慢病毒介导的稳定表达GSTM5的人支气管上皮细胞株的建立及其核转位分析——硕士论文

硕士学位论文 I 慢病毒介导的稳定表达慢病毒介导的稳定表达GSTM5GSTM5的人支气管上的人支气管上 皮细胞株的建立及其核转位分析皮细胞株的建立及其核转位分析 摘摘 要要 目的：构建稳定表达谷胱甘肽 S 转移酶 mu5（GSTM5）的人支气管上皮 16HBE 细胞株，探讨诱导 GSTM5 核转位的关键因素。方法：构建表达 GSTM5 基因的重组慢病毒载体（PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N、PLVX- puro-3*flag-SBP-GSTM5-C）并制备出相应的慢病毒，感染人支气管上皮 16HBE 细胞后，经嘌呤霉素筛选获得稳转株；实时荧光定量 PCR 和蛋白印迹 法（Western-Blot）分别检测细胞株中 GSTM5 的 mRNA、蛋白表达水平；以 TNF-（10 ng/mL）刺激稳转株 0.5 小时，共聚焦荧光显微镜检测 GSTM5 核转 位。结果：成功构建稳定表达 GSTM5 人支气管上皮细胞株（16HBE-GSTM5- SBP-3*flag-N、16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C） ；荧光共聚焦显微镜显示稳转株 在 TNF- 刺激诱导后，GSTM5 由胞浆转入胞核（核转位） ，以 16HBE-GSTM5- SBP-3*flag-N 稳转株更显著。结论：TNF- 炎症刺激可诱导稳定表达 GSTM5 的人支气管上皮细胞株中 GSTM5 发生核转位，可能与其 N 端含有非经典核定 位信号密切相关。 急性肺损伤（Acute Lung Injury, ALI）的病理生理过程是炎症反应与氧化 应激过度激活的过程，而且炎症反应与氧化应激密切相关1。炎症失衡诱发了 氧化相关基因的过度表达及活性氧过量生成，继发氧化应激损伤，加重了肺结 构细胞凋亡2, 3。在探讨 TNF- 诱导肺泡 II 型上皮细胞的烟酰胺腺嘌呤二核 苷酸磷酸氧化酶 1 （NADPH oxidase 1, Nox1） 基因转录调控过程中，发现 TNF- 刺激后，肺泡 II 型上皮细胞内 Nox 家族及 ROS 表达明显上调4， 摘要 II 同时 GSTM5 表达上调，并从胞浆转移入胞核，与 Nox1 启动子结合5。 GSTM5 属于 GST 家族，具有催化氧化还原反应的活性6，我们前期研究也证 实 GSTM5 能影响 P38、NF-B 等激酶活化，参与细胞炎症反应、凋亡等生 理过程的调节7。我们推测，在 ALI 的发生、发展过程中，GSTM5 对炎症反 应及其继发的氧化应激过程有具有调控作用，其机制与 Nox 基因表达密切相 关。GSTM5 对氧化应激的调控需要其发生核转位，但 GSTM5 没有核定位信号， 不是经典的转录因子。第一种解释是 GSTM5 可能与其他有核定位信号的分子 发生相互作用后核转位，第二种是 GSTM5 可能含有非经典的核定位信号。其 是否能在炎症刺激诱导下入核（核转位） ，是研究其非酶学（转录）活性的关 键。 为了使 GSTM5 基因能够在 16HBE 细胞核中稳定表达，本实验构建慢病 毒介导的稳定表达 GSTM5 的人支气管上皮细胞株。相比其它方法，慢病毒感 染因具有随机整合到细胞基因组的特性，细胞株的建立更容易，荧光素酶基因 的表达更稳定8，还能确保携带的外源基因不发生改变。慢病毒另一优点是可 以同时感染有分裂能力细胞和无分裂能力细胞，是基因治疗载体的理想方案9， 保证了其在在多种细胞中的应用。本研究所构建的稳定表达 GSTM5 的人支气 管上皮细胞株，经酶切、RT-qPCR、WB 验证，从基因、蛋白方面均证明稳转 株构建成功，可用于下一步研究 GSTM5 结构、功能、相互作用蛋白等实验。 另外，所构建的载体中有 SBP、3*flag 标签，可用于后续的串联亲和纯化 TAP- MS，以便分析 GSTM5 的相互作用蛋白，为探究其功能提供基础。 本实验构建慢病毒介导的稳定表达 GSTM5 的人支气管上皮细胞株，经 TNF- 刺激诱导后，荧光共聚焦显微镜显示 C、D 两组细胞株所表达的 GSTM5 都有不同程度的入核。当标签位于 GSTM5 的 C 端(N 端游离)时（C 组 16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N ） ，其核内荧光强度较另一个稳转株（D 组 16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C）大，提示 GSTM5 的核转位与 N 端结构域密切 相关。当标签位于 GSTM5 的 N 端时入核减少，可能与 GSTM5 的 N 端序列被 硕士学位论文 III 标签封闭相关。Miho Kawakatsu 等人发现 GSTpi 的线粒体定位序列与其 N 端 相关，其 195-208aa 则对其核定位有重要作用，并证实其为一种非经典核定位 信号（NLS）10。经搜索 expasy 等数据库表明，GSTM5 分 N 端和 C 端结构域， 分别是 1-88aa 和 90-207aa。我们推测，GSTM5 的 N 端结构域含有非经典核定 位信号，对其核转位有重要作用。