微生物学实验讲稿.doc

微生物实验讲稿实验一 显微镜的使用及微生物形态观察一. 实验目的1. 了解普通光学显微镜的构造,学习显微镜的使用方法和保养.(高,低倍镜的使用)2. 观察细菌,霉菌,酵母菌个体形态,学会生物图的绘制.二实验原理根据凸透镜成像原理，在物镜一倍焦躁之外二倍焦距之内形成一个倒立放大的实像，成像在目镜一倍焦距之内，形成一个正立放大的虚像，如果利用一组透镜观察物体，能提高上千倍。特别是油镜的使用，油镜的放大倍数最大(100),故镜头焦距短,直径小,但所需光照强度却最大.从标本片透过的光线是从玻片进入空 气,再进入镜头.由于玻璃和空气的介质密度不同,有些光会因折射或反射而 不能进入镜头.物象就显现不清.为了不使通过的光线有所损失,在镜头和所观察物体之间加入折射率和玻璃(n=1.52)相仿的香柏油(n=1.515). 根据D=/ 2N.A.= / 2 ns i n / 2，可以增加视野的明亮度，提高折射率，增大分辨率。其中数值孔径: N.A. = ns i n / 2 ，n 玻片和物镜之间的折射率. 光线最大射入角.分辨率(最大可分辨距离)=/ N.A. ，波长 ，数值孔径是反应显微镜性能的主要参数。三. 实验器材1. 光学显微镜2. 示范片:曲霉,青霉,酵母菌,细菌四. 实验内容 (一) 显微镜的构造和使用方法1. 构造机械部分: 镜筒(双筒,两筒间距离可调,上装有目镜)转换器(3孔,装有物镜)载物台(中央圆孔,弹簧夹,移动器)调节器(粗调,细调)镜臂(支撑作用)镜座(上有光源,亮度可调)光学部分:目镜(10,16)物镜(低倍镜10,高倍镜40,油镜100)聚光器(内有光圈调节)光源(光量可调)显微镜放大倍数 = 目镜放大倍数 物镜放大倍数物镜上的标识: 1 .25 (0.65,0.25) 100(40,10) 160 0.17 数值孔径 放大倍数 镜筒长 盖玻片厚度2. 显微镜的使用低倍镜的使用 (1)双手取出显微镜置于实验台上,接上电源,打开开关,调节合适光量. (2)转动转换器,将低倍镜移至正下方.调节两目镜镜筒间的距离. (3)将载玻片放在载物台上夹住,移动观察对象于圆孔正中. (4)侧视物镜,转动粗调将载物台上移,至载玻片距物镜头约5mm时停止. (5)双眼向目镜里观察,同时旋转粗调节器使载物台缓慢下移,若标本显出但不清晰,可用细调节器调至清晰.若粗调旋转太快,超过焦点没有看到标本,则必须重复(4), (5)步骤.不能在眼睛观察目镜的同时旋转粗调,以防物镜与载玻片相碰撞,造成损坏. 1-5高倍镜的使用在用低倍镜找到观察目标后,若需要进一步放大观察,将其移到视野中央.用转换器将高倍镜移到镜筒下方,将光量调大一点.若标本不清晰,用细调上下转动使之清晰.(此时不再动粗调) 3.显微镜的维护 (1)将载物台降至最低,取下标本片. (2)将光量调至最小,关上电源. (3)用镜头纸先檫目镜,物镜,再擦显微镜其它部分. (4)将显微镜放入镜箱,还原. 4微生物形态的观察1. 用低倍镜和高倍镜观察细菌,曲霉,青霉,酵母菌,放线菌,示范片.五. 实验报告1画出微生物形态图,并标明显微镜的放大倍数.如10 10实验二 微生物的染色一. 目的1. 学习微生物的染色技术,掌握微生物的单染色法和革兰氏染色法. 2. 复习油镜的操作.二.实验原理 作为染料必须具备两个条件：一是具有颜色；二是要与被染对象之间有亲和力。染料的颜色是由基本身的分子结构决定的，产生颜色的叫发色基团，具有成盐性质的叫助色基团。发色基团往往由硝基（-NO2）,偶氮基（-N=N-）,乙烯基等形成，而由OH,-COOH等酸性基团和-NH2,-NHCH3等碱性基团形成的助色基团，它们的存在使染料物质离子化，极性增强，促进染料与组织间发生作用，产生染色效果。我们把助色基团中具有酸性或碱性基团的染料分别称为酸性或碱性染料。作为染料，必须有发色基团和助色基团相互配合，缺一不可。如伊红有一个-COOH助色基团，在水中电离时放出氢离子，本身带负电荷，配制成伊红染料时，与强碱NaOH作用生成-COONa，此时的Na离子反而在溶液中呈碱性，所以不能认为酸性染料在溶液中就是酸性。所以酸性或者碱性染料的界定并非由染料溶液PH值决定的，而是根据染料物质中助色基团电离后的电荷来决定，一般来说，助色基团带正电荷的染料为碱性染料，助色基团带负电荷的染料为酸性染料。碱性染料PH一定大于7，酸性染料也不一定小于7. 碱性染料有美兰（亚甲蓝）、甲基紫、草酸铵结晶紫、醋酸洋红、碱性复红、中性红、孔雀绿和蕃红等，在一般的情况下，细菌易被碱性染料染色。酸性染料有伊红、刚果红、孟加拉红，藻红、苯胺黑、苦味酸和酸性复红等，可与碱性物质结合成盐。当培养基因糖类分解产酸使pH值下降时，氢离子浓度增加，细菌所带的正电荷增加，这时选择酸性染料，易被染色。1.单染色法:微生物不但个体微小,且无色半透明.