利用亚硝酸盐为电子受体反硝化聚磷菌的筛选与富集-毕业论文

利用亚硝酸盐为电子受体反硝化聚磷菌的筛选与富集 摘要：依据DPB原理，利用SBR动态反应器和静态释/聚磷装置。以A2/O工艺厌氧段污泥为种泥，研究以亚硝酸盐为电子受体反硝化聚磷菌的筛选与富集，同时对选择、富集污泥的反硝化聚磷性能进行了考察。结果表明：利用亚硝酸盐为电子受体的反硝化聚磷菌存在于A2/O厌氧段污泥中，通过厌氧/好氧和厌氧/缺氧方式运行后，聚磷菌总数由1.4103个/ml增加到3.2104个/ml，其中反硝化聚磷菌占聚磷菌总数的比例也由14.5%提高到81%，磷酸盐和亚硝酸盐去除率分别由最初的8.65%、7.55%上升到91%、95.62%；筛选与富集利用亚硝酸盐为电子受体的反硝化聚磷菌时，缺氧段进水COD的浓度须控制在10mg/l以下；当体系处于稳定状态，且亚硝酸盐氮浓度高达30mg/l时，并末对反硝化聚磷菌的生存产生抑制和体系运行产生干扰，此时磷酸盐出水低至1.06mg/l。关键词：A2/O工艺：亚硝酸盐：反硝化聚磷菌Screening and enrichment of denitrifying phosphorus accumulating bacteria(DPB) using nitrite as electronic acceptorZhou Kangqun, Liu Hui, Sun Yanfu, Tao xueqin, Zhou Yiping, Liu jieping(Department of Environment Science and Engineering, Zhongkai Agrotechnical College, Guangzhou,510225 )Abstract: In this paper, according as the denitrifying phosphorus bacteria(DPB) principle, dynamic SBR reactor and static releasing/accumulating phosphorus installation were investigated. The anoxic sludge of A2/O technology was used as inoculum. The screening and enrichment of denitrifying phosphorus accumulating bacteria(DPB) using nitrite as electronic acceptor and its characteristics were studied. The result shows: the DPB using nitrite as electronic acceptor indeed lies in the anoxic sludge of A2/O technology. After anaerobic/aerobic and anaerobic/anoxic stages, the amount of PAO increases from 1.4103 to 3.2104.The ratio of DPB to PAO improves from 14.5% to 81%. The removal efficiency of phosphate and nitrite rises from 8.65%、7.55% to 91%、95.62% respectively； when the DPB using nitrite as electronic acceptor is screened and enriched, the COD concentration of influent in the anoxic stage must be controlled below 10mg/l;The existence of DPB is not restrained and the system is not disturbed when the system is stable and the nitrite concentration reaches as high as 30mg/l.At the same time the concentration of phosphate in the effluent is below 1.06mg/l.Key word: A2/O technology; nitrite; denitrifying phosphorus accumulating bacteria(DPB)导言污水的生物除磷工艺因其具有经济性的优势而得到广泛的运用，在生物除磷过程中起着关键的作用是聚磷菌。