现代外科生物技术研究生课件.ppt

现代生物技术在外科中的应用现代生物技术在外科中的应用 陈汝福 中山大学附属第二医院肝胆外科 华南肝胆医院 肝胆一科 现代生物技术 纳米技术 干细胞技术 RNA干扰技术 细胞分子生物学技术 基因芯片技术 分子免疫学技术 分子病理学技术 第一部分 纳米技术在肿瘤诊断与治疗 中的应用 Thesis 前 言 v纳米是一种长度单位,1纳米(nanometer,nm) 等于10亿分之一米长度。 v纳米材料均具有3个共同的结构特点:(1)结构 单元的尺度为纳米数量级;(2)存在大量的界 面或自由表面;(3)各纳米单元之间存在或强 或弱的相互作用。 v由于它的结构特殊性和独特效应,它比传统概 念的微米材料表现出更多优异的性能和全新 功能。 v纳米技术是我们操纵微观世界要使用的技术, 是指在纳米尺度下对物质进行制备、研究和 工业化,以及利用纳米尺度物质进行交叉研究 和工业化的一门综合性的技术体系。 v纳米技术其实就是一种用单个原子、分子进 行排列组合,对之进行操作而制造物质的技术 。 v纳米生物技术是目前国际生物技术领域最前 沿的研究课题。 v应用纳米技术进行恶性肿瘤早期诊断与治疗 的探索研究在世界范围内已全面展开，期望 在1520年内能利用基因治疗方法杀死一部 分恶性肿瘤细胞。 v目前纳米药物及基因载体临床前研究已 取得重要进展。 v应用于恶性肿瘤早期诊断和安全有效的 靶向性治疗在将来有可能成为一种继手 术、化疗和放疗治疗后更有效的治疗方 法一。 一、利用纳米生物技术早 期诊断肿瘤 纳米生物传感器 纳米载体与能够识别肿瘤细胞表面受体的特 异性配位体组装而成。 利用物理方法如测试传感器中的磁讯号、光 讯号等，可以发现早期恶性肿瘤并准确定位 ，将纳米生物传感器与生化检测技术相结合, 能够对体内是否存在恶性肿瘤进行早期诊断 。 1.光学相干层析术(OGT) 被科学家誉为“分子雷达”的OGT，精密度比 CT和MRI高出上千倍,能以每秒2000次完成生物 体内活细胞的动态成像，观察活细胞的动态， 发现单个细胞病变，且不会像X线、CT、MRT那 样杀死活细胞。 人们或许能把疾病“扼杀在萌芽状态”,而不 必等到疾病发生以后才检查出癌组织病变。 2.激光单原子分子探测术 它可在含有1019个原子或分子的1cm3气 态物质中，在单个原子分子层次上准确 获取其中1个，因此它具有极高超的灵敏 性。科学家们希望通过它检测肿瘤病人 的唾液、血液、粪便和呼出气，及时发 现人体中只有亿万分之一的肿瘤或带瘤 游离分子。 3. 纳米探针 将它植入并定位于体内不同的部位或随 血液在体内运行，可将体内的各种生物 信息反馈于体外记录装置而达到不同的 肿瘤诊断和检测目的。 4 纳米生物细胞分离技术 将纳米微粒用于细胞分离技术,可早期发 现血液中的癌细胞和将骨髓中的癌细胞 分离出来,其分离度达99.9%以上。 5.纳米细胞检疫器 最近发明的世界上最小的纳米细胞检疫 器，即纳米秤，它能秤量10-9的物体 ，即相当于1个病毒的重量。利用它可发 现新病毒,也可定点用于口腔、咽喉、食 管、气管等开放部位的肿瘤早期诊断。 二、利用纳米技术进行 肿瘤治疗 Preface 1 纳米载药微粒 癌症治疗中药物治疗的一个关键是如何 把药物定向输送到癌细胞而又不损伤正 常细胞。 