球菌属C3的PO43-P和NO3-N浓度的变化曲线体现出典型的反硝化聚磷现象。葡萄球菌属C3在加入NO3-作为电子受体后，PO43-P的浓度从35mg/L降为19mg/L，PO43-P浓度的最大去除率为45.72%，而NO3-N 浓度的去除率为78.33%。说明在缺氧条件下葡萄球菌属也有较强的反硝化聚磷功能，该观点与罗宁1认为葡萄球菌属为专职反硝化菌的观点不一致；但与王强、马放在SBR反应器中聚磷菌筛选及其聚磷效能研究8中认为该菌为聚磷菌的观点接近。棒状杆菌属C2、莫拉氏菌属C4和C5的反硝化聚磷特性都较好，其NO3-N浓度的去除率分别为41.76%、54.17%和76.11%，PO43-P浓度的去除率分别为38.46%、43.24%和47.37%。由此可见，棒状杆菌属C2、莫拉氏菌属C4和C5都具有较好的反硝化聚磷特性，在以后的工作中应很好的研究莫拉氏菌属和棒状杆菌属的特性，让富集环境有利于这些菌的生长。 综上，棒状杆菌属在三阶段都分离出来，并且在第二，三阶段都有良好的反硝化聚磷效果，其同步吸磷的报道属首次报道。葡萄球菌属和莫拉氏菌属在缺氧条件下都有不同程度的反硝化聚磷效果，其同步吸磷报道也属首次报道。 3.3.4 各阶段各菌属PO43-P去除率的分析对于各阶段都存在的棒状杆菌属，在此对其每个阶段的PO43-P浓度的平均去除率做对比。如图8所见，第一阶段4株棒状杆菌属在吸磷试验中PO43-P浓度的平均去除率为26.83%，第二阶段的为44.27%，第三阶段的为38.46%。对比驯化启动期（第一阶段）和稳定期（第三阶段）该菌属的PO43-P浓度的平均去除率，明显可见该菌属的反硝化聚磷功能在加强，表明经过诱导后，反硝化聚磷菌的功能得到了加强，由此可推断，各菌属的反硝化聚磷性能也得到了提高。 4 结论4.1根据生理生化特性、好氧吸磷试验及吸磷试验的分析，表明：好氧聚磷菌（PAO）经驯化诱导后不但具有反硝化产氮特性，而且具有好氧聚磷特性。4.2 在传统的A2/O 工艺中存在有以NO3-为电子受体的反硝化聚磷菌。4.3 由驯化诱导后得出的反硝化聚磷菌在缺氧条件下都有不同程度的聚磷作用。其中,假白喉棒杆菌同时还具有反硝化产氮特性和好氧聚磷特性，属于首次报道；而存在于三个阶段的棒状杆菌属则具有良好的反硝化聚磷效果，且在驯化的过程中，其反硝化聚磷性能在不断的提高。在第三阶段分离出来的葡萄球菌属和莫拉氏菌属也具有反硝化聚磷作用。致 谢经过长时间的实验过程，论文终于顺利完成，在此非常感谢指导老师周康群老师与刘晖老师对我试验理论与试验过程的悉心指导，使我从中受益不少；感谢刘洁萍老师在试验仪器与用品上，以及技术上的大力支持，此论文的完成还得益于本论文小组的全体成员共同努力，大家积极投身于试验工作。在完成论文的过程工程中，使我对水污染处理工艺的微生物构成有了很大程度的了解，为我日后工作带有很大益处。最后还要感谢其他协助我的同学。参 考 文 献1 罗宁，罗固源，许晓毅.从细菌的生化特性看生物脱氮与生物除磷的关系J.重庆环境科学，2003， 25（5）：33-35.2 Fuhs G W,Chen Min. Microbiological basis of phosphate removal in the activated sludge process for the treatment of waste water. Microbical Ecology TechJ.1975,2:119-138.3 Meganck M,Malnou D,Leflohic P.The importance of the acidogenic microflora in biological phosphorus removel.Water Sci.TechJ.1985,17:199-212.4 周岳溪,钱 易,顾夏声等.废水生物除磷机理的研究J.环境科学,1991,13(4):2-4.5 朱怀兰,史家梁,徐亚同等.SBR生物除磷工艺的研究J.上海环境学,1993,12(8):813.6 Jenspeter, Keren-Jespersen, Mogens Henze,et al . biological phosphorus release and uptake under alteration anaerobic and anoxic conditions in a fixed-film reactorJ. Wat.ResJ.1993,27(4):617-624.7 李勇智，彭永臻，张艳萍等.硝酸盐浓度及投加方式对反硝化除磷的影响J.环境污染与防治，2003，25（6）：323325.8 王强，马放，姜欣欣等.SBRf反应器中聚磷菌筛选及其聚磷效能研究A.第九次全国环境微生物学术研讨会论文摘要集C.1722.9 东秀珠 蔡妙英等编著.常见细菌系