最近新加坡的J.Y.Hu1 等人的研究中提出了有3种聚磷菌：（1）一种只能利用氧作为电子受体的聚磷菌，记为P0；（2）另一种是既可以利用氧又利用硝酸盐作为电子受体的聚磷菌，记为PON；（3）还存在一种利用氧、硝酸、亚硝酸盐作为电子受体的聚磷菌，记为PONn。传统生物除磷工艺中的聚磷菌是PO，这类微生物能够以氧作为电子受体，将废水中的磷聚集在细胞内以聚磷的形式储存2。Kuba等人从动力学性质上对两类聚磷菌P0和PON进行了比较，认为以硝酸盐作为电子受体的反硝化聚磷菌有着和好氧聚磷菌同样高的强化生物除磷性能3-4。王爱杰5提出可以利用NO-2-N作为电子受体完成反硝化脱氮聚磷过程，其特点是运行周期短、释放磷聚磷速度快，联合亚硝酸盐型硝化技术，将硝化控制在亚硝酸盐阶段，就可以实现两段活性污泥系统-短程硝化反硝化聚磷工艺，可以进一步节省耗氧量和碳源，减少剩余污泥量。因此，利用利用亚硝酸盐为电子受体的反硝化聚磷菌的选择和富集就成了短程同步反硝化聚磷工艺首先要解决的问题。本研究依据DPB原理，利用SBR动态反应器和静态释/聚磷装置，以A2/O工艺厌氧段污泥为种泥，研究以亚硝酸盐为电子受体反硝化聚磷菌的筛选与富集，同时跟踪富集过程中聚磷菌数量及反硝化聚磷菌占总聚磷菌的比例的变化，并考察富集后污泥的反硝化除磷的性能。1试验材料与方法1.1 试验设备1.1.1 动态SBR厌氧/缺氧反应器，有效容积35L,内设黏砂曝气头,采用鼓风曝气,反应器中同时设有搅拌器在厌氧和缺氧环境下使污泥处于悬浮状态(见图1)。Fig.1 the dynamic SBR reactor1.1.2释放磷装置（1）静态好氧反应装置，有效容积1L（(见图2)( 2 ) 静态缺氧反应装置，有效容积1L (见图3)Fig.2 the static anaerobic/aerobic installation Fig.3 the static anaerobic/anoxic reactor installation1.2 试验材料1.2.1试验人工合成废水（表 1）表1 试验人工合成废水成份 Table 1 the composition of synthetic wastewater in the experiment 人工合成废水成份微量元素组成基质种类浓度（mg/L）组成浓度（g/L）COD(NaAc)150250FeCl31.5N(NH4Cl)14CuSO40.03P(K2HPO4)612KI0.18MgSO445MnCl20.12ZnSO40.12KCl18CoCl30.15碱度（CaCO3）60EDTA10微量元素0.9mL注：试验用水应尽量降低水中溶解氧对试验厌（缺）氧环境影响1.2.2 SBR反应器供试活性污泥取自运行良好的污水处理厂A2/O工艺厌氧段污泥1.2.3 细菌计数供试活性污泥取自SBR反应器一定去除率时厌氧段污泥1.3试验方法和步骤1.3.1驯化与富集以亚硝酸盐为电子受体选择和富集反硝化聚磷菌，分三阶段在室温2526进行。第一阶段将1.2.2的活性污泥与1.2.1的人工合成废水混合后，MLSS控制在3500mg/L左右，以厌氧/好氧方式启动运行，其目的是为活化出高效的好氧聚磷效果的污泥，该阶段泥龄控制在8天左右，好氧段ORP（氧化还原电位）控制在80100mV，厌氧ORP控制在150220mV，每天运行4周期，每个周期6小时（包括厌氧3小时、好氧2小时、其它约1小时），共运行20周期，目的是对系统中的活性污泥进行活化，得到具有高效的好氧除磷效果污泥，为后两阶段富集反硝化聚磷菌做准备。第二阶段采用厌氧/缺氧方式运行，即将第一阶段的污泥与1.2.1的人工合成废水混合后进行厌氧3小时释磷，经过沉淀排水后加入不含COD的人工合成废水，泥水混合后使水中的COD尽量在50mg/l之下6，同时向系统投加一定量的亚硝酸盐使N:P=2:1时进入4小时缺氧聚磷，每天运行3周期，该阶段中泥浓度控制在35004000 mg/L，污泥龄为18天左右，缺氧ORP在-100-150mV，厌氧ORP在-150-220mV，共运行102周期，该阶段的目的是去除常规反硝化菌（仅有反硝化作用而无聚磷作用的菌）,同时对利用亚硝酸盐为电子受体的反硝化聚磷菌进行选择和富集。