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山东农业大学 硕士学位论文 杨树内生细菌的分离、多样性分析及解淀粉芽孢杆菌peba20的 抑菌活性研究 姓名：胥丽娜 申请学位级别：硕士 专业：森林保护 指导教师：刘振宇 20090612 山东农业大学硕，j 二学位论文 中文摘要 杨树水泡型溃疡病是由葡萄座腔菌( b o t r y o s p h a e r i ad o t h i d e a ) 侵染引 起的重大枝干病害，该病普遍发生，危害严重，防治困难，严重影响着杨 树的经济效益及生态效益。因而，寻求对杨树病害合理有效的防治措施已 势在必行。生物防治具有安全而又环境友好的特点，越来越受到人们的关 注，并展现出重大的发展潜力。 有关杨树水泡溃疡病的生物防治研究，国内外报道较少。作为一类新 型的生防因子，植物内生细菌是定植在健康植物的各种组织和器官中，与 植物之间形成互惠共存、相互制约的一类微生物。从杨树体内分离筛选有 益细菌并应用于杨树病害的生物防治实践中将具有重要的现实意义。 本研究旨在从杨树体中分离内生细菌并对其进行多样性分析；筛选出 具有较高拮抗活性的内生细菌；并对内生细菌p e b a 2 0 进行系统的分类学 鉴定，测定了该内生细菌的发酵条件及抑菌活性；而对其代谢产物一蛋白 质进行初步纯化。主要研究结果如下： 1 于2 0 0 7 - - 一2 0 0 8 年，3 、6 、9 、1 2 月4 个月份，从泰安市城区选取 多年生的三倍体毛白杨枝干共分离到1 2 6 株内生细菌，并进行室内平板拮 抗筛选测定，获得1 2 株内生细菌对杨树水泡溃疡病病菌有较好的拮抗活 性。通过4 个月份的分离细菌，发现杨树体内含有大量的内生细菌，多样 性较丰富。采用s h a n n o n w i e n e r 分析其多样性，多样性指数( h ) 、丰度 ( d ) 、均匀度( j ) ，发现在不同分离时间的杨树枝条中内生细菌的种类、 数量和多样性指数明显不同。 。 2 通过培养性状、染色反应、生理生化特征分析和1 6 s r d n a 序列分 析等方法对p e b a 2 0 进行鉴定。结果表明，该菌为解淀粉芽孢杆菌( b a c i l l u s a m y l o l i q u e f a c i e n s ) 。对峙培养发现p e b a 2 0 对杨树水泡溃疡病病菌产生较 宽的抑菌圈，表现较好的抑菌作用。抑菌谱测定结果表明，p e b a 2 0 菌具 有广谱抑菌活性，对杨腐烂病菌、茄子绵疫病菌、杨树炭疽病菌、合欢枯 萎病菌等1 2 种病原真菌均有较好的抑制作用。p e b a 2 0 菌株的活体和发酵 滤液均表现广泛的拮抗谱，对杨树腐烂病菌抑菌效果最好，抑制率分别为： 8 9 3 7 、8 2 6 2 ；对杨树水泡溃疡该菌也有较好抑菌作用，抑制率分别 为：6 9 9 5 、6 3 2 。这说明p e b a 2 0 对杨树病害的防治有较好的效果。 杨树内生细菌的分离、多样性分析及解淀粉芽孢杆菌p e b a 2 0 的抑菌活性研究 该菌株也表现出良好的抗细菌活性，对核桃黑斑病菌、烟草青枯病菌、马 铃薯环腐病菌、巨大芽孢杆菌等细菌的抑菌圈均在1 2 m m 以上。 3 本研究初步探讨了不同培养条件下的发酵液对杨树水泡溃疡病菌 的抑菌活性测定。测定不同培养条件的发酵液对杨树水泡溃疡病菌的抑菌 效果，得出在n b 培养基，培养1 2 0h 的p e b a 2 0 菌的发酵液，对杨树水 泡溃疡病菌的抑菌效果最佳。通过二次正交设计优化发酵条件，计算得到 该菌最适宜发酵条件为：t = 2 8 5 ，r p m = 1 4 0 r p m ，p h = 5 ，通气量1 0 0 m l ， t = 1 2 0 h 。 4 p e b a 2 0 菌发酵培养后能够产生抗菌蛋白，不同培养条件下的蛋白 粗提液对杨树水泡溃疡病病菌有着较好的拮抗效果。p e b a 2 0 菌发酵液的 蛋白组分和0 - 6 0 饱和度的硫酸铵盐析粗蛋白，经c m s e p h a r o s ef a s t f l o w 阳离子交换柱层析，发现p e b a 2 0 菌发酵后的蛋白质中含有阳离子蛋白 质，并能通过c m s e p h a r o s ef a s tf l o w 获得初步分离；经d e a e s e p h a r o s e f a s tf l o w 阴离子交换柱层析，形成明显的蛋白质吸收峰，各峰相对独立， 峰形较尖锐，且没有拖尾。p e b a 2 0 菌的初步分离。为进一步分离纯化奠 定基础。 