在后续的研究中，本课题组将分别构建 GV230-GSTM51-88aa-GFP 及 GV230-GSTM5 90-207aa-GFP 载体，进一步研究 这两个结构域对 GSTM5 的核转位影响。此外，免疫荧光实验显示，在 TNF- 刺激诱导前后对照组细胞株（B 组 16HBE-SBP-3*flag）核内外均有较强绿色 荧光表达，可能与 SBP、3*flag 标签分子量小，可自由弥散进入细胞核相关。 综上所述，本实验成功建立了慢病毒介导的稳定表达 GSTM5 的人支气管 上皮细胞株，同时证实在 TNF- 诱导的炎症过程中 GSTM5 存在核转位，并 与其 N 端含有非经典核定位信号密切相关。本研究发现为后续 ALI 炎症氧化失 衡导致的肺结构细胞损伤调控机制的研究奠定基础。 关键词关键词：谷胱甘肽 S 转移酶 mu 5 重组慢病毒表达载体 16HBE 核转位 TNF- 硕士学位论文 i The Establishment of 16HBE Cell Stably Expressing GSTM5 Mediated by Lentivirus and the Mechanism of GSTM5 Nuclear Translocation ABSTRACT 1 Backgroud Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is a complex clinical syndrome, which is characterized by complicated pathology and pathogenesis1. Excessive inflammatory responses triggered oxidative stress , inducing the increase of endogenous reactive oxygen species (ROS) generation, and surpass the removal ability of the antioxidant system2. So that the body in the state of progressive oxidative stress , lead to lung structure cell injury. Glutathione S transferase combined with glutathione, is a multifunctional enzyme superfamily，which catalytic oxidation, and cooperate with other antioxidant enzymes in cells to scavenge active oxygen and protect cells from oxidative damage3. Glutathione S transferase Mu 5 (GSTM5) is a member of the GST family. The previous study found that, the transcription and expression of NOX1 in 16HBE were significantly increased after stimulation of TNF- cells8. Also，there are Interaction between GSTM5 and NOX1 promoter4，which causes our attention to GSTM5. 2 objectives This study intends to construct the human GSTM5 gene lentiviral expression vector and to build human bronchial epithelial cell line stably expressing GSTM5. To ABSTRACT ii observe GSTM5 nuclear translocation under cell inflammatory state with TNF simulation, which lays a foundation for further study the function of GSTM5 in transcription regulation. 3 methods 3.1 To construct the human GSTM5 gene lentiviral expression vector ：PLVX- puro-GSTM5-SBP-3*flag-N 、PLVX-Puro-3*flag-SBP-GSTM5-C. 3.2 To build human bronchial epithelial cell lines stably expressing GSTM5. 3.3 To verify cell lines by enzyme digestion, RT-qPCR and WB. 3.4 To observe GSTM5 nuclear translocation under cell inflammatory state with TNF simulation. 