第三阶段采用厌氧/缺氧/沉淀运行方式，即将第二阶段的污泥与1.2.1的人工合成废水混合后进行厌氧3小时释磷，经过沉淀排水后加入溶解氧较低的水, 同时向系统投加一定量的亚硝酸盐使N:P=2:1缺氧聚磷4.5小时，该段中污泥浓度为35004000 mg/L泥龄控制在18天左右，每天运行3周期，共运行35周期,其目的在第二阶段反硝化聚磷菌已经富集到一定量的基础上，保持体系稳定性，同时进一步提高体系的反硝化除磷的性能。1.3.2第一和第二阶段驯化后的活性污泥在好氧、缺氧条件下的聚磷效果将1.3.1步骤中第一和第二阶段培养驯化的泥水混合液在SBR厌氧/缺氧反应器经过3小时厌氧释磷后，分别置于两个1L容积的静态厌氧/好氧反应装置和静态厌氧/缺氧反应装置内，分别在好氧和缺氧状态下利用氧气和亚硝酸盐为电子受体进行聚磷, 亚硝酸盐投加量与磷酸盐为N:P=2:1。1.3.3细菌计数采用标准菌落计数法，聚磷菌筛选培养基配方7：醋酸钠3.68g，磷酸氢二钠28.73mg，氯化氨57.27mg，硫酸镁131.82mg，硫酸钾26.74mg，二氯化钙 17.2mg，HEPES buffer 12g，琼脂18-20g，pH=7.0，1000ml蒸馏水。1.4指标分析方法 PO43-P采用钼锑抗分光光度法;NO2N采用N-(1-萘基)乙二胺光度法；MLSS采用滤纸重量法；COD采用快速测定法 ORP采用TS-2手提式氧化还原电位仪2结果与讨论2.1第一阶段聚磷菌的活化以及磷酸盐去除率的变化由图4可知，体系在厌氧/好氧方式下运行，磷酸盐的去除率由开始的58.8%经过20周期运行提高到96.7%。结合表2中所跟踪的细菌总数中初期的2.4105个/ml上升第20周期的3.2107个/ml，数量增加为原来的133倍。说明聚磷菌在传统的A2/O工艺中己存在,通过厌氧/好氧20周期的运行后好氧聚磷菌不仅在数量而且在功能方面得以增强，这为后两阶段利用亚硝酸盐为电子受体反硝化聚磷菌的选择与富集创造了条件。Fig.4 the changing process of the phosphate removal efficiency during the first period 表2 第一阶段聚磷菌细菌总数 Tab.2 the amount of PAO during the first period时间(周期)细菌总数(个/ml)12.4105203.21072.2以亚硝酸盐为电子受体的反硝化聚磷菌的筛选与富集2.2.1第二阶段反硝化聚磷菌的筛选与富集经过第一阶段的厌氧/好氧培养后，污泥具有良好的好氧吸磷的性能。体系进入第二阶段，对能够利用亚硝酸盐为电子受体的反硝化聚磷菌进行筛选与富集，是整个实验的关键。由图5可知，在第二阶段，磷酸盐、亚硝酸盐的去除率随着选择、富集周期不断延长而逐渐由最初的8.65%和7.55%经过102周期的运行提高91%和95.62%，结合图6第二阶段开始后的第3周期，体系中磷酸盐浓度在厌氧和缺氧结束时分别为10.4和5.92mg/l,有4.48mg/l的磷被在缺氧环境中被吸收，说明利用亚硝酸盐为电子受体的反硝化聚磷菌在培养驯化之前就己存在于A2/O工艺厌氧段污泥中，该种污泥可作为反硝化聚磷工艺的种泥。在24、42、60、90周期进水磷浓度在6mg/l左右的情况下，厌氧后释磷量由10.94mg/l逐步由放大15.2mg/l , 缺氧结束时出水磷酸盐的浓度由5.32mg/L降低为1.6mg/L，图5数据得知,此时磷酸盐、亚硝酸盐去除率由38.51%、40.2%上升为64.53%、68.49%，厌氧释磷量增加和缺氧结束时出水磷酸盐的浓度的降低与磷酸盐、亚硝酸盐去除率间表现为同步性，说明越来越多的磷酸盐在缺氧状态下被反硝化聚磷菌在反硝化的同时将磷酸盐吸收体内。在第二阶段结束时的第102周期，反硝化聚磷量达10.68 mg/L，此时缺氧段出水磷酸盐浓度低至0.69mg/l,说明厌氧/缺氧交替运行,并且采用缺氧段进水的COD较低的筛选富集方式，有利于利用亚硝酸盐为电子受体的反硝化聚磷菌的生长。图5 第二阶段磷酸盐与亚硝酸盐去除率的变化过程Fig.5 the changing process of the phosphate/ nitrite removal efficiency during the second period efficiency during the second period 值得注意的是第30、36、66周期，出现除磷率不升反降,而亚硝酸盐去除率却上升现象，此时的反硝化聚磷效果不佳的情况，通过跟踪体系中COD指标变化情况,发现以上三个周期缺氧段开始时COD浓度分别为64mg/l、81 mg/l和79 mg/l，分析其原因是由于,厌氧结束经排水沉淀后，体系中仍然残留一定量的COD,至使缺氧开始时，这部分COD与亚硝酸盐同时存在时，反硝化菌与反硝化聚磷菌竟争,使反硝化菌优先利用残余的COD进行了反硝化反应，影响了除磷效果所致，这一现象与李志勇利用硝酸盐为电子受体驯化反硝化聚磷菌报道观点较为一致6。