江汉湖第三版14第十四章微生物资源的开发与利用.ppt

第十三章 微生物资源开发与利用 第一节 微生物资源 第二节 微生物酶 第三节 微生物风味物质 第四节 微生物与保健食品的筛选 微生物资源学微生物资源学是研究微生物资源及其合是研究微生物资源及其合 理开理开 发发利用和保护的科学。是微生物、生物化学、分 子生 物，医学、农学、化学、工程学等学科的边缘科 学。 微生物资源学重点讨论微生物这一重要的资源， 它与人类的关系，开发利用的新成就，新技术及 存在 的问题。开发利用的战略和策略，值得重点投入 的领 域等。 为什么学习微生物资源开发利用? 现代工业、农业已在大规模开发动植物资源 为人类服务。但是过度开发或不合理开发，造成 环境恶化，沙漠化加剧，动植物资源减少，同时 这使得微生物资源也在不断削减。有关这些引起 国际上各国政府的高度关注，提出了只有一个地 球的口号，提出要保护生物多样性，要保护环境 ，并将可持续发展战略作为基本国策。 微生物是一类天然资源的公众意识远远没有 建立。 第一节 微生物资源 微生物资源的特殊性 微生物资源开发利用 微生物资源的保护 微生物菌体食品 单细胞蛋白 生物资源的利用现状 类群已知种估计种已知种比例 (%) 病毒 51031.31054 细菌 4.7103 410412 真菌 6.91041.51065 藻类 4104610467 被子植物 2.51052.710593 鱼类 1.91042.110490 鸟类 9.2103 1104 100 哺乳动物 4.17103 4.3103 100 一 微生物资源的特殊性 1.人类发现微生物300年，最初认识都是引起疾 病的病原微生物，所以人类一开始是把它当作敌人， 缺乏全面认识。 2.微生物形体小，比表面积大。 3.代谢类型多，生长繁殖速度惊人。可提供多样 化的产品，又不宜受气候等因素影响。 4.种源丰富，未知者众。微生物的种类有多少目 前还未知。有人认为全世界描述的微生物还不到2 ，故开发潜力巨大。 5.微生物变异性大。这为人类改造它们提供了更 大的可能性。如最初青霉素产率0.01%,但经改造后达 5，提高500倍。 一 微生物资源的特殊性 6.微生物资源的研究与开发比动植物 晚。微生物的资源开发还处于起步阶段， 零星、分散、不成体系 7.微生物能在极端环境下生存（高温、低 温、高酸、高盐） 8.微生物是一个巨大的基因资源库。 9. 微生物潜力巨大，开发前景广阔，具有 实际或潜在用途或价值（如酿酒、食品、有机 溶剂、医药、工业、农业、环保等） 1992年联合国环发大会通过了生物多样性 公约。这是人类对保护生物多样性及其永续利用的 共同纲领。我国是该公约的缔约国之一。 生物资源三支柱，即动物、植物、微生物， 其中微生物是一类与动、植物资源不同、生产性能优 越、开发前景广阔的生物资源。 我国地大物博，微生物资源极为丰富。目前，据 初步统计，我 们知道的微生物还不到10，利用的不到1， 可能有90未开发，这些都可叫做“新种”，有可能存 在新基因、能产生新产物和具有新用途。 二 微生物资源开发利用 微生物资源开发的真正兴起约50年，其中创新是开发的 灵 魂。虽然微生物资源丰富，但开发的难度也不断加大，如 20世纪 50年代有千分之一的几率，而现在只有万分之一的几率。 微生物资源开发利用程序： 总体设计、找到目的菌、效果试验、申请专利、菌种改良 及发 酵工艺研究、以及报批、生产和市场等组成。 1.总体设计 总体设计是微生物资源开发利用的首要任务。还要考虑 市场 变化、开发策略、自身现有基础等方面。往往还需要合作 伙伴的 帮助。总体设计为防止目标相重，一套好的总体设计往往 有几套 方案。 