关键词：杨树水泡溃疡病；内生细菌；分离；解淀粉芽孢杆菌；抑菌活性 2 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r ac t p o p l a r c a n k e rc a u s e d b yb o t r y o s p h a e r i ad o t h i d e a ，w a s ak e ys t e m d i s e a s ew h i c ho c c u r r e dw i d e s p r e a d l ya n dw a sd i f f i c u l tt oc o n t r 0 1 b i o l o g i c a l c o n t r o lw a sa ne n v i r o r m e n tf r i e n d l ym e t h o df o rt h ed i s e a s em a n a g e m e n tw i t h g r e a tp o t e n t i a ld e v e l o p m e n t t h e r ew a sl i t t l er e p o r t sa b o u tb i o l o g i c a lc o n t r o l o fb o t r y o s p h a e r i ad o t h i d e a a san e wt y p eo fb i o c o n t r o lf a c t o r s ，p l a n t s e n d o p h y t i cb a c t e r i aw e r eac l a s s o fm i c r o o r g a n i s m sw h i c hc o l o n i e di na v a r i e t yo ft i s s u e so fh e a l t h yp l a n t sw i t hm u t u a l l yb e n e f i c i a l c o e x i s t e n c e b e t w e e np l a n t s t h e r ew a ss i g n i f i c a n c eo fc o n t r o l l i n gt h ed i s e a s e so fp o p l a r s w i 也e n d o p h y t i cb a c t e r i ai s o l a t e df r o mt h ep o p l a rb o d y i nt h i ss t u d y ，w ei s o l a t e de n d o p h y t i cb a c t e r i af r o mt h ep o p l a rt r e e sa n d a n a l y s e dt h eb a c t e r i ad i v e r s i t y ，s e l e c t e dt h ee n d o p h y t i cb a c t e r i aw i t hh i g h a n t a g o n i s t i ca c t i v i t y ，i d e n t i f i c a t e dt h ee n d o p h y t i cb a c t e r i as t r a i no fp e b a 2 0 w i t hs y s t e m a t i ct a x o n o m yi d e n t i f i c a t i o n ，d e t e r m i n e di t so p t i m i z a t i o no f f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa n da n t i b a c t e r i a la c t i v i t y ，p r e l i m a r yp u r i f i e dt h e p r o t e i n s t h em a i nf i n d i n g ss h o w e da sf o l l o w s ： 1 。12 6e n d o p h y t i cb a c t e r i aw e r ei s o l a t e df r o mb r a n c h e so ft r i p l o i d p o p u l u sf r o mt a i - a nc i t yi nm a r c h ，j u n e ，s e p t e m b e ra n dd e c e m b e r ，2 0 0 7t o 2 0 0 8 w es e l e c t e d12p o p l a re n d o p h y t i cb a c t e r i as h o w e dg o o da n t a g o n i s t a c t i v i t yt ob o t r y o s p h a e r i ad o t h i d e aw i t hf l a ta n t a g o n i s ts c r e e n i n gm e t h o d w e f o u n dal o to fp o p l a re n d o p h y t i cb a c t e r i ai np o p l a r sf r o mt h e s es e p a r a t e d b a c t e r i a u s i n gs h a n n o n - w i e n e ra n a l y s i sw i t hd i v e r s i t yi n d e x ( h ) ，a b u n d a n c e ( d ) ，e v e n n e s s ( j ) ，t h ee n d o p h y t i cb a c t e r i af r o mp o p