解决这一问题最有前途的方法之一，就 是使用各种类型的微载体把药物定点送 到病变组织靶区。 n由于纳米控释系统特有的性质,使其在药 物输送方面具有许多优越性。 n纳米粒子缓释抗肿瘤药物延长了药物在 肿瘤内的存留时间，减慢了肿瘤的生长 ，与游离药物相比延长了患肿瘤动物的 存活时间。 n增加纳米载药微粒的靶向性的研究主要 集中在物理化学导向和生物导向。 n物理化学导向是利用药物载体的磁性特 点,在外加磁场的作用下,磁性纳米载体 将富集在病变部位,进行靶向给药和靶向 性基因转染,减少正常组织的药物暴露, 降低药物副作用。 n生物导向其原理是利用抗体、特定基因 片段的专一性作用，将配位子结合在载 体上，与目标表面的抗原性识别器发生 特异性结合，使药物或基因能准确地作 用于目的细胞。 2 纳米基因载体 n恶性肿瘤的基因治疗是近年来的研究热 点，但基因治疗的临床疗效并不理想， 其主要原因缺乏靶向性强，转染效率高 的基因载体。 n纳米微球是高分子材料、纳米技术与药 剂学相互结合的产物，它是一种新型的 药物缓释系统。 n由于它有很小的尺寸和很大的表面积/体 积比，因此具有缓释药物、靶向输送、 保护核苷酸、毒性小以及能反复给药等 独特性能，这为有效地提高基因转移效 率提供了较为理想的基因转移载体。 n纳米载体具有结合、浓缩DNA及RNA和将 它们高效导入各种细胞的能力, 其表面 正电荷与核苷酸带负电的磷酸根发生静 电作用,形成纳米载体与质粒DNA的复合 物。 n通过其表面阳离子与细胞膜上带有负电 荷的糖蛋白及磷脂相互作用而进入细胞 质,阳离子数与其基因转移率呈正相关。 nJames等研制出树突状物(dendrites)的多聚体 ,将装载了DNA的树状聚合体注入组织后,其大 小正好可以细胞内吞作用的方式进入细胞,使 DNA分子释放出来,进入细胞核,实现基因的整 合。动物体内实验结果表明,树突状物可以取 代病毒成为基因治疗的安全载体,且没有毒副 作用,转染率高。 3 纳米疫苗 n纳米高分子材料可用来包被作为疫苗的 DNA、RNA或多肽，具有增强免疫效应的 作用，此种疫苗成为纳米疫苗。 n纳米材料作为疫苗的免疫佐剂，对疫苗 的辅助作用辅助作用已经在对皮下和口 服用药的研究中被证实。 nDNA、RNA疫苗是从基因治疗研究领域 发展来的一种全新疫苗，被誉为第三次 疫苗革命，成为今近年研究热点，但这 核酸疫苗不稳定，易于被核酸酶降解。 n纳米粒子可保护核苷酸，防止被核酸酶 降解，纳米包被途径有望成为临床应用 的最好选择。 4.纳米机器人 n最近科学家还发明了纳米铲子、纳米勺 子,“血管机器人”可以在人的血管里用 这些工具进行全身健康检查,杀死癌细胞 ,监视体内的病变等。 n纳米机器人还可以用来进行人体器官修 复工作,如进行基因装配工作,即从基因 中除去有害的DNA或把正常的DNA安装在 基因中,使机体正常运行,或使引起癌症 的DNA突变发生逆转而延长人的寿命。 陈汝福主持的基金： 1.国家高技术研究发展计划（863计划）：纳米生物磁靶 向药囊治疗肝胆胰恶性肿瘤的研究分课题纳米载体的研 制 。 2.广东省自然科学基金：纳米微粒载体介导HSV-TK/CD双自 杀基因靶向治疗肝癌的研究。 3.广州市科技攻关项目：抗肿瘤血管单链抗体载药纳米微 粒在胃癌治疗中的应用。 4.广东省医学科学研究基金：抗肿瘤血管单链抗体载药纳 米微粒在肝癌治疗中的应用。 