总体设计确定后，明确开发意图并贯彻始终。 2、找到目的菌 总体设计一旦确定，核心问题就是千方百计尽早找到 目 的菌.所有的策略、路线、方法等都为这个中心服务。 原则如下（4个方面）： 1）菌种来源及分离： 世界微生物资料中心资料显示，目前至少有58个国家 484 个菌种保藏中心，已保藏有80多万株，这是一个重要来源 。 分离菌种可根据开发目标，选择取样地域、取样环境，取 样 方法。 菌株分离法： 单菌株筛选纯培养； 混合菌筛选培养 例：选冶含硫矿砷金处理的微生物（铁硫杆菌、硫硫杆 菌） 2）模型设计 微生物开发目的千差万别，但必须建立准确、快速、微量 、简便的筛选模型，尽快淘汰非目的菌。模型设计可根据作用 机制、代谢途径的靶位、目的化合物等设计初筛模型。 3）一菌多筛，增加菌的利用率和入选率，还可能找到用途更 大的非目的菌。这点对生物活性物质（微生物药）的开发尤为 重要，因为有时不清楚我们要找的究竟是哪类微生物，而开发 意图在分离菌种时一般无法贯彻，因此常常要分离数以万计的 菌种。而如果只用一个模型往往找不到目的菌，造成浪费。 4）高通量筛选和组合生化相结合。（高通量筛选在国外已广 泛使用，许多模型固定在各自不同的载体上，以机器人取样， 计算分析，提高筛选效率）。 3、申请专利 专利是一个国家科技发展水平的标志之一，也 是 一个单位无形资产的重要组成部分。 微生物资源开发包含重大的经济利益，同时也 包 含重大的投入和风险。为了保护劳动成果，保护 知识 产权，及时申请专利是绝对必要的。 申请时机一般在确定某种新活性、新用途或新 化 合物时立即申请。新菌种也可申请，但不同国家 有不 同规定。 4、菌种改良及基因工程 微生物资源开发利用在某种意义上讲是微生 物 天然功能在人工控制条件下，按照人工的意志 的重 演和高效表达。 通常获得的目的物的产率会比较低，或者菌 株的 工艺性状有缺陷，这就需要进行菌种的改良。 方法： 诱变育种 ； 基因工程方法 5、微生物资源开发利用的重大课题 微生物资源开发只有50年历史，开发的潜力 还很巨大。研究重大课题有： 1）未知微生物的检测、分离和利用 2）无公害农药的微生物研究 3）微生物药物的开发 三微生物资源的保护 1.保护微生物资源的必要性 u微生物对人类的意义：一是生态系统的积极参与者，维持 生态平衡起着不可替代的作用；二是人类生活所需的各种物质的 生产者。 u社会对保护天然微生物资源的必要性和紧迫性缺乏认识。 自然界的微生物受环境的影响，处在生生死死和不停的变化之中 ，大量未知微生物灭亡。 u还有天然的极端微生物（高盐、高碱高酸、高压、太空、 高辐射等），许多极端微生物所栖息的环境正不断遭到破坏，所 以这种特定下的特殊微生物也不断在减少。 例：有学者考察云南省22个地区不同植被的土壤放线菌， 发现原始森林的放线菌最多（9个属），而后随着砍伐、耕种和旱 地程度增加，放线菌种类不断减少。 说明不是因微生物资源开发 而减少，而是自然环境破坏造成的微生物种类减少。 2.保护微生物资源的措施 1) 生产菌种和专利菌种的保护,现在主要是通 过法律手段保护. 2)天然微生物资源的保护: 保护具有代表性 的原始环境如原始森林；高山湖泊、冰川、盐湖等 。 3）对典型地区进行微生物资源调查，分离鉴 定与保 存菌种； 4）加大对微生物资源的利用； 5）宣传保护原始生态环境的重要性，将保护 微生物资源看的和保护动植物资源一样重要。 四、微生物菌体食品 平菇 香菇 草菇 返回本 节 金 针 菇 药用菌类代表 灵芝猴头 猪 苓 返回本 节 珍稀菌类代表 杏鲍菇 茶树菇 鸡腿菇 滑菇 返回本 节 （一）、食用菌的概念 可食用的 具有肉质或胶质 子实体的大型真菌 我国 现报导约981种 人工栽培的70余种 大规模生产 20余种 常规菌类 药用菌类 珍稀菌类 返回本 节 （二）食用菌的形态结构 在分类学上，食用菌属于真菌界中的担子菌门 和子囊菌门。 