l a ri n d i f f e r e n tt i m e s h o w e ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c e 2 w ei d e n t i f i c a t e dp e b a 2 0a sb a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i e n st h r o u g h c u l t i v a t i o n ，s t a i n i n gr e a c t i o n ，p h y s i o l o g i c a l o rb i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c a n a l y s i s a n d16 s r d n a s e q u e n c ea n a l y s i s p e b a 2 0 s h o w e d g o o d a n t i m i c r o b i a le f f e c to nb o t r y o s p h a e r i ad o t h i d e a t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e a n t i b a c t e r i a ls p e c t r u mo fp e b a 2 0w a sb r o a d ，t h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yw e r e h i g ha g a i n s tv a l s as o r d i d a 、p h y t o p h t h o r ac a p s i c i l e o n 、g l o m e r e l l ac i n g u l a t a 、 杨树内生细菌的分离、多样性分析及解淀粉芽孢杆菌p e b a 2 0 的抑菌活性研究 f u s a r i u mo x y s p o r u ma n do t h e r12k i n d so fp a t h o g e n i cf u n g i ，t h ei n h i b i t o r y r a t eo ft h eb a c t e r i aa n df e r m e n t a t i o nf i l t r a t e a g a i n s t v a l s as o r d i d a lw a s 7 9 5 3 a n d 6 7 3 2 r e s p e c t i v e l y , w h i l e t h e i n h i b i t o r y r a t e a g a i n s t b o t r y o s p h a e r i ad o t h i d e aw a s5 3 2 7 a n d4 0 4 8 r e s p e c t i v e l y t m si n d i c a t e d t h a tp e b a 2 0h a sg o o de f f e c tt oc o n t r o lt h ed i s e a s eo fp o p l a rt r e e s p e b a 2 0 a l s os h o w e dg o o da n t i b a t e r i a a c t i v i t ya g a i n s tx a n t h o m o n a sj u g a n d i s 、 r a l s t o n i as o l a n a c e a r u m 、c l a v i b a c t e rs e p e d o n i c u m ，b a c i l l u sm e g a t e r i u m ，t h e i n h i b i t i o nz o n e st ob a c t e r i aw e r em o r et h a n12 m m 3 。a n t i f u n g a la c t i v i t i v e so fd i f f e r e n tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fp e b a 2 0 w e r ed e t e r m i n e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tc u l t u r i n gf o r12 0 ha n dc u l t u r e di n n bm e d i u mw e r et h ef a v o r a b l ec o n d i t i o n sf o rt h ea n t i b i o t i ca c t i v i t y w e c a l c u l a t e dt h em o s ts u i t a b l ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rp e b a 2 0w e r et = 2 8 5 ，r p m = 1 4 0 r p m ，p h = 5 ，v e n t i l a t i o nv o l u m el o o m l ，t = 1 2 0 h 4 c r u d ep r o t e i no fp e b a 2 0u n d e rd i f f e r e n tc u l t u r ec o n d i t i o n sh a db e t t e r e f f e c t st ob o t r y o s p h a e r i ad o t h i d e a ，i n d i c a t i n gt h ee x i s t e n c eo ft ha n t i b i o t i c p r o t e i n s t h ec o l u m nc h r o m a t o g r a p h yw i t hc m s e p h a r o s ef a s tf l o wa n d d e a e s e p h a r o s ef a s tf l o wd e m o n s t r e a t e dt h a tt h ep r o t e i nw i t ha n t i b i o t i c a c t i v i t yc o u l db ep u r i f i e d k e yw o r d s ：b o t r y o s p h a e r i ad o t h i d e a ；e n d o p h y t i cb a c t e r i a ；s e p a r a t i o n ； b a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i e n s ；i n h i b i t o r ya c t i v i t y 4 山东农业大学硕士学位论文 英文缩略词及中文对照表 5 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所 取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个 人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同 意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术 信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并向 社会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：蚤函缬 导师签名：越 杨树内生细菌的分离、多样性分析及解淀粉芽孢杆菌p e b a 2 0 的抑菌活性研究 第一章文献综述 1 引言 杨树水泡型溃疡病( b o t r y o s p h a e r i ad o t h i d e a ) ，是我国北方杨树上发生 最普遍、危害最严重的枝干部病害。当前该病的控制主要依靠化学防治方 法，但是随着人们环保意识增强，生物防治技术逐渐被人们所重视。近年 来，人们对植物内生细菌的有益功能及其在农业生产上的应用潜力产生了 浓厚的兴趣，植物内生细菌的研究已经成为植物微生物学科基础及应用基 础研究的挑战性领域。 1 1 植物内生细菌的概况 1 1 1 植物内生细菌的概念与研究现状 内生体( e n d o p h y t e ) 来源于希腊语“在内“ ( e n d o ) 禾i 植物( p h y t o n ) 。 由于各研究者的观点不同，关于内生菌的定义，至今尚无定论。1 8 6 6 年 d eb a r y 为将生活在植物组织内的微生物与那些生长在植物表面的表生菌 ( e p i p h y t e ) 相区别，首先提出了内生菌( e n d o p h y t e ) 的概念( 郭良栋等， 2 0 0 1 ) 。c a r r o l l ( 1 9 8 6 ) 将内生菌定义为生活在地上部分、活的植物组织 内不引起明显病害症状的微生物( 真菌) 。直到1 9 9 2 年k l o e p p e r ( k l e o p p e r jw 等，1 9 9 2 ) 第一次提出了“植物内生细菌“ ( e n d o p h y t i cb a c t e r i a ) 的 概念。p e t r i n i ( 1 9 9 1 ) 和w i l o n ( 1 9 9 5 ) 将内生菌的定义扩展为，一生或 至少一生中的某个阶段能进入活体植物组织内，并在植物组织内不引起明 显组织变化的真菌或细菌。1 9 9 7 年h a l l m a n n ( h a l l m a n nj 等，1 9 9 7 ) 等 又对植物内生细菌的概念进行了补充，认为植物内生细菌是从表面消毒的 植物组织中分离而得到或从植物内部获得的，但它们的存在并未使植物的 表型特征和功能有任何改变。综上所述，普遍认为植物内生细菌应具有如 下特点：( 1 ) 能在活体植物体内定殖；( 2 ) 不引起寄主植物组织结构发生 明显变化；( 3 ) 在正常情况下，植物内生细菌一般不引起寄主植物出现病 害症状。 