4 Results human bronchial epithelial cell line stably expressing GSTM5, verified by enzyme digestion, RT-qPCR and WB, were proved successfully constructed.When GSTM5 is located in the N terminal of tags (16HBE- GSTM5-SBP-3*flag-N), the nucleus fluorescence intensity was higher than another cell line (16HBE-3*flag-SBP- GSTM5-C) after stimulation of TNF- alpha. 5 conlusions The pathophysiological process of acute lung injury (Acute Lung Injury, ALI) is the process of excessive activation of inflammatory response and oxidative stress, and inflammation is closely related to oxidative stress5.The imbalance of inflammation induces the over expression of oxidative related genes and the generation of reactive oxygen species, and the secondary oxidative stress injury, which aggravates the apoptosis of lung structure cell 6, 7.In the study of TNF- induced II nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 1 (NADPH oxidase 1, Nox1) gene transcription process, we found that after TNF- stimulation, the expression of Nox family and ROS were up-regulated in type II alveolar epithelial 硕士学位论文 iii cells, 8 while GSTM5 up-regulated and transferred from cytoplasm to the nucleus, and bound to the Nox1 promoter 4. GSTM5 belongs to the GST family, which has the activity of catalytic redox reaction. 3 Our previous studies have confirmed that GSTM5 can affect the activation of P38, NF- kappa B and other kinase, and participate in the regulation of cell inflammatory response, apoptosis and other physiological processes 9 We speculate that GSTM5 plays a regulatory role in the process of ALI, and its mechanism is closely related to the expression of Nox1 gene. In order to stabilize the expression of GSTM5 gene in 16HBE cells, we constructed a lentiviral vector mediated human bronchial epithelial cell line stably expressing GSTM5.Compared with other methods, the lentivirus infection can randomly integrate target gene into the cell genome, the establishment of the cell line is easier, and the luciferase gene expression is more stable 10, but also ensure that the exogenous gene does not change. Another advantage of lentivirus is that it can infect