食用菌的子实体一般都比较大，直径和 高度可达240 cm，所以又称食用菌为大型真菌。 分为菌盖、菌柄及菌丝体3部分。 菌丝体是食用菌的营养结构，主要功能是分解 基质，吸收、输送及贮藏养分；子实体（菌盖、菌 柄）是繁殖结构，其主要作用是产生孢子，繁殖后 代。 菌丝形态 1 孢子， 2 孢子膨大 3 孢子萌发 4 菌丝分枝 5 菌丝体 6 放大的菌 丝体 A 细胞壁 B 细胞核 C 细胞质 D 细胞隔膜 菌丝体的形态结构 有隔菌丝 无隔菌丝 菌丝体的形态结构 食用菌的菌丝一般是多细胞的，菌丝被 隔膜隔成了多个细胞。 每个细胞可是单核、多核或双核。邻近 的两个菌丝细胞之间，可发生细胞质交换。 子实体的形态结构 伞 状：双孢蘑菇 贝 壳 状：平菇 漏 斗 状：鸡油菌 舌 状：牛舌 菌 头 状：猴头菌 毛 刷 状：齿状 菌 珊 瑚 状：珊瑚菌 盘 状：盘菌 蜂 窝 状：羊肚菌 马 鞍 状：马鞍 菌 耳 状：木耳 花 瓣 状：银耳 绣 球 状：绣球菌 子实体的形态结构 舌 状 子实体的形态结构 蜂窝状 子实体的形态结构 耳 状 花 瓣 状 子实体的形态结构 子实体的形态结构 伞 状 伞菌子实体的形态结构 二、食用菌的生产意义 （三）食用菌的营养成分 一 高 高 蛋 白 二 低 低脂肪 低糖 四 多 膳食纤维素 矿质元素 氨基酸 维生素 二 无 无胆固醇 无淀粉 返回本 节 1、营养价值 集中了食品的一切良好特性、营养价值达到植物性食 品的顶峰植物肉、上帝食品、长寿食品 营养结构合理，各营养成分的比例平衡 表绪1 部分食用菌与蔬菜、粮食中 蛋白质含量的比较（g/100g干重） 食用菌蔬菜粮食 种类蛋白质种类蛋白质种类蛋白质 蘑菇36.1白萝卜0.6小麦12.4 香菇13.418.5大白菜1.1稻米8.5 平菇10.530.4菠菜1.8玉米8.5 草菇25.930.1黄瓜0.8高粱9.5 返回本 节 表绪2 部分食用菌维生素的含量（mg/kg鲜品） 菌类 维生素 VB1VB2VB3VCVD原 双孢菇1.60.748.0131.91240.0 香菇0.71.224.0109.72460.0 平菇4.01.4107.093.01200.0 草菇12.033.0919.0206.27 金针菇3.10.581.0109.32040.0 返回本 节 2.药用价值 （1）药用成分 主要是多糖类、三萜类 及核苷类化合物等。 （2）药效 增 强 免 疫 力 清 除 自 由 基 防治心血管病 保肝、健胃、减肥等 肿瘤 辐射 衰老 病毒 抗 返回本 节 食用菌世界生产概况 一、生产概况 20 世 纪 30年代 生产国家10余个 总产量5.5万t（主要是双孢菇） 70年代 前：主产地是欧洲及北美 后 生产国家发展到80多个 总产量100万t 主产地由欧洲变为亚洲 返回本 节 （四)食用菌发展概况 主要生产国 法国、德国、美国、 荷兰、日本、南韩、 意大利、印尼、泰国等 双孢菇：主产于欧洲与北美 香菇：主产于中国与日本 平菇：主产于中国、西德、法国等 草菇：主产于中国、印尼、泰国等 世界四大 食用菌 返回本 节 （二）中国生产概况 人工 栽培 自30年代从国外引进双孢菇开始 70年代前基本为半人工栽培 70年代后进行全人工栽培 20多个省区从事生产 从业人员约3000万 古田、庆元、泌阳三大批发市场 全国有 现 在 总产值仅次于粮、棉、油、果、菜、 位居第六位，超过了茶叶及蚕桑。 