要在显微镜下观察清楚,必须染上颜色 .微生物细胞中含有大量的蛋白质等一类两性电解质:在酸性溶液中结合质子带正电;在碱性溶液中给出质子而带负电.等电点一般在pH=25.所以,在中性,碱性或弱酸性溶液中,微生物细胞通常带负电荷.碱性染料在电离时,染色部分是带正电荷的,容易与带负电荷的菌体结合使之着色.经染色后的菌体细胞与背景形成鲜明的对比,在显微镜下很容易观察. 2.革兰氏染色法:革兰氏染色法将细菌分为G+和G- ,这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定.用结晶紫初染后,所有的细菌都染上蓝紫色.碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物,增强了染料与菌体的结合力.用乙醇脱色处理时,两类细菌的脱色效果是不同的.G+细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成,且壁厚,类脂含量低,用乙醇脱色时使细胞壁脱水,网状结构孔径缩小,通透性降低,使得结晶紫碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内.虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色.G-细菌则不同,由于其细胞壁肽聚糖层较薄,类脂含量高,所以在脱色处理时,类脂被乙醇溶解,细胞壁的通透性增大,使结晶紫碘的复合物比较容易被洗脱出来,用复染剂复染后,细胞被染上复染剂的颜色.三.实验器材1.显微镜,香柏油,接种环,酒精灯等. 2.结晶紫染液,碘液,95%乙醇,复红染液. 3.菌种:大肠杆菌,枯草芽孢杆菌.四.实验内容 (一) 单染色1.涂片 取一块载玻片,用记号笔划分出两区域并做上记号,在两区域中央各滴半滴无菌水,用接种环以无菌操作法分别取两种菌种在左右两滴水中,和匀后涂成薄膜. 2.干燥 室温自然干燥或吹干. 3.固定 涂面朝上,通过火焰23次. 4.染色 在涂片薄膜上滴加结晶紫染液,使之覆盖2分钟. 5.水洗 倾倒去染液,斜置载玻片,用洗瓶小水流沿玻片边缘冲洗,直至水呈无色为止. 6.干燥 室温自然干燥或用吸水纸吸干. (二)革兰氏染色完成单染色的16步骤后7. 媒染 加媒染剂碘液使之覆盖1分钟,水洗,吸水纸吸干. 8. 脱色 滴加95% 乙醇数滴使之覆盖16秒钟,立即水洗,吸干. 9. 复染 用沙黄(番红)液复染 2 分钟,水洗,吸干. (二) 镜检先分别用低倍镜和高倍镜找到要观察的样品区域后,用转换器将物镜转到空挡,在样品区域滴加香柏油,再将油镜慢慢转到工作位置浸入油中.若不清晰,慢慢转动微调直至清楚.油镜用完后,用镜头纸沾取乙醇-乙醚混合液檫拭油镜头.再用干的镜头纸檫干镜头.五.实验观察两种细菌的形态和颜色,绘出油镜下细菌形态图,说明革兰氏染色的结果.六.思考题通过实验,你认为革兰氏染色成功关键是那一步 为了避免假阳性或假阴性出现,在对未知菌种做革兰氏染色鉴定时,你认为应该怎样做实验三 玻璃器皿的清洗包扎灭菌一,目的要求1熟悉微生物实验常用的器皿的名称规格2.掌握器皿的清洗包扎方法.3.掌握干热灭菌方法和原理.二,基本原理为了保证实验顺利进行，要求把实验用器皿清洗干净，保持灭菌后的无菌状态，需要对器皿进行妥善包括。灭菌是指杀死或者消灭一定环境中的所有微生物，灭菌方法一般为物理和化学方法，本实验主要介绍物理方法即加热灭菌。包括干热和湿热。干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的.细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关,在菌体受热时,当环境和细胞内含水量越大,则蛋白质凝固就越快,反之含水量越小,凝固缓慢.因此,与湿热灭菌相比,干热灭菌所需温度高(160170),时间长(12小时).但干热灭菌温度不能超过170,否则,包器皿的纸或棉塞就会烤焦,甚至引起燃烧.如果对器皿进行烘干一般120半小时即可。冷却到60度打开取出。三,器材培养皿,试管,吸管,电烘箱, ,培养皿(10套一包),等.四,操作步骤清洗方法1，任何洗涤方法，都不应对器皿有所损伤，不能用化学药剂，不能用比玻璃硬度更大的的物品来擦拭。2 一般新的玻璃器皿用2%的盐酸浸泡数小时，用水冲洗干净。难洗的和易洗不能放一起，不要接触一些强酸强碱等，一般器皿能用洗衣粉肥皂清洗包扎：包扎三根吸管，10个培养皿，三根装有9毫升水的试管，1瓶装有50毫升的烧瓶干热灭菌1.装入待灭菌物品将包好的待灭菌物品(培养皿,试管,吸管等)放入电烘箱内,物品不要摆得太挤,以免妨碍热空气流通.同时,灭菌物品也不要与电烘箱内壁的铁板接触,以防包装纸烤焦起火.2.