自1 8 7 6 年p a s t e u r 从无菌葡萄果汁中提取出了内生细菌引起人们关注 以来，国内外学者在植物内生细菌的研究方面取得了丰硕成果。国外， h e n n i n g 和v i i i f o r t h ( 1 9 4 0 ) 在2 8 种不同的健康植物根、茎、叶中发现了 6 山东农业大学硕士学位论文 细菌。h o l l i s ( h o l l i sjp 等，1 9 5 1 ) 和t e r v e t ( t i e ntm 等，1 9 7 9 ) 从马 铃薯、胡萝b 、萝b 、红甜菜、甘薯、番茄和球茎甘蓝贮藏器官等内分离 获得细菌，首次用热处理和纯培养的方法证明植物体内生细菌是一个混杂 的细菌群，并进行了初步分类鉴定。国内对于植物内生细菌的研究起步较 晚，直到2 0 世纪7 0 年代才开始陆续报道有关内生细菌的研究情况，相继 在棉花、水稻、番茄、辣椒、花生、烟草、马铃薯、黄瓜等作物中发现内 生细菌并做了相关研究( 邱晓等，1 9 9 0 ；宋子红等，1 9 9 6 ；傅正擎等，1 9 9 9 ； 易图永等，2 0 0 0 ；何红等，2 0 0 2 ；龙良鲲等，2 0 0 3 ；王万能等，2 0 0 3 ) 。 2 0 世纪8 0 年代以后，随着植物内生细菌研究的深入，人们发现几乎所有 的健康植物体内均存在有大量的内生细菌。据不完全文献统计，已从近 3 0 种植物中分离了约8 0 个属的内生细菌，其中约有2 3 为革兰氏阴性菌。 近年来，关于植物内生细菌的论著数量日趋增加，1 9 9 0 “ 2 0 0 2 年，仅英 国“国际农业与生物学中心”( c a b i ) 文摘数据库收录的，植物内生细菌 论著就有近2 0 0 0 余篇，接近从2 0 世纪初至9 0 年代有关根际微生物论著 数量的总和( 韩继刚等，2 0 0 4 ) 。目前植物内生细菌已成为当今植物学家、 植物育种学家和微生物学家等研究的热门课题。 1 1 2 内生细菌分布、多样性的研究 目前，许多报道已证明在不同的植物体内都存在大量的内生菌( 李承 森，1 9 9 9 ) 在已研究的植物微生态系统涉及的植物约有3 0 种，大部分以 农作物为研究对象，在各种植物中发现的内生细菌已超过8 0 个属( 杨海 莲等，1 9 9 8 ：冉国华等，2 0 0 4 ：l o d e w y c k xc 等，2 0 0 2 ) 。人们不仅从不 同植物上分离得到内生细菌，而且对植物分离部位的研究也趋于多样化。 多年研究表明，绝大多数植物内生细菌的种群以在根部的分布密度最高 ( q u a d t h a l l m a n n a 等，1 9 9 6 ；l a m bt g 等，1 9 9 6 ) ，可能是因为根是内 生细菌进入植物的主要位点，后转移到根部以上的组织器官。但何红等人 从辣椒叶内分离到内生细菌的数量高于从根部分离到的细菌数量( 何红 等，2 0 0 2 ) 。 1 2 植物内生细菌的生物学作用 1 2 1 生物固氮作用 人们对内生细菌的生物学作用方面最感兴趣的莫过于其固氮作用。研 杨树内生细菌的分离、多样性分析及解淀粉芽孢杆菌p e b a 2 0 的抑菌活性研究 究发现，很多植物内生细菌可以从空气中吸收氮气，并将其固定为化合态 氮，这为人们研究非豆科作物共生固氮提供了一个新的思路。固氮内生细 菌与植物之间无论在微生态学上还是在代谢上都是一种和谐联合的关系。 固氮内生细菌能利用植物产生的多余能量发挥固氮作用，但又受到植物的 这种长期共进化过程中形成的调控系统的宏观调节，植物始终处于相对较 为主动的地位。因而，有效的发挥非豆科作物内生细菌的共生固氮作用， 在一定程度上可以取代或减少化肥的使用。在巴西和菲律宾( m a l i kk a 等，1 9 8 7 ；r o g e rp a 等，1 9 9 2 ；b o d d e yr m 等，1 9 9 5 ；m a l i kk a 等，1 9 9 7 ) ，虽然连年不施氮肥，但甘蔗和水稻依然能获得较高的产量， 就是由于甘蔗和水稻体内的内生固氮细菌为其提供了氮素。这里需要强调 的是，固氮内生细菌的内共生固氮与根瘤菌的共生固氮是不同的，前者不 形成特化结构，几乎可以在宿主植物的各种营养器官内发挥固氮作用；而 后者必须在宿主植物的特定器官上形成根瘤，才能发挥固氮作用，共生体 的宿主特异性要强于前者。此外，研究证明，植物内生固氮菌与土壤固氮 菌对植物的作用不同，内生固氮菌所固定的氮可以直接为寄主植物所利 用，而土壤固氮菌固定的氮首先满足其自身生命活动的需要，只有当菌体 死亡后，其菌体对增加土壤的含氮量才有一定的效果。 1 2 2 促生作用 正如植物根际促生细菌一样，植物内生细菌也可以产生植物促生物质 如植物生长素、赤霉素以及细胞激动素等直接促进植物生长。对内生细菌 促进植物生长的作用机制研究结果表明：( 1 ) 内生细菌可以通过生物固氮 或产生植物激素直接促进植物生长( j a c o b s o nc b 等，1 9 9 4 ；a d h i l c a r it b 等，2 0 0 1 ) ；( 2 ) 诱导寄主植物产生植物激素、改善植物对矿物质的利 用率、改变寄主植物对霜冻等有害环境条件及对有害病原生物的敏感性等 间接促进植物生长( m u r t ym g 等，1 9 8 8 ；l a z a r o v i t sg 等，1 9 9 7 ；x uh 等，1 9 9 8 ) 。 