both mitotic and non dividing cells, which ensure its application in a variety of cells and it is the ideal solution for gene therapy.11 What we constructed in this research , human bronchial epithelial cell line stably expressing GSTM5, verified by enzyme digestion, RT-qPCR and WB, from the gene and protein, were proved successfully constructed, which can be used for the next step study on the structure ,function, interacting protein of GSTM5.In addition, there are SBP and 3*flag tags in the constructed vector, which can be used in tandem affinity purification - mass spectrum ,(TAP-MS) in order to analyze the interaction proteins of GSTM5 and provide the basis for exploring its function. Because GSTM5 does not have a classical nuclear localization sequence, our primary task is to prove that it can transport into nucleus directly or indirectly after TNF- stimulation. The constructed human bronchial epithelial cell lines stably ABSTRACT iv expressing GSTM5, were tested by fluorescence confocal microscopy after stimulation of TNF- alpha. It showed that when GSTM5 is located in the N terminal of tags (16HBE- GSTM5-SBP-3*flag-N), the nucleus fluorescence intensity was higher than another cell line (16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C), suggesting that nuclear translocation is closely related.to N terminal domain of GSTM5.When GSTM5 is located at the C terminal of the tag (16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C), the nucleus fluorescence intensity is lower than another cell lines, which may related to the N terminal sequence being blocked by the tag. Miho Kawakatsu et al. Found that the mitochondrial localization sequence of GSTpi was related to its N terminal 12, and that 195-208aa played an important role in the nuclear localization of GSTpi, and confirmed that it was a non classical nuclear localization signal (NLS). After searching ExPASY and other databases, it show that GSTM5can be devided into two part, N and C terminal, namely 1-88aa and 90-207aa. In view of this, we believe that the N terminal domain of GSTM5 contains a non classical nuclear localization signal, plays an important role in its nuclear translocation. To further study on the mechanism of