PCR扩增反应的基本原理.doc

PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成 (4cWq!ax$ PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。 6!dbJ5x1 PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿53方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。 uHC)4(0 1模板DNA的变性 M(|QvhQ6 模板DNA加热到9095时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97，时间适当延长，即所谓的热启动。 ,yus44w 2模板DNA与引物的退火 eQu%TZ(x-$ 将反应混合物温度降低至3765时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为12min。 RMBVb 2Y wV DNA模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为4060个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需24min，一次PCR经过3040次循环，约23h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和，便出现所谓的“平台效应”，即靶DNA产物的浓度不再增加。 ReAl_Cm PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y（1X）n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。 HwU f PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3端开始延伸，其5端是固定的，3端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。 kJDMIh|g Q 50 图PCR的反应历程 ; $y.+5 q ;uvE? 55 二、PCR反应的五个元素 Rb9ZClq 参与PCR反应的物质主要为五种：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。 8 q 1引物 ie$=3nZJ 引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。 L-Tw),z7 引物的选择将决定PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。当然，即使有了好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。 pM#:OlqC （1）引物长度 %djx0sy PCR特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。引物的长度一般为15-30bp，常用的是1827bp，但不应大于38bp。引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对；引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶反应的最适温度，还会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA聚合酶进行反应，而且合成长引物还会大大增加合成费用。 NdJ)(2 （2）引物碱基构成 BV!Kiw 引物的G+C含量以4060%为宜，过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC含量不能相差太大。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值510。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为5580，其Tm值最好接近72以使复性条件最佳。引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。 +i)1 jX3的聚合酶活力，5-3的外切核酸酶活力，无3-5的外切核酸酶活力，会在3末端不依赖模板加入1个脱氧核苷酸（通常为A，故PCR产物克隆中有与之匹配的T载体），在体外实验中，Taq DNA聚合酶的出错率为10-410-5。此酶的发现使PCR广泛的被应用。 2FXs52 此酶具有以下特点： CY 7REF （1）耐高温，在70下反应2小时后其残留活性在90%以上，在93下反应2小时后其残留活性是仍能保持60%，而在95下反应2小时后为原来的40%。 d)r7 （2）在热变性时不会被钝化，故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。 XG %oL （3）一般扩增的PCR产物长度可达2.0 kb，且特异性也较高。 e Myq1ZU PCR的广泛应用得益于此酶，目前各试剂公司中开发了多种类型的Taq酶，有用于长片段扩增的酶，扩增长度极端可达40kb；有在常温条件下即可应用的常温PCR聚合酶；还有针对不同实验对象的酶等。 /0pPc*kA l时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。m一典型的PCR反应约需的酶量为2.5u（总反应体积为50 %(e=Q= 3dNTP的质量与浓度 :heJ5* !, dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M mol/l，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。mTris。HCl的缓冲液将其pH调节到7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200 u3 三、PCR反应特点 IRK ka(B PCR反应具有以下特点： AH nTm 1强特异性 Oc88 PCR反应的特异性决定因素为：（1）引物与模板DNA特异性的结合；（2）碱基配对原则；（3）Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；（4）靶基因的特异性与保守性。 0hvFf 其中引物与模板的正确结合是关键，引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。 U-k;kmaj 2高灵敏度 cshUxabB g =mPCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10-12g）量级的起始待测模板扩增到微克（ 10-6g）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。 lfKknp#B/O 3快速简便 f*I5 m= PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在PCR仪上进行变性退火延伸反应，反应一般在24小时完成。扩增产物常用电泳分析，操作简单易推广，如采用特殊PCR仪（荧光时时定量PCR仪）则可全程监测PCR反应的结果，故耗时将更短。 Z b1v 4低纯度模板 vIREvj#U 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA等均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 :vr,1c a /Vu 第二节PCR扩增反应的实施 /VQzF l?ci ;lG 一、PCR反应的条件 nFP2wvFM PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 0 ,zE 1温度与时间的设置 a%ej.)l 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至4060，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸（此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性）。 .x x#Y- （1）变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，9394 lmin足以使模板DNA变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 Cb13Qz （2）退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： I45A$nV#Q Tm值（解链温度）=4(G+C)2(A+T) iYf|;2 复性温度=Tm值-(510) EK&S= 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。 2 98Z,4 （3）延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：7080，150核苷酸/S/酶分子；70，60核苷酸/S/酶分子；55，24核苷酸/S/酶分子；高于90时，DNA合成几乎不能进行。 KZE.8%D （4）PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。34kb的靶序列需34min；扩增10kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 VeUOdNA 2循环次数 /;0*ft4 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度，一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 :-uK* XN5) 二、PCR扩增产物分析 MzsaJEE PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。 m PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 w3N%J4_E 1假阴性，不出现扩增条带 3(i-X PCR反应的关键环节有： 模板核酸的制备； 引物的质量与特异性； 酶的质量及活性； PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 .W;ptZ6 （1）模板： 模板中含有杂蛋白质； 模板中含有Taq酶抑制剂； 模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白； 在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚； 模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 gL53A （2）酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 5)7mjyo% （3）引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为： lk74qU$ 选定一个好的引物合成单位。 P FNf2U 引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。 *-29eR8 引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 RM1uYFsRon+ oe （1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列