1 2 3 外源基因载体 以植物内生细菌为受体构建植物内生防病或杀虫工程菌，再利用工程 菌的内生作用，将外源杀虫防病基因携入植物体内，可提高植物的抗病防 虫能力，而植物本身的基因不发生改变，这样就可以保持植物的天然性状。 山东农业大学硕士学位论文 这方面成功的例子很多。如刘云霞等( 1 9 8 7 ) 等用水稻体内优势细菌巨大 芽孢杆菌( 召，m e g a t e r i u m ) 为受体，构建了具有防水稻二化螟活性的工程 菌。由此可见，在以内生细菌为载体，构建杀虫或防病工程菌时，必须考 虑内生细菌本身对寄主植物的作用效果。若以对植物生长有促进作用的内 生细菌作为载体，构建杀虫或防病工程菌可能更有应用价值。 1 2 4 有害作用 按内生细菌对植物的作用效果，可将其分为有益、有害和中性3 类。 其中大部分对植物的作用是中性的，约5 1 0 的内生细菌对植物有益， 1 0 2 0 对植物可能有害或无益。内生细菌对寄主植物的有害作用主要 包括抑制植物生长发育、引起植物病害等。v a np e e r ( 1 9 9 0 ) 等分离测定 番茄根内的假单胞杆菌对番茄生长影响的结果表明，来自根内的1 1 2 株假 单胞杆菌中有3 0 的菌株对植株苗鲜重有影响，只有2 的菌株表现对植 株生长的促进作用。金玲等( 1 9 9 6 ) 研究结果表明，从小麦苗中分离的 8 9 株内生细菌中有6 株浸种后对小麦表现为出苗迟且不齐，生长缓慢， 植株矮化，叶尖黄化，根短分枝少甚至苗扭曲等不良影响。虽然相关研究 结果表明植物内生细菌在一定条件下对植物生长发育具有有害作用，但对 其在活体植物内产生这种作用的机理缺乏深入系统的研究。 1 2 5 生物防治作用 由于植物内生细菌可以系统地分布于植物组织内，并有足够的碳源和 氮源，而且受到植物组织的保护，比腐生细菌具有更为稳定的生存环境， 更易于发挥作用，因此对其在植物病害防治领域中的研究日益增多，尤其 是对植物土传病害的研究报道最多。现己从棉花、橡树、马铃薯、水稻、 玉米、蔬菜等多种作物体内分离筛选到对棉花枯萎病、黄萎病、棉花立枯 病、番茄黄萎病、马铃薯青枯病等病害具有良好抑制效果的内生细菌( 邱 晓等，1 9 9 0 ；夏正俊等，1 9 9 6 ；杨海莲等，2 0 0 1 ；b r o o k sd s 等，1 9 9 4 ； c h e nc 等，1 9 9 5 ；n o w a kj 等，1 9 9 8 ；s h a r m av k 等，1 9 9 8 ；s t u r z a v 等，1 9 9 9 ) 。何红等从辣椒体内分离筛选到对辣椒、白菜、香蕉等植物炭 疽病等具有生防效果的内生芽孢杆菌( 何红等，2 0 0 2 ，2 0 0 3 ：邱思鑫等， 2 0 0 4 ；) 。乔宏萍等( 2 0 0 6 ) 从小麦体内分离到对小麦全蚀病、小麦纹枯病 等具有防治效果的菌株。以上提到的都是将内生细菌应用到植物真菌病害 9 杨树内生细菌的分离、多样性分析及解淀粉芽孢杆菌p e b a 2 0 的抑菌活性研究 防治中的例子，此外，内生细菌对植物采后病害、细菌病害防治的实例也 很多。如p r o t e l l a 等( 1 9 9 3 ) 报道，从黄瓜、茄子、辣椒、番茄、桃、李 等植物中分离的1 2 2 株内生细菌中，2 0 多株对核果采后褐腐病有9 0 以 上的防治效果。v a nb u r e n 等( 1 9 9 3 ) 从马铃薯茎组织中分离到的1 9 2 株 内生细菌中，有6 l 株对马铃薯环腐病有防治效果。p o o n 等( 1 9 7 7 ) 、杨 海莲等( 2 0 0 0 ) 先后发现，水稻内生细菌对水稻白叶枯病症状有抑制作用。 近年来，也有研究认为，内生细菌对植物病毒病、线虫病有防治作用，荧 光假单孢8 9 b 一6 1 ( p s e u d o m o n a sl t u o r e s c e n s8 9 b 一6 1 ) ，泡囊假单胞菌 n 8 8 4 ( b r e v u n d i m o n a sv e s i c u l a r i sn 8 8 4 ) 和粘质沙雷氏菌9 0 4 3 ( s e r r a t i a m a r c e s c e n s9 0 4 3 ) 的代谢产物能够持续的防治南方根结线虫 ( m e l o i d o g y n ei n c o g n i t a ) 。 1 3 芽孢杆菌在生物防治中的应用 1 3 1 芽孢杆菌的控病作用机制 有关芽孢杆菌的控病作用机制，国内外学者从各个角度进行了广泛探 讨，其作用方式多种多样，概括起来主要有竞争、拮抗、诱导植物抗病性 和促进植物生长等几个方面( 程洪斌等，2 0 0 6 ) 。 ( 1 ) 竞争作用 竞争作用是生防微生物发挥作用的重要机制之一。芽孢杆菌的竞争作 用主要包括营养竞争和空间位点竞争，并以空间位点竞争占优势，即在植 物根际、体表或体内及土壤中快速、大量繁衍和定殖，有效地排斥、阻止 和干扰植物病原微生物在植物上的定殖与侵染，从而达到抑菌控病效果。 营养竞争只在少数菌株中发现，这些菌株可在营养条件好的植物伤口和温 湿度适宜、比较隐蔽的、微环境相对稳定的叶面凹陷处、绒毛基部等定殖， 表现出较强的竞争能力( 赵达等，2 0 0 7 ) 。 植物内生芽孢杆菌在植物体内具有很好的定殖和繁殖能力。