成为世界名副其实的生产大国 正以15%年增长速度发展 栽 培 原料：段木棉籽壳秸秆等混合料 方式：熟料、室内生料、发酵料、室外 品种：少、低产多、抗逆性强、产量较高 规模：小而分散大而集中 返回本 节 26.8% 53.8% 60% 65%70% 中国与世界食用菌总产量的比较（万吨） 返回本 节 是创汇产业 2002年出口119个国家 出口量占 世界40% 亚洲80% 每年贸易额约达6亿美元 返回本 节 发展趋势 1）向高效益发展 反季节栽培 立体栽培 珍稀菌类 2 2）向高质量发展）向高质量发展 生产 实行标准化 减少农药、激素的使用 多用物理、生物防治法 返回本 节 3 3）向工厂化和规模化发展）向工厂化和规模化发展 形式：零散 规模化和产业化 主体：农户企业 方式：作坊式机械化和自动化 生产 返回本 节 4 4）向增值化发展）向增值化发展 食品 饮料 药品 滋补品 化妆品 以原料形式进入市场效益低 加工技术层次越高，升值倍数越大 食食 用用 菌菌 加 工 返回本 节 观赏性强 盆 景 观光农业 返回本 节 返回本 节 五、单细胞蛋白 单细胞蛋白（SCP）是通过培养单细胞生物而获得 的菌体蛋白质。 用于生产单细胞蛋白的单细胞生物包括微型藻类、 非病原细菌、酵母菌类和真菌等。 它们可利用各种基质在适宜的培养条件下生产单细 胞蛋白。菌体中蛋白质含量随所用菌种及基质而异，一 般含量达4080。与传统食品营养成分比较，蛋白 质含量高，氨基酸组成较为齐全，含有人体必需8种氨 基酸，尤其是谷物中含量较少的赖氨酸。 还含有多种维生素、碳水化合物、脂类、矿物质， 以及丰富的酶类和生物活性物质。单细胞蛋白的开发与 生产为解决人类食品和饲料问题开辟了新的途径。 单细胞蛋白与传统食品的 各种主要营养成分含量比较 生产SCP的菌种基本要求 （1）对基质的菌体产率高，生长速度快 （2）菌体细胞以大的为好，并含有较多的蛋 白质 （3）培养的最适温度较高，其生长pH以偏酸 为佳。 （4）能耐浓度高的基质。 （5）食用菌种应无毒性，在培养期间，不使 基质产生有害物质。 作为蛋白质资源的微生物 （1）利用糖类原料发酵生产单细胞蛋白。如 酿酒酵母、假丝酵母、木霉、青霉等。 （2）利用石油原料生产单细胞蛋白。如酵母 菌，细菌中的诺卡氏菌、假单胞菌、棒状杆菌等。 尽管已经证明烃类蛋白质没有毒性和致癌性，但人 们还是担心其安全性。 （3）利用甲烷为原料生产单细胞蛋白。以细 菌为主，如甲烷假单胞菌、嗜甲烷单胞菌等。 甲烷不合芳香烃，无致癌物质，无毒害，产品 安全性高，原料蕴藏丰富，成本低。但产生菌大多 都生长较慢，菌体浓度低，所以生产速率低，尾气 中残留甲烷的利用尚未完全解决。 （4）利用甲醇生产单细胞蛋白。甲烷单胞菌 属、甲基球菌属，假单胞菌。 （5）利用乙醇原料生产单细胞蛋白。假丝酵 母、细菌、曲霉属。 （6）利用二氧化碳为碳源，氢为能源的细菌 为氢细菌，多为氢单胞菌属。 （7）利用太阳光能生产单细胞蛋白。单细胞 藻类，如小球藻、螺旋藻属及光合细菌等。 世界上利用石油资源生产单细胞蛋白的企业 国内外以农业废物和食品工业废物为原 料研制单细胞蛋白的主要情况 用糖类原料生产菌体蛋白 生产单细胞蛋白的糖类原料非常丰富，如糖蜜 ，甘薯粉、玉米粉、土豆粉、麦粉、稻草、麦秆、 玉米茎和叶。 其中纤维素类是生产单细胞蛋白的最佳原料之 一。 其优点是：原料来源丰富，价廉，没有毒性疑 虑，可附带解决城市垃圾问题，可提高纤维质粗饲 料的使用价值。 天然纤维素的聚合度、结晶度很高。由-1,4- 糖苷键连接的D-葡萄糖残基组成的高分子聚合物的 聚合度从几百到一万五千。 据X衍射测定，多种植物纤维素的相对结晶度 在3040之间，而棉花纤维高达7080，且植物纤维 被木质素包蔽着，是一种具有高度抵抗生物降解的 高分子聚合物。 