血红蛋白与相关遗传病_检测实验.pptx

血红蛋白与相关遗传病 1 血红蛋白电泳 红细胞渗透脆性实验 珠蛋白基因检测 HbA23.5% 溶血%60% 地中海贫血 2 3 实验原理实验结果实验内容 根据不同的血红蛋白带有不同的电荷，等电点不 同，在一定的pH缓冲液中，缓冲液的pH大于Hb的 等电点时其带负电荷，电泳时在电场中向阳极泳 动，反之，Hb带正电荷向阴极泳动。经一定电压 和时间的电泳，不同的血红蛋白所带电荷不同、 相对分子质量不同，其泳动方向和速度不同，可 分离出各自的区带，同时对电泳出的各区带进行 电泳扫描，可进行各种血红蛋白的定量分析。 血红蛋白电泳 4 实验原理实验结果实验内容 血红蛋白电泳 电泳的介质：醋酸纤维薄膜 缓冲液：TEB（pH8.6） 材料： pH 8.6 TEB缓冲液适合于检出HbA、 HbA2、HbS、HbC，但HbF不易与HbA 分开，HbH与HbBarts不能分开和显示 ，应再选择其他缓冲液进行电泳分离。 无“拖尾”现象 分离速度快 灵敏度高 5 实验原理实验结果实验内容 血红蛋白电泳 准备点样洗脱定量 6 实验原理实验结果实验内容 血红蛋白电泳 A：4；A2：65 HbA2含量= A2 A2+A2 100% *临床意义： HbA2参考值：2.0%-3.5% HbA2增多，见于珠蛋白合成障碍性贫血 ，为杂合子的重要实验室诊断指标。HbE 病时也在HbA2区带位置处增加，但含量很 大（在10%以上）。HbA2轻度增加亦可见 于肝病、肿瘤和某些血液病。 =3.0% 7 实验原理实验结果实验内容 红细胞渗透脆性实验 正常红细胞悬浮于等渗的血浆中，若将其置于高 渗溶液中，红细胞会因失水而皱缩；反之，将其置 于低渗溶液中，则水进入红细胞，使红细胞膨胀。 如环境渗透压继续下降，红细胞会因继续膨胀而破 裂，释放血红蛋白，称为溶血。红细胞膜对低渗溶 液具有一定的抵抗力，这一特征称为红细胞渗透脆 性。红细胞膜对低渗溶液的抵抗力越大，红细胞在 低渗溶液中越不容易发生溶血，即红细胞渗透脆性 越小。将血液滴入不同的低渗溶液中，可检查红细 胞膜对于低渗溶液抵抗力的大小。开始出现溶血现 象的低渗溶液浓度，为该血液红细胞的最小抵抗力 ；开始出现完全溶血时的低渗溶液浓度，则为该血 液红细胞的最大抵抗力。 8 实验原理实验结果实验内容 红细胞渗透脆性实验 抗凝全血 37反应 地贫A液 上清液测得H1 混匀 地贫C液 测得H2 离心 地贫B液 地贫A液：低渗NaCl 地贫B液：终止反应 地贫C液：破坏所有RBC 9 实验原理实验结果实验内容 红细胞渗透脆性实验 H1：270；H2：280 溶血%= H1 H21.25 =77.1% *临床意义： 正常值：溶血%60% 脆性增加：试验结果与正常对照比较，提高 0.04%者即有意义， 见于遗传性球形红细胞增多 症，自身免疫性溶血性贫血伴球形红细胞增多症 ，也可见于遗传性椭圆形红细胞增多症和部分遗 传性口形红细胞增多症患者。 脆性减低：见于缺铁性贫血，地中海性贫血， 链状细胞贫血，靶形红细胞增多症，血红蛋白增 多症，脾切除术后，肝脏疾病，阻塞性黄疸等。 10 实验原理实验结果实验内容 珠蛋白基因检测 提取DNA 扩增珠蛋白基因（ PCR） PCR产物电泳 DNA测序 11 实验原理实验结果实验内容 珠蛋白基因检测 提取DNA：白细胞中加双蒸水，裂解细胞；加SDS， 破坏细胞膜；加蛋白酶K，消化蛋白质；加酚/氯仿/异 戊醇，抽提DNA，去除蛋白质和脂质；加无水乙醇， 析出DNA。 PCR：利用DNA在体外摄氏95高温时变性会变成单 链，低温（经常是60C左右）时引物与单链按碱基互 补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应 温度（72C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖 (5-3)的方向合成互补链，达到在体外扩增特定基 因的目的。 PCR产物电泳：在pH高于其pI时，DNA分子带负电荷 ，在直流电场中通过凝胶介质向正极泳动。不同的 DNA分子因电荷数、构象和分子量大小的不同，在同 一电泳系统中的泳动速度有差异，达到分离的目的。 12 实验原理实验结果实验内容 珠蛋白基因检测 白细胞中加双蒸水，裂解细胞；加SDS，破坏细胞膜；加蛋 白酶K，消化蛋白质；加酚/氯仿/异戊醇，抽提DNA，去除 蛋白质和脂质；加无水乙醇，析出DNA。 提取DNA PCR 反应体系：DNA，dNTP，引物，Taq酶，Mg2+，缓冲 液，双蒸水。 变性（94） 退火（63）延伸（74） DNA电泳 均匀混合DNA与溴酚蓝（电泳指示剂），小心加入制备好的琼脂 糖凝胶的样品槽内，跑电泳，紫外下观察。 13 实验原理实验结果实验内容 珠蛋白基因检测 电泳结果 珠蛋白基因测序 14 实验原理实验结果实验内容 珠蛋白基因检测 15 实验原理实验结果实验内容 珠蛋白基因检测 珠蛋白基因外显子区域无 突变 16 实验原理实验结果实验内容 珠蛋白基因检测 Slide by slide alignment 不配对处较多，经验 证均处于测序不稳定 区域。 17 实验原理实验结果实验内容 珠蛋白基因检测 基因多态性检测 第一段外显子第3位碱基：T 第二段内含子第16位碱基：G 第二