b a c o n 分 离的玉米内生枯草芽抱杆菌与病原串珠镰抱菌有相同的生态位，因枯草芽 孢杆菌能在玉米体内迅速定殖和繁殖，有效降低串珠镰孢菌及毒素的积累 ( c h a r l e s w b a c o n 等，2 0 0 1 ) 。何红等研究表明，b a c i l l u ss u b t i l i sb s 2 和 b s 1 菌株可通过浸种、灌根和涂叶等接种方法进入番茄等多种非自然宿 主植物体内定殖( 何红等，2 0 0 4 ) 。 山东农业大学硕士学位论文 ( 2 ) 拮抗作用 拮抗作用主要指两种或两种以上的微生物共同生长时，一种微生物在 同化作用中产生某种或某几种特异的次生代谢产物( 如抗菌素等抗菌物 质) ，改变其微环境，从而抑制甚至杀死另一种微生物的现象。自1 9 5 2 年 j b a b a r d 等从枯草芽孢杆菌培养液中分离出抗菌肽以来( 刘颖等，1 9 9 9 ) ， 不断有新的枯草芽孢杆菌产生的拮抗物质被发现，在生防中起关键的作 用。 芽孢杆菌可产生抗生素、细菌素、细胞壁降解酶类和其它抗菌蛋白及 挥发性抗菌物质等拮抗物质。抗菌蛋白是目前研究较多的一类抗菌物质， 如丑s u b t i l i ss 0 1 1 3 的分泌蛋白对水稻白叶枯病菌表现出良好的广谱抗性 以及丰富的抗菌活性峰( 林东，2 0 0 3 ) 。 ( 3 ) 诱导抗病性 病原菌侵染后，诱导剂才表现出对寄主植物的诱导抗性现象称为诱导 系统抗性i s r ( i n d u c es y s t e m i cr e s i s t a n c e ) 或系统性获得抗性s a r ( s y s t e m i c a c q u i r e dr e s i s t a n c e ) ( h a m m e r s c h m i d ta n dk u c ，19 9 5 ) ，由根际细菌( 含内生细 菌) 诱导的抗性称为i s r 。 植物系统获得抗病性研究己涉及到植物系统获得抗病性信号传递的 机理、信使物质的种类、基因的转化、基因的表达和调控，人们在研究其 信号传递机理的同时，正致力于化学诱导剂替代杀菌剂的可能性研究。可 用作诱导剂的细菌包括死体和活体、病原细菌和非病原细菌及细菌的不同 成分，如细菌l 印基因产物可诱导非寄主植物产生过敏性，进而获得系统 抗性。内生细菌对寄主植物也能产生诱导抗性，诱导寄主产生系统抗性是 内生细菌防病的主要机制之- - ( q u a d t h a l l m a n n 等，19 9 7 b ) ，而且内生细 菌出于存在植物体内，有相对稳定的生长条件，与植物关系十分密切，与 植物根际或植物体表细菌相比，内生细菌更有利于诱导植物产生i s r ( r a m a m o o r t h y 等，2 0 0 1 ) 。芽孢杆菌就能通过对植株体内酶系统的调控来 激活植物自身的防御体系。辣椒内生枯草芽孢杆菌b s 2 可诱导寄主植物 过氧化物酶( p o d ) 、超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、苯丙氨酸 解氨酶( p a l ) 等参与的植物防御性反应，降低寄主植物体内丙二醛( m d a ) 的产生( 何红，2 0 0 3 ；邱思鑫，2 0 0 4 ) ，从而提高植物对病原菌的抗性。 杨树内生细菌的分离、多样性分析及解淀粉芽孢杆菌p e b a 2 0 的抑菌活性研究 内生细菌诱导寄主产生i s r 的机制，主要包括诱导寄主细胞物理结构 变化和生理生化反应变化两方面。其中物理结构变化主要包括诱导寄主植 物在病菌入侵的细胞前沿形成结构致密的保护层，或诱导寄主细胞壁的结 构发生改变，如细胞壁增厚形成乳突、细胞壁中木质素含量增加、细胞壁 机械强度的增强等，以限制病菌的进一步侵入扩展( b e n h a m o u 等，1 9 9 6 b ； 1 9 9 8 ；m p i g a 等，1 9 9 7 ) ；内生细菌诱导寄主植物生理生化活性变化主要 包括诱导寄主植物体内病程相关蛋白( p r ) 的积累( ( b e n h a m o u 等，1 9 9 6 b ) 植保素以及其它次生代谢物质的合成( v a np e e r 等，1 9 9 0 ) 、水解酶和氧化 酶( 如几丁质酶、b 1 ，3 葡聚糖酶、过氧化物酶等) 的产生等( b e n h a m o u 等， 1 9 9 6 b ) 以及s o d 保护酶系活力的提高。 ( 4 ) 促生作用 邱思鑫( 2 0 0 4 ) 将丑s u b t i l i sb s 2 菌株浸种处理辣椒和白菜后，植株内 源激素测定表明，菌株浸种处理后，植株体内的生长素( a a ) 、玉米素( z r 4 ) 和赤霉素( g a 3 ) 等激素的含量比清水对照高，而脱落酸( a b a ) 含量比对照 减少。蔡学清( 2 0 0 5 ) 将丑s u b t i l i sb s 2 菌株浸种处理水稻和小白菜后，可 以提高作物体内的叶绿素含量和光合作用能力，可见菌株进入植株体内 后，调节其内源激素的变化和提高植株光合作用能力可能是菌株促生作用 的主要机制之一( 刘伟，2 0 0 6 ) 。 