nuclear translocation of the N terminal domain, our research group will construct vectors GV230-GSTM51-88aa-GFP and GV230- GSTM55 90-207aa-GFP respectively. In summary, we constructed a lentiviral vector mediated human bronchial epithelial cell line stably expressing GSTM5. We also confirmed that GSTM5 translocate to nucleus in cell inflammation induced by TNF- alpha, and its N terminal is closely related with the non-classical nuclear localization signal. This study laid the foundation for the study of the regulation mechanism of lung cells damage induced by inflammation Oxidative imbalance in ALI. Keywords: Glutathione S-transferase M5； lentiviral vector；16HBE；nuclear translocation ；TNF- alpha 硕士学位论文 v 目目 录录 摘摘 要要.I ABSTRACT.I 前前 言言1 第一章第一章 构建重组慢病毒表达载体构建重组慢病毒表达载体 PLVX-PLVX-puropuro-GST-GSTM5-SBP-3*flag-M5-SBP-3*flag- N N、PLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-CPLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-C 及慢病毒制备及慢病毒制备.5 前言.5 1 材料和方法5 2 结果.20 3 讨论.26 第二章第二章 16HBE-GSTM516HBE-GSTM5 稳定细胞株构建与验证稳定细胞株构建与验证28 前言.28 1 材料和方法29 2 结果.40 3 讨论.42 第三章第三章 GSTM5GSTM5 的核定位分析的核定位分析.46 前言.46 1 材料和方法46 2 结果49 3 讨论.51 全文总结全文总结54 中英文缩写词简表中英文缩写词简表63 致致 谢谢.64 硕士学位论文 1 前前 言言 ALI/ARDS 是由非心源性的各种内外致病因素如严重感染、创伤、休克、 中毒等导致的急性进行性缺氧及呼吸功能不全或衰竭的临床综合征1，因其错 综复杂的发病机制以及较高的发病率和病死率而成为呼吸科常见的危急重症之 一，因此寻找有效治疗 ALI/ARDS 的新方案以及对其发病机制的研究仍是当前 学者们的迫切任务。近年来氧化应激在 ALI/ARDS 发病过程中发挥的作用越来 越受到人们的关注，对于氧化应激的认识源自衰老学说，在 1990 年由 Sohal 教 授首次提出了氧化应激的概念，在对其深入研究后发现氧化应激是机体氧化与 抗氧化系统失衡的表现，在此种失衡的状态下 ROS 大量产生而得不到及时有效 地清除，那么过剩的 ROS 就会氧化生物膜和亚细胞结构中的脂质11，造成其 结构和功能的损伤；还可以攻击生物大分子12如 DNA、蛋白质，诱发基因的 突变，使多种酶丧失活性；并能通过调节 NF-kB 等转录因子13，介导多种促炎 因子的产生；除此之外他还能够通过激活 c-Jun 氨基端激酶等导致细胞坏死14。 氧化应激可以通过以上多种途径的相互作用而最终造成对气道上皮细胞、肺泡 上皮细胞、肺毛细血管等肺组织的弥漫性损伤，诱发或加重肺水肿、肺不张， 引起难以纠正的低氧血症和呼吸窘迫，进而发展成 ALI/ARDS。因此，寻找氧 化应激的调节点，是重建 ALI 氧化平衡，是保护肺结构细胞的关键。 人支气管上皮细胞是组成气道屏障和气道环境刺激首先受累的细胞，外 界刺激和肺组织内异常的活性氧引起气道上皮损伤在 ALI 中扮演重要角色。 16HBE 是人支气管上皮细胞经 SV40 大 T 抗原转化所得细胞系，细胞系保留了 已分化的形态表型及正常人支气管上皮细胞的功能15, 16，可模拟体内病理生理 状态，具有永生化特点，方便基础科研操作，为研究气道疾病相关机制提供了 极大的方便。 前言 2 程雪等17研究发现，脂氧素通过抗氧化基因的重要转录因子 Nrf2 调节气 道上皮细胞钙黏蛋白的表达，并抑制 LPS 引起 16HBE 细胞中活性氧的产生, 从而减轻 ALI 的严重程度。因此，在急性肺损伤中，维持支气管上皮细胞的结 构和功能的完整性，对于 ALI 的救治有重要意义。TNF- 是 ALI 中介导炎症反 应启动与放大的主要炎症介质，在动物模型以及对 ALI 患者的研究中发现 TNF- 浓度与 ALI 病情严重程度正相关18, 19。