因此，纤维素在用作碳源前必须进行预处理， 这也是该原料的不足之处，因而也促使人们加以研 究改进处理技术，以适用廉价生产的要求。 利用纤维素原料生产SCP工艺流程 第二节 微生物酶 一 概述 19世纪后建立酶的概念.但酶的催化作用却很 早为人们的生活所利用.如4000多年前酿酒和制酱 。 酶商品化生产在1897年后，最初开始由动植 物提取；之后由霉菌开始生产淀粉酶；二次世界大 战后，用微生物获得商品化酶制剂形成规模性的产 业化生产。 20世纪90年代后，基因工程发酵工艺先 进发酵设备是酶工业的第三个飞跃。这个飞跃使微 生物酶制剂地位进一步加强。 二微生物酶的开发 1微生物酶开发的一般程序 1）样品采集与菌种分离； 2）菌种筛选； 菌种复壮； 3）最佳产酶条件初步确定；产酶性能进一步 提高 4）微生物酶提取方法 5）菌种保藏 2.初筛与复筛方法 初筛：1) 用简单的定性反应（包括颜色反应、有无水解 圈、有 无特殊气体生成等）， 2) 在最初分离时就给予特殊的培养基或培养条件 。 但初筛往往和分离同步： 如脂肪酶产生菌初筛培养基： 橄榄 油2，硫酸胺等无机盐，去 氧胆酸 盐，脂肪酶菌种生长后，菌落 周围 出现清晰水解圈。 复筛：在初筛基础上筛选产酶量高、性能更符合生产的菌 种。 复筛时测定方法极为重要，摇瓶发酵测定酶活力， 一般用 真正的底物。 复筛获得的菌株要求：不是致病菌； 不易变异和退化 ；不 易感染噬菌体； 微生物产酶量高 ，生 长繁殖快；营养要求低；酶便于 分离和 提纯，得率高。 3.微生物产酶性能的进一步提高 获得高产菌种的突变体 物理和化学诱变 利用代谢调节机理获得突变株 利用代谢调节机理来提高微生物的酶产量 运用遗传、基因工程的手段将原有菌株中的目的 酶基因转移到另外一些对生产环境具有适应性的微生 物细胞之内使其高表达 使酶基因在另一微生物上得到 表达， 大幅度提高酶基因在细胞内的量。 4 微生物酶的提取方法 酶的粗提 胞内酶的提取：收集菌体 破碎细胞 收集提 取 液（发酵液） 酶的沉淀分离（盐析、有机溶剂沉淀 等） 胞外酶的提取：培养菌体 收集发酵液 酶的精制 三 微生物酶的应用 蛋白酶：最重要的工业酶，约占市场40.1979年起都在 寻找高温及高碱性的蛋白分解酶，还有糖尿病人需要有甜度的 非糖类化合物，如蛋白肽等。 芳基乙醚酶：木质素是纤维素发酵后的主要副产品。全世 界陆生生物量中木质纤维素占了95，其中木质素占了1/4左右 。现有欧文氏菌编码的芳基乙醚酶基因克隆在大肠杆菌体内， 用于降解木质素生产燃料、能源、药品等。 纤维素酶：纤维素占地球动植物总量的一半，是数量最大 的可再生资源。自然下微生物降解纤维素极为缓慢，现已获得 一些菌转化纤维素进行资源再利用。 脂肪酶 青霉素酰化酶 半乳糖苷酶 特殊治疗用酶（透明质酸酶、血纤维蛋白溶酶、L天冬 氨酸、右旋糖酐酶） 四 极端环境微生物酶的开发 极端微生物酶的来源 嗜冷微生物（15以下） 嗜盐微生物（高盐环境） 嗜热微生物（50113甚至更高） 极端环境微生物酶的获得 酶的产生： 在极端环境微生物中找到的酶基因，以大肠杆菌为宿 主，进行异源基因表达; 还有酶的纯化和酶性能的改善. 第三节微生物风味物质 香精油、含油树脂、蛋白质水解物、蒸馏物、 香料、香草、氨基酸、酶水解产品、烘焙产品 目前风味物质大多是通过化学合成或萃取的方 法生产,植物是香精油和风味物质的主要来源。 生产的法规:GRAS,美国食品医药管理局对微 生物或酶生产的风味物质展开调查，将其列入 GRAS级，这些化合物不被认为是添加剂。（ generally regarded as safe