1 3 2 芽孢杆菌作为生防因子的应用现状 ( 1 ) 国外的应用状况 美国迄今已有4 株枯草芽抱杆菌生防菌株获得环保局( e p a ) 商品化或 有限商品化生产应用许可，它们是g b 0 3 ，m b l 6 0 0 ，q s t 7 1 3 和解淀粉枯 草芽孢杆菌变种( 丑s u b t i l i sv a la m y l o l i q u e f a c i e n sf z b 2 4 ) 。o b 0 3 ( 商品名 为k o d i a k ) 和i m b l 6 0 0 ( 商品名为s u b t i l e x ) 分别由美国g u s t a f s o n 公司和 m i c r o b i ol t d 公司开发，根部施用或拌种可防治镰刀菌属( f u s a r i u m ) 、曲 霉属( a s p e r g i l l u s ) 、链格抱属( a l t e r n a r i a ) 和丝核菌属( r h i z o c t o n i a ) 弓i 起的豆 类、麦类、棉花和花生的根部病害。2 0 0 1 年g u s t a f s o n 又将解淀粉枯草芽 孢杆菌和枯草芽孢杆菌混合制成混合生防药剂，称为b i o y i e l d 。t a e n s a 公 司生产的f z b 2 4 ，作为植物促长剂被商品化生产，商品名t a e g r o t m ，施用 于温室或室内栽培树苗、灌木和装饰植物根部可防治镰刀菌和丝核菌引起 山东农业大学硕士学位论文 的根腐病和枯萎病。q s t 7 1 3 为a g r a q u e s t 公司产品，商品名s e r e n a d e ， 叶面施用能防治蔬菜、樱桃、葡萄、葫芦和胡桃的细菌和真菌病害。此外， l r c a v a g l i e r i 等从玉米根围分离获得生防菌株丑s u b t i l i sr c 8 ，r c 9 和 r c 1 1 对玉米轮状镰7 j ( f u s a r i u mv e r t i c i l l i o i d e s ) 具有强烈的抑制作用，并抑 制其伏马毒素b 1 的生产。此外，澳大利亚开发的丑s u b t i l i sa 1 3 对麦类 和胡萝卜立枯病以及其他土传病害具有很好的防治和增产作用 ( b a k e r , 1 9 8 7 ) 。日本东京技术研究所的bs u b t i l i sr b1 4 和丑s u b # l 括n b 2 2 分别对r h & o c t o n i as o l a n i ，f u s a r i u mo x y s p o r u m 和p s e u d o m o n a s s o l a n c e a r u m ，引起的番茄病害有良好的防效( a s a k a , 1 9 9 6 ) 。 ( 2 ) 国内的应用状况 我国利用芽孢杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平， 现已开发成功并投入生产的商品制剂有亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁等。 云南农业大学和中国农业大学共同研制的微生物农药“百抗“ 获得农药部 登记注册，已在多个省推广使用，面积约4 6 6 7h m 2 。百抗的主要有效成分 是枯草芽抱杆菌b 9 0 8 ，大田应用中对水稻纹枯病防效达7 0 以上，其抑 菌机制为营养竞争、位点占领等。南京农业大学生防菌b 3 ( 商品名麦丰宁) 是由枯草芽孢杆菌b 3 菌株制成的活体生物杀菌剂，对小麦纹枯病田间防 效达5 0 - 8 0 ，其防病机制主要表现在产生抑带u j , 麦纹枯病病菌菌丝生 长、菌核形成和菌核萌发的抗菌物质。江苏省农业科学院陈志谊等人经过 1 0 多年生物防治水稻病害的研究获得了对多种病原菌有强烈抑制作用、 防治水稻纹枯病的效果达5 0 8 1 的丑s u b t i l i sb 9 1 6 菌株，已在江苏等 地得到大面积推广( 陈志谊等，2 0 0 31 。 谢栋等( 1 9 9 8 ) 分离到枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) b s 9 8 能强烈抑 制苹果轮纹病菌( p h y s a l o s p o r ap i r i c o l a ) 等植物病原真菌的拮抗菌。范青等 ( 2 0 0 0 ) 从北京苹果园土壤中分离的枯草芽孢杆菌b 9 1 2 防治柑桔青霉病、 绿霉病均取得较好的抑制效果。林东等( 2 0 0 1 ) 发现枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s ) s 0 1 1 3 对水稻白叶枯病菌( x a n t h o m o n a so r y z a ep v o r y z a e ) 具有强烈 的抑菌作用。何红等( 2 0 0 2 ) 发现来自辣椒体内的枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s s u b h l 括) b s 1 和b s 2 菌株对香蕉炭疽病菌菌丝生长、分生孢子形成及萌发 等有较强的抑制作用。 杨树内生细菌的分离、多样性分析及解淀粉芽孢杆菌p e b a 2 0 的抑菌活性研究 1 3 3 芽孢杆菌在植病生防中存在的问题与对策 目前，芽孢杆菌作为生防菌仍存在许多问题。大多数芽孢杆菌的生