并且 TNF- 在氧化应激中也起 着重要作用，它能诱导中性粒细胞等产生大量活性氧对细胞造成氧化损伤20， 最终引起细胞死亡。因此本实验选用 TNF- 刺激 16HBE 细胞模拟体外 ALI 炎 症氧化应激过程，为研究 GSTM5 在 ALI 氧化损伤中的作用奠定基础。 GSTM5 是 GST 家族的重要一员，GSTM5 属于 Mu(GSTM)一族，Xu 等的 研究表明 GSTM 基因簇以 5-GSTM4-GSTM2-GSTM1-GSTM5-GSTM3-3的 顺序串联排列而成，GSTMl-5 都位于染色体 lpl3.3 上21。GST 是一种重要的 相药物代谢酶，编码 GST 的基因分布在至少 7 条染色体上，构成了一个超基因 家族22。GST 家族分为细胞溶质 GST 和微粒体 GST 两类。微粒体 GST 超家族 至少由 6 个基因编码，为同源或异源三聚体，而细胞溶质 GST 为二聚体酶，至 少由 16 个基因编码，GST 家族以细胞溶质形式为主，依据初级结构和底物特 异性将其分为 8 个家族，分别命名为 Alpha(GSTA)，Kappa(GSTK)，Mu(GSTM)， Pi(GSTP1)，Sigma (GSTS)，Theta(GSTT)，Zeta(GSTZ1)和 Omega(GSTO)23 。GST 广泛存在于各种生物体内，是具有多种功能的一组酶，GSTs 能够催化 GSH 与亲电子物质结合形成亲水物质经肾脏排出体外；亦可作为转运蛋白转运 亲脂化合物，通过这些方式将有毒物质排出或降解；GST 还可以通过酶促和非 酶促反应，解除致突变剂对 DNA 大分子的毒性，在抗诱变及抗肿瘤中起重要 作用；GST 又称为非硒依赖性谷胱甘肽过氧化酶，能清除脂类自由基，有抗脂 质过氧化的作用；研究还发现24GST 能够抑制微粒体过氧化反应、清除体内氢 过氧化物。因此 GST 可以通过参与机体生物转化、解毒和抗氧化等多种生理与 代谢过程，降低细胞受多种外源性因素引起的损害。越来越多的研究证明抗氧 硕士学位论文 3 化酶 GST 在保护组织细胞免受过氧化损伤中起着重要作用25, 26。研究表明 GST 基因多态性与 ALI/ARDS 患者的死亡率相关27。 在对药物耐受性的研究中发现砒霜作为一种诱导氧化应激的药物，可引起 NOX 活化，而在 GST 表达增高的前提下，砒霜的毒性下降34，提示作为活性 氧主要来源的氧化酶 NOX 和抗氧化酶 GST 均参与了外源性因素引起的氧化应 激过程。本实验室前期在研究 NOX1 启动子差异结合蛋白的实验中，以 TNF- 刺激肺泡上皮细胞，模拟急性肺损伤体外细胞炎症-氧化损伤模型，通过 DNA- pull down、二维凝胶电泳及质谱分析筛选出 NOX1 启动子区域差异结合蛋白， 结果发现细胞核内 GSTM5 表达水平增高35，提示 GSTM5 参与了 ALI 的炎症 诱发的氧化应激，可能通过调节 NOX1 活性能影响 ALI 时氧化应激平衡，并且 其除了作为抗氧化酶直接参与氧化应激，可能通过调控氧化酶 NOX 家族表达， 而调节了氧化应激水平。 蛋白质功能的实现，离不开它与其他蛋白质之间的相互作用。我们利用 STRING 数据库分析，GSTM5 的相互作用蛋白众多。细胞中的大部分活动都是 由蛋白质之间相互作用形成的蛋白质复合物完成的，这些蛋白质复合物对于细 胞的日常活动以及疾病发生都有着极为重要的作用。对蛋白质复合物功能的研 究，特别是对炎症氧化相关的蛋白质复合体的研究，对理解炎症氧化的发生、 发展机理，寻找合适的诊断或治疗的靶标蛋白，甚至研制新的药物，均具有非 常重要的意义28。 研究蛋白质之间的相互作用的方法有很多，包括：蛋白质细胞内定位实验、 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation ） （细胞内蛋白质相互作用） 、 GST 沉淀 实验29（GST-pull down 实验） （细胞外蛋白质相互作用） 、酵母双杂交。 由于酵母双杂交法存在筛选步骤复杂30、假阳性结果多、难于量化等缺点， 不能满足大规模蛋白质组研究的需要。因此，与质谱技术联用的蛋白质纯化技 术已成为目前研究相互作用蛋白质组学的重要方法。我们拟采用串联亲和纯化 （Tandem affinity purification，TAP）联合质谱技术（MS）筛选 GSTM5 相互 前言 4 作用蛋白质。TAP 技术是筛选目标蛋白及其相互作用蛋白质较为理想的方法之 一28，其基本原理是构建带有两种亲和纯化标签的融合靶蛋白，转染到宿主细 胞或组织，带标签的靶蛋白表达并结合相互作用蛋白质后，利用两个标签与相 应磁珠的特异性结合，两步纯化得到目的蛋白的相互作用蛋白质。构建及稳定 表达带两种纯化亲和标签的融合 GSTM5 细胞株是研究中最为关键的步骤。最 常用的标签为 SBP、flag 标签，因其特异亲和力、分子量小等原因，被广泛使 用。 综上所述，本研究首先构建人 GSTM5 基因的慢病毒表达载体及稳定表达 GSTM5 的人支气管细胞株，并观察 TNF- 刺激模拟的细胞炎症状态下 GSTM5 核转位情况，分析其核转运相关机制。在完成以上实验后将利用 TAP- MS 技术，分析 GSTM5 相互作用蛋白，为后续 ALI/ARDS 炎症氧化失衡导致 的肺结构细胞损伤调控机制的研究奠定基础。 