Preface 我们已完成的工作 n1. 课题组成员成功掌握了制备纳米微粒的方 法，制备的硬脂酸聚乙二醇阿霉素纳米微粒 （DOX-SLNs-PEG）。 DOX-SLNs-PEG纳米粒平均 粒径1204.84mm，包封率68.6%，体外释放实 验提示，7天可释放所载60%左右的药物；体内 抑瘤实验表明：控释制剂间隔给药疗效已优于 未包载药物每日给药的疗效，量效关系明显。 n2已成功制备PBLG-PEG/质粒纳米微球 ，并作为基因治疗的载体，PBLG-PEG纳 米载体具有肿瘤被动靶向性、缓释DNA、 毒副作用小、热力学稳定、能反复使用 等优点，是较理想的基因治疗载体。 第二部分 RNA干扰技术 Thesis 前言 由双链RNA介导的,序列特异的转录后 基因沉默的过程称为RNAi,它是双链 RNA分子在RNA水平关闭相应序列基 因表达的过程,是一门新兴的基因阻 断技术。 Part I RNA干预（RNAi）是抑制基因表 达的强大武器 1998年，Andrew Fire 和 Craig Mello 首次描述了双链RNA能特异地抑制同序 列基因的表达，他们把这种现象称为 RNA干预（RNAi）。该报道发表后，曾 掀起了研究RNAi的热潮。 Part I 双链RNA在细胞内被一种称为DICER的酶切 割成很多短的（2123碱基对）双链RNA片 段，称为siRNA。siRNA与细胞内的RNA酶（ RISC）结合，并引导RISC与同序列基因的 mRNA结合并切割之，从而在转录后水平沉 默基因表达。 Part I siRNA被用作有效的基因沉默工具，短 短的两年间应用siRNA或研究其机制的 报道迅速增加至600多篇。 2000年国家和省级基金中，有关siRNA 研究大部分获得资助。 siRNA降解信使RNA（mRNA）作用机理示意图 Part I 以前较常用的抑制基因表达的另一种工 具反义寡核苷酸比较，siRNA沉默基因表 达的效应在体内或体外都要强大十倍。 Part I siRNA与反义寡核苷酸的作用机制不 同。反义寡核苷酸主要在信使RNA（ mRNA）的某个片段中阻断其与核糖体 的结合,从而影响mRNA表达，而siRNA 则通过强有效的RNA酶RISC降解mRNA。 siRNA是双链RNA，因而能耐受胞浆或 体液中RNA酶的降解，而反义寡核苷酸 则相对欠稳定，易被破坏。 原因有以下两方面 ： RNA干预的应用前景 基因治疗上的应用 抗肿瘤 抗病毒 RNAi技术在功能基因组中的应用 抗肿瘤策略 RNAi具有特异、高效的特点,因此可用 于一些肿瘤的治疗 。 RNAi技术现象是一个令人激动的事情, 在未来的35年内可将RNAi用于宫颈 癌病人的临床治疗试验 。 Part I RNAi技术也可应用于与HBV感染相关的肝细胞 性肝癌的基因治疗。 应用RNAi技术抑制肿瘤细胞中血管生长因子 或其受体的表达,以及抑制肿瘤细胞中如癌基 因bcl-2、p53等突变基因及其蛋白的表达而 不影响非突变基因的表达,可达到很好的抗肿 瘤生长及抗肿瘤转移的目的。 Part I 抗病毒 我国是乙型肝炎的大国,有学者认为, RNAi技术用于乙型肝炎的治疗,有望 成为乙型肝炎治疗的革命性的新方法 ,将具有巨大的社会价值。 Part II iRNA具有高度专一性,会与小老鼠体内 的丙型肝炎病毒的RNA相结合,使RNA 分解并失去转译蛋白质的功能。 