在第48、54、96周期，除磷率的上升速度很慢，数据显示这几周期缺氧段开始时COD的浓度分别为25.1、25.2和31.6mg/L，这部分COD同样会与亚硝酸盐竞争电子供体，对反硝化聚磷带来不利影响。而在其他运行周期内，缺氧段的COD浓度均在10 mg/l以下，除磷率提高较快。说明体系要想尽快驯化到能够利用亚硝酸盐为电子受体的反硝化聚磷菌,缺氧段中必须很好地控制进水中COD的浓度。对比表2和表3数据，聚磷菌的数量由3.2107个/ml减少到1.4103个/ml,其原因是由于通过厌氧/缺氧方式运行后,一部份仅能利用氧气不能利用亚硝酸盐为电子受体的常规的聚磷菌被淘汰。但利用亚硝酸盐为电子受体的反硝化聚磷菌数量随着选择和富集过程不断进行，由最初的1.4103个/ml经过102周期上升到3.2104个/ml，菌数增加了22.9倍。综上所述，一方面说明磷酸盐和硝酸盐去除率的不断提高与利用亚硝酸盐为电子受体反硝化聚磷菌数量增加有密关。另一方面也说明尽管亚硝酸盐对微生物的生长有一定抑制作用，但只要选择合理的选择和富集方式控制好缺氧段进水COD值，经过比利用硝酸盐为电子受体的反硝化聚磷菌更多周期的驯化（利用硝酸盐为电子受体的反硝化聚磷菌选择和富集需40周期6），同样可使对微生物有一定毒害作用的亚硝酸盐转为反硝化聚磷菌的电子受体，实现同步的反硝化聚磷，这为短程硝化后实现同步反硝化聚磷奠定了基础。 图6 第2阶段典型周期PO43-P浓度变化 Fig.6 the concentration change of PO43-P in the typical cycle of the second period表3 第二阶段几个典型周期聚磷菌细菌总数Tab.3 the amount of PAO during the second typical cycles时间(周期)细菌总数(个/ml)3 1.410324 6.910360 1.110490 2.8104102 3.21042.2.2第三阶段体系处于稳定状态的反硝化聚磷效果经过第二阶段运行，体系己具有了一定数量的利用亚硝酸盐作为电子受体的反硝化聚磷菌。图7是体系运行到第35 周期,磷酸盐去除率为95.2%亚硝酸盐除率为98.4%一典型释/聚磷过程，经过3小时的厌氧释磷，体系中磷酸盐的浓度由6.00 mg/L上升为15.42mg/L，吐磷速率为0.897gPO43-P/kg.h，200mg/lCOD几乎消耗完。厌氧结束后加入亚硝酸盐，使缺氧段开始时亚硝态氮的浓度为30 mg/L(N:P=1.95:1)，经4.5小时的缺氧反应后，亚硝酸盐氮和磷酸盐的浓度分别下降到1.35mg/L和 1.06mg/L，体系的反硝化聚磷率高达93.1%，脱氮率达95.5。进一步说明对微生物有毒害作用的亚硝酸只要采取合理的筛选与富集方式可以将亚硝酸作为电子受体进行同步反硝化聚磷，这与彭永臻、王亚宜等8认为当NO2-N达到15 mg/L时反硝化和吸磷反应均受到了抑制，和国外Meihold9等认为当NO-2-N浓度大于8 mg/L时，完全抑制缺氧反硝化聚磷的观点不一致。这是因为采取合理的筛选与富集方式可以提高利用亚硝酸盐作为电子受体进行同步反硝化聚磷菌对环境的适应性。 图7 第三阶段第35周期的释/聚磷过程Tab.7 the releasing/accumulating process in the 35th cycle of the third period efficiency during the third period2. 3第一和第三阶段驯化后的活性污泥在好氧、缺氧条件下的吸磷比较Wachtmeister 和Meinhold认为，缺氧吸磷和好氧吸磷速率的比值能够反映反硝化聚磷菌与全部聚磷菌的数量比例10-11。通过这个方法，利用1.3.2步骤分别对第一阶段、第二阶段和第三阶段选择富集结束时体系中的能利用亚硝酸盐作为电子受体反硝化聚磷菌的数量作估计，以考察反硝化聚磷菌富集的效果。由图8可知,厌氧释磷3小时磷的浓度由6 mg/L上升为25mg/L，吐磷速率为1.81PO43-P/kg.h,在好氧环境中运行的反应器中出现了良好的好氧吸磷性能，经过4.5小时的好氧吸磷，体系中的磷浓度下降到1.1 mg/L，好氧吸磷的速率为1.52 gPO43-P/kg.h，去除率达95.6；而在缺氧条件运行的反应器，体系在4.5小时缺氧结束浓度为21.5 mg/L，仅有3.5 mg/L的磷被吸收，反硝化吸磷的速率为0.22 gPO43-P/kg.h。