硕士学位论文 5 第第一一章章 构构建建重重组组慢慢病病毒毒表表达达 载载体体PLVX-puro-GSTM5-SBP- 3*flag- N、PLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-C及及慢慢病病毒毒制制备备 前言 GSTM5 作为抗氧化酶 GST 家族的成员，原定位于细胞浆，其抗氧化作用 在机体病理生理过程中扮演着重要角色。本实验组在前期研究中发现5，在 TNF-a 刺激 A549 细胞模拟的 ALI 炎症氧化应激过程中，通过运用 DNA pull- down 技术筛选出 NOXl 启动子区结合蛋白，再用二维凝胶电泳技术分离筛出的 结合蛋白，然后在 2D 凝胶上选取与对照组表达差异大于 1.5 倍的蛋白质点，最 后经质谱鉴定，分析结果显示 GSTM5 为表达上调的蛋白之一，提示 GSTM5 参与了 ALI 病理过程的氧化应激。有众多研究证实抗氧酶能够在 ALI 中能起到 保护性作用31, 32，因此我们对抗氧化酶 GSTM5 产生了浓厚兴趣，为进一步探 讨抗氧化酶 GSTM5 在 ALI 氧化应激中的可能作用及机制，本课题组根据 GeneBank 提供的人 GSTM5 基因序列（登陆号: NM_000851） ，利用空载体 PLVX-puro-3*flag-SBP、PLVX-puro-MCS-SBP-3*flag 和 2 种包装质粒 psPAX2、Pmd2.G)，构建了重组慢病毒表达质粒 PLVX-puro-GSTM5-SBP- 3*flag-N、PLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-C，利用酶切和测序验证其准确性， 并制备、包装、收集相对应的慢病毒颗粒，为后续感染 16HBE 细胞，构建过 表达 GSTM5 的稳转株做准备，本研究拟构建人 GSTM5 基因的慢病毒表达载 体及稳定表达 GSTM5 的人支气管细胞系，并观察 TNF- 刺激模拟的细胞炎 症状态下 GSTM5 核转位情况，为后续研究 GSTM5 的转录调控功能奠定基础。 第一章 构建重组慢病毒表达载体及慢病毒制备 6 1 材料和方法材料和方法 1.1 实验细胞 人支气管上皮（16HBE）细胞、293T细胞、Stbl3菌种由广州军区广州总医 院医学实验科细胞库提供。 载体分组： c：PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N d：PLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-C 稳转株分组：A：16HBE B：16HBE-SBP-3*flag C：16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N D：16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C 1.2 实验仪器与试剂 1.2.1 主要仪器 名称 生产厂家 超净工作台 生物安全柜 各种规格孔板及细胞培养瓶 CO2细胞培养箱 倒置显微镜 直热式电热恒温干燥箱 超低温冰箱 微量移液器 微波炉 细菌摇床 细菌培养箱 常温离心机 苏州净化设备有限公司 苏州净化设备有限公司 美国 Corning 公司 美国 Sheldon 公司 日本 OLYMPUS 公司 广州东方电热设备厂 韩国三星公司 法国 Gilson 公司 Glanz WP 750L23-6 型 华利达实验设备公司 上海一恒仪器设备公司 美国 Thermo Fisher 公司 硕士学位论文 7 低温离心机 Nanodrop 2000 分光光度计 PCR 仪 凝胶成像分析系统 漩涡振荡器 超纯水制备系统 多功能酶标仪 电子天平 慢病毒系统 慢病毒包装专用促转染试剂 FItran 限制性内切酶、T4 DNA 连接酶购自 ClonExpress II One Step Cloning Kit 连 接酶 质粒提取和凝胶回收试剂盒 美国 Thermo Fisher 公司 美国 Thermo Fisher 公司 美国 Bio RAD 公司 美国 Bio-RAD 公司 美国 ELGA 公司 美国 ELGA 公司 美国 Thermo 公司 常熟天量仪器设备公司 辉骏生物 辉骏生物 Thermo Scientific 公司 诺唯赞公司 诺唯赞公司 Qiagen 公司 1.2.2 主要试剂 名称 生产厂家 PCR 引物 PrimeScript RT-PCR Kit Taq PCR MasterMix DL2000 DNA Marker DL10000 DNA Marker GV230-GSTM5-GFP 质粒 琼脂糖粉 胰蛋白胨 酵母提取物 上海英潍捷基公司 日本 TaKaRa 公司 北京康为世纪生物科技有限公司 日本 TakaRa 公司 日本 TakaRa 公司 上海吉凯基因公司 美国 Sigma 公司 美国 Sigma 公司 美国 Sigma 公司 第一章 构建重组慢病毒表达载体及慢病毒制备 8 氨苄青霉素 质粒小提取试剂盒 谷氨酰胺（Gln） 美国 Sigma 公司 北京天根生化科技有限公司 sigma 公司 1.3 关键试剂配制 1.3.1 LB 培养基 取酵母提取物 5g，胰蛋白胨 10g，氯化钠 10g 加入 950ml 蒸馏水中，搅拌 均匀至溶质充分溶解，加入蒸馏水至 1L，在 1.034105Pa 高压下蒸汽灭菌 20min 后常温保存。 