斯坦福医学院运用此技术来治疗丙型肝 炎的研究,已从体外试管实验阶段推进至 体内的动物实验。且在小老鼠身上,看到 丙型肝炎病毒被阻断的明显效果。 技术在功能基因组中的应用 在功能基因组研究中,需要对特定基因进行功能 丧失或降低突变,以确定其功能。 由于具有高度的序列专一性,可以特异 地使特定基因沉默,获得功能丧失或降低突变, 因此可以作为一种强有力的研究工具, 用于功能基因组的研究。 Part II 不久的将来RNAi作为一种快速的关闭基 因的途径,将会是人类基因组功能研究 的得力工具。 RNAi正在功能基因组学领域掀起一场真 正的革命,并将彻底改变这个领域的研 究步伐。为此被Science评为2002年最 重要的成果之一 RNAi作为一种新的基因阻断技术,可以简 单、有效、特异地下调细胞中基因的表 达,它不但将是研究基因功能的一种有力 工具,而且为特异性基因治疗提供了新的 技术手段。 这使得RNAi在科研、治疗乃至商业上有 着巨大的前景 。 干细胞研究在医学中 的应用与前景 第三部分 前言 Part II 21世纪是生命科学发展最为迅猛的 时代,而干细胞的研究又是生命科学领 域中最热门和最前沿的课题。 干细胞是一种早期未分化细胞,具有 自我更新、高度增殖和多向分化潜能 的一类细胞,它所产生的子代细胞具有 相同的基因型和表现型。 干细胞被分为两类 全能干细胞 或称胚胎干细胞 成体干细胞 早期胚胎干细胞,它来自于受精卵发育形 成的早期囊胚,它的分化能力最大,可以 不断自我更新并分化为任何类型组织细 胞; 成体干细胞,它和胚胎干细胞不同,缺乏 全能分化的能力,而只能定向分化为一类 或某个特定的组织细胞,如骨髓中的造血 干细胞就属于成体干细胞。 胚胎干细胞较成体干细胞具有更大的分化 潜能,因此,其应用价值更大。 可利用胚胎干细胞高度增殖和多向分化的 能力,在体外进行扩增、定向诱导分化、功 能激活与调控,用于组织移植、细胞替代及 基因治疗。 胚胎干细胞的来源 胚胎干细胞是人胚胎发育早期囊 胚(受精后约57)中未分化的细胞。 囊胚含有约140个细胞,外表是一层扁平 细胞,称滋养层,可发育成胚胎的支持组 织如胎盘等,中心的腔称囊胚腔,腔内一 侧的细胞群,称内细胞群,这些未分化的 细胞可进一步分裂、分化,发育成个体。 胚胎干细胞的应用 基因功能与胚胎发育 研究利用同源重组或基因打靶技术使 胚胎干细胞的某些基因发生突变,可以对 怀疑在胚胎发育中起作用的基因进行分 析,不仅可以了解早期胚胎发育中某些基 因的功能,而且可以利用胚胎干细胞中的 分化调节基因及表达产物研究细胞的定 向分化,分离和克隆出在胚胎发育中起重 要作用的基因 。 转基因动物制备 若将外源基因导入胚胎干细胞,确认导入 后,将胚胎干细胞与816细胞期的胚胎 共同培养或直接注入胚泡,这种细胞则可 以和受体胚胎一起发育成表达外源的嵌 合动物,并可稳定地传递给后代,从而极 大地提高基因转移效率。 将表达外源基因的胚胎干细胞的细胞核 移植到卵细胞中,然后植入母体,发育为 转基因动物,这种方法不仅是研究基因功 能、筛选良种动物的理想途径,而且可用 于大量生产基因工程药物。 移植治疗 胚胎干细胞在合适的条件下可能发育为 完整器官。 胚胎干细胞体外诱导分化技术不但为移 植提供了一种新的干细胞来源,而且有可 能在体外“工厂