反硝化除磷菌占全部聚磷菌的比例为14.5，该值比DAESUNGLEE在研究中报道的11.2%略高12，与李勇智报道的15.5%接近6。进一步说明利用亚硝酸盐作为电子受体的反硝化除磷菌在厌氧/好氧的运行中已存在，不过数量较少，未成为优势菌群。图8 第一阶段驯化后的活性污泥在缺氧好氧条 件下聚磷比较Fig.8 the comparison of aerobic/anoxic accumulation phosphate after the first cultivation period图9可知，经过第三阶段驯化后，厌氧释磷3小时磷的浓度由6 mg/L上升为19.6mg/L,此时活性污泥在好氧条件下仍然有良好的好氧吸磷性能，好氧吸磷速率为1.05 gPO43-P/kg.h，比第一阶段驯化后低了0.47 gPO43-P/kg.h，一方面说明以亚硝酸盐为电子受体的反硝化聚磷菌，在以氧为电子受体的聚磷率要低于以氧为电子受体的好氧聚磷菌的聚磷率，另一方面也说明以氧气为电子受体的一部份好氧聚磷菌被淘汰。而在缺氧条件运行的反应器，经过4.5小时充分缺氧吸磷，体系中磷的浓度从19.6 mg/L降至4.11 mg/l,反硝化吸磷率为0.983 gPO43-P/kg.h，比第一阶段驯化后增加了0.763gPO43-P/kg.h，此时体系中反硝化聚磷菌占的比例高达93.6，大大高于文献12报道的64%结果。同时结合表2表3中聚磷菌细菌总数增加数据，进一步说明所设定的富集和选择方式，有利于亚硝酸盐作为电子受体的反硝化聚磷菌的生长。 图9 第三阶段驯化后的活性污泥在缺氧好氧条 件下聚磷比较 Fig.9 the comparison of accumulation phosphate under anoxic/aerobic conditions after the third cultivation period after the third period3结论3.1利用亚硝酸盐为电子受体的反硝化聚磷菌在A2/O厌氧段污泥中占总聚磷菌的比例为14.5%，该种污泥可作为反硝化聚磷工艺的种泥。3.2通过厌氧/好氧和厌氧/缺氧方式的运行聚磷菌总数由1.4103增加到3.2104，其中反硝化聚磷菌占聚磷菌总数的比例也由14.5%提高到81%，磷酸盐和亚硝酸盐去除率由最初的8.65%、7.55%上升到91%、95.62%。3.3筛选与富集利用亚硝酸盐为电子受体的反硝化聚磷菌，缺氧段进水COD的浓度须控制在10mg/l以下；体系处于稳定状态时，亚硝酸盐氮浓度高达30mg/l时，并未对反硝化聚磷菌的生存产生抑制和体系运行产生干扰，此时PO43-P出水低至1.06mg/l。参考文献：1J Y Hu ,S L Ong,W J Ng,et al.A new method for characterizing denitritying phosphorus removal bacterial by using three different types of electron acceptorsJ.Water Research.2003,37(14):3463-34712Chuang S H，Ouyang C FThe biomass fraction of heterotrophs and phosphateaccumulating organisms in a nitrogen and phosphorus removal systemJWat Res，2000，34(8)：2238-22903Kuha Tvan Laosdrecht M C M，Heijnan J JPhosphorus and nitrogen removal with minimal COD requirement by integration of denitrifying dephosphatation and nitrification in a twosludge systemJWat Res，1996，30(7)：1702- 17104Kuha TSmolders G，van Loosdrecht M C M ，et a1Biological phosphorus removal from wastewater by 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