1.3.2 LB 琼脂平板 将 15g/L 琼脂糖粉加入依照上述方法配制的 LB 液体培养基中，高压蒸汽 灭菌 20min。使用时在微波炉内加热融化，当培养基温度下降到大约 56 时 加入抗生素，倾出适当培养基到细菌培养皿中，待其凝结后，用封口膜密封培 养皿盖，倒置培养皿，4储存。 1.3.3 100mg/ml 氨苄青霉素溶液 在超净台内配制，取 0.3g 氨苄青霉素，加入 3ml 灭菌水，枪头吹打至完全 溶解，配制成 100mg/mL 氨苄青霉素溶液，过滤除菌，分装于灭菌的 EP 管，- 20保存。 1.3.4 TNF- 配制 10g 一支的 TNF- 干粉室温平衡后瞬时离心，加入 100l 灭菌水溶解为 100ng/l 储存液，-80保存。使用前取 1ul TNF- 储存液，加入 1ml 1640 培养 基，配制成 10ng/mL 工作液。 1.3.5 引物工作液 引物冻干粉室温平衡后瞬时离心，按引物合成单上 nmol 数，加入 10 倍 nmol 数体积的灭菌水，配成 100M 的引物储存液，-20保存。使用时取出 1 体积的引物储存液加入 9 体积的灭菌水中配成 10M 的引物工作液。 1.3.6 0.1% DEPC 水 硕士学位论文 9 1ml DEPC 原液加入 999ml 蒸馏水后充分混匀 4保存。 1.3.7 75% DEPC 酒精 无水乙醇 75ml 加入 25mL 灭菌后的 0.1% DEPC 水后充分混匀，后 4保 存。 1.3.8 50TAE 50储存液（每升）：242g Tris 碱，57.1ml 冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，使用时用双蒸水稀释 50 倍，配制成工作液。 1.3.9 5蛋白电泳缓冲液 称取 15.1g Tris Base、72.1g 甘氨酸、5.0g SDS，加 800ml 馏水，搅拌至溶 解加蒸馏水定容至 1000ml，室温保存，使用时蒸馏水稀释至 1工作液。 1.3.10 10蛋白转移缓冲液 称取 30.25g Tris Base、144g 甘氨酸，加蒸馏水 800ml 溶解后定容至 1000ml，室温保存，使用时蒸馏水稀释至 1，与甲醇按 4:1 混合成工作液。 1.3.11 10%过硫酸铵 称取 0.1g 过硫酸铵加入 1ml 蒸馏水溶解， 4保存。 1.3.12 10% SDS 电泳级 SDS 10g 加入蒸馏水 80 ml，68加热溶解后调 pH 值至 7.2，加蒸 馏水定容至 100ml，室温保存。 1.3.13 1.5M Tris-Hcl（PH8.8） 称取 18.17 g Tris 碱，蒸馏水溶解，浓盐酸调 pH 至 8.8，定容至 100ml。 1.3.14 1M Tris-Hcl（PH8.8） 称取 12.11 g Tris 碱，蒸馏水溶解，浓盐酸调 pH 至 6.8， 定容至 100ml。 1.3.15 10TBS 称取 24.2g Tris Base 和 87.66g NaCl 加入 800ml 蒸馏水中溶解，浓盐酸调 pH 至 7.6，最后定容至 1L。 1.3.16 TBST 第一章 构建重组慢病毒表达载体及慢病毒制备 10 1TBS 加 0.1Tween-20 至终浓度 0.05。 1.3.17 0.01mmol/L PBS 溶液 称取 NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.38g，KH2PO4 0.24g，加 800ml 超纯 水溶解，浓 HCl 调节 PH 至 7.4，定容至 1000ml，高压蒸汽灭菌，室温保存。 1.4 实验方法 1.4.1 重组慢病毒表达载体构建 . 引物设计 根据 GSTM5 基因编码序列上下游设计引物，GSTM5 基因序列如下： atgcccatga ctctggggta ctgggacatc cgtgggctgg cccacgccat ccgcttgctc ctggaataca cagactcaag ctatgtggaa aagaagtaca cgctggggga cgctcctgac tatgacagaa gccagtggct gaatgaaaaa ttcaagctgg gcctggactt tcccaatctg ccctacttga ttgatggggc tcacaagatc acccagagca atgccatcct gcgctacatt gcccgcaagc acaacctgtg tggggagaca gaagaggaga agattcgtgt ggacattttg gagaaccagg ttatggataa ccacatggag ctggtcagac tgtgctatga cccagatttt gagaaactga agccaaaata cttggaggaa ctccctgaaa 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