感受态细胞的制备及重组质粒的转化.ppt

感受态细胞的制备及感受态细胞的制备及 重组质粒的转化重组质粒的转化 experiments of molecular biology experiments of molecular biology 重组重组DNADNA技术技术 分：分离外源基因 目的基因。 切、接：利用酶学 方法，将外源基因 与载体连接，形成 复制子。 转：转化宿主细胞 ，使复制子可以扩 增复制。 筛：筛选含有目的 基因的细胞(转化子 )并扩增以获得目的 基因克隆。 experiments of molecular biology 重组重组DNADNA技术的基本工具技术的基本工具 “分子 手术 刀” 限制性核限制性核 酸内切酶酸内切酶 “分子 运输车” “分子 缝合针” DNADNA 连接酶连接酶 “分子 运输车” 基因进入基因进入 受体细胞受体细胞 的载体的载体 experiments of molecular biology 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性 发生变化，成为能允许含有外源DNA的载体 分子通过的细胞，即感受态细胞(competent cell) 。 感受态细胞(competent cell) experiments of molecular biology 是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞 获得新的遗传性状的一种手段。 转化是微生物遗 传、分子遗传、基因 工程等研究的基本实 验技术。 转化（转化（transformationtransformation） experiments of molecular biology v 化学的方法(CaCl2法、热休克法)：使用化学试 剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热休克 处理将载体DNA分子导入受体细胞。 v 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受 态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子 导入受体细胞。 转化的方法转化的方法 experiments of molecular biology 转化原理（转化原理（CaClCaCl 2 2 法法 ） v将处于对数生长期的细菌置入0的CaCl2低渗溶液中，使 细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位 于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域； v此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗DNase的羟基 -磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上； v经短暂的42热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发 生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA 分子便趁机进入细胞内。 experiments of molecular biology v转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷 的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 。 vCaCl2法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便 易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求 。 v制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积 15-30的无菌甘油于-70保存(半年)。 experiments of molecular biology 影响转化效率的因素影响转化效率的因素 影响 因素 细胞生长状态和密度 杂菌和其它外源 DNA 的污染 载体DNA及重组DNA 受体细胞 试剂的纯度和 器皿的洁净度 转化操作 experiments of molecular biology 实验原理 v 本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，并用CaCl2处理使其处 于感受态，然后与pMD19-T-X重组质粒共保温，实现转化。由 于重组质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来 筛选转化子。 v 如受体细胞没有转入pMD19-T-X重组质粒，则在含Amp的培养 基上不能生长。 v 能在含Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）已导入了重组质 粒。 experiments of molecular biology 抗抗AmpAmp 宿主细菌宿主细菌 含含AmpAmp培养基培养基 experiments of molecular biology 实验仪器、材料 1 超净工作台 2 高速离心机 3 恒温摇床 4 恒温培养箱 5 恒温水浴锅 6 制冰机 7 移液枪 experiments of molecular biology 实验实验材料材料、试剂、试剂 1大肠杆菌JM109菌株 2重组质粒 31.5mL 离心管，Tip头 4试管、培养皿 1 LB液体培养基 2含有Amp的LB平板培养基（终浓度为50gmL） 3氨苄青霉素贮存液（浓度50mgmL） 40.1mol/L CaCl2溶液 experiments of molecular biology 实实 验验 安安 排排 1 受体菌的培养 感受态细胞的制备 2 3质粒向感受态大肠杆 菌细胞的转化 实验 安排 experiments of molecular biology 一、受体一、受体菌的培养菌的培养 1.从新活化的E.coli JM109平板上挑取一单菌落，接种于 3ml LB液体培养中，37振荡培养12h左右，直至对数生 长期。（已做） 2.将该菌悬液以1:50转接于50ml LB液体培养基中，37 250rpm振荡扩大培养约1-2h，当OD600nm值为0.3 0.5时，取出置冰浴。 experiments of molecular biology 1、取1mL菌液于1只1.5mL离心管中，置冰浴5min，10000rpm离 心 1min （每班需做对照管至少1管）（从这一步开始，所有操作 均在冰上进行，速度尽量快而稳） ； 2、弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸上，每管加入0.5mL冰预 冷 的0.1mol/L CaCl2悬浮细菌，置冰浴10min； 3、4000rpm离心10min，弃上清； 4、每管加入50L冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细菌，冰上放置， 即为感受态细胞。 二、感受态细胞的制备二、感受态细胞的制备 experiments of molecular biology 1、实验管加5L重组质粒DNA，对照管加5L灭菌水，轻轻 混匀，置冰浴20min； 2、42水浴热应激90s（精确计时），迅速放回冰浴，冷却 5min后加入1mL LB液体培养基（不含Amp），37 250rpm振荡培养约1h； 3、取50L菌液均匀涂布在LB琼脂平板上（含50g/mL Amp， 事先做好），37培养过夜（12-16h）后观察结果。 三、三、质粒向感受态大肠杆菌细胞的转化质粒向感受态大肠杆菌细胞的转化 切记：玻璃棒经 酒精灯烧过后稍 微凉一下再用， 不要过烫！ experiments of molecular biology 对照组：对照组： 以同体积的灭菌双蒸水代替重组质粒，其它操 作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素（Amp ）的LB琼脂平板上应没有菌落出现。 本次实验组预期结果：本次实验组预期结果： experiments of molecular biology v 感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响到其转 化率，因此应尽量减少常温操作，动作要迅速（所有 操作均应在冰上进行）。 v 为减少对细胞的机械损伤，操作时动作一定要轻柔。 v 菌液涂布操作时应避免反