升温关好电烘箱门,插上电源插头,拨动开关,旋动恒温调节器至红灯亮,让温度逐渐上升.如果红灯熄灭,绿灯亮,表示箱内已停止加温,此时如果还未达到所需的160170温度,则需转动调节器使红灯再亮,如此反复调节,直至达到所需温度.3.恒温当温度升到160170时,借恒温调节器的自动控制,保持此温度2小时. 4.降温切断电源,自然降温. 5.开箱取物待电烘箱内温度降到70以下后,打开箱门,取出灭菌物品.注意电烘箱内温度未降到70以前,切勿自行打开箱门,以免玻璃器皿炸裂.五,实验报告五实验报告1玻璃器皿清洗注意事项2干热灭菌原理条件思考题 (1)干热灭菌完毕后,在什么情况下才能开箱取物 为什么 (2)为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高,时间长 (3)高压蒸汽灭菌开始之前,为什么要将锅内冷空气排尽 灭菌完毕后,为什么要待压力降到0时才能打开排气阀,开盖取物 (4)在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时,怎样杜绝一切不安全的因素实验四 培养基的制备与灭菌一、目的要求1明确培养基配制原理2掌握培养基配制方法步骤以及湿热灭菌原理方法。二、基本原理培养基是供微生物生长、繁殖和代谢的营养基质。培养基中一般含有微生物必须的碳源、氮源、能源、无机盐及水分等。正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。由于微生物种类及代谢类型的多样性因而用于培养微生物的培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异。但一般培养基的配制程序却大致相同例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。培养基配制完成进行分装后需进行高压蒸汽灭菌，高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内,通过加热,使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽.待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽,然后关闭排气阀,继续加热,此时由于蒸汽不能溢出,而增加了灭菌器内的压力,从而使沸点增高,得到高于100的温度.导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的.在同一温度下,湿热的杀菌效力比干热大,其原因有三:一是湿热中细菌菌体吸收水分,蛋白质较易凝固,因蛋白质含水量增加,所需凝固温度降低(表-2),二是湿热的穿透力比干热大;三是湿热的蒸汽有潜热存在,每1克水在100时,由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量.这种潜热,能迅速提高被灭菌物体的温度,从而增加灭菌效力.在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时,灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要,因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压,所以,当水蒸汽中含有空气时,在同一压力下,含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度.灭菌锅内留有不同分量空气时,压力与温度的关系见表-4.压力数MpaKg/cm2Ib/in2全部空气排出时的温度/2/3空气排出时的温度/1/2空气排出时的温度/1/3空气排出时的温度/空气全不排出时的温度/0.03 0.35 5108.81009490720.07 0.70 10115.6109105100900.10 10.5 15121.31151121091000.14 1.40 20126.21211181151090.17 1.75 25130.01261241211150.21 2.10 30134.6130128126121一般培养基用1.05kg /cm2,121.31530分钟可达到彻底灭菌的目的.灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变.例如含糖培养基用0.56kg/cm2(8磅/英寸2),112.6灭菌15分钟,但为了保证效果,可将其他成分先行121.3,20分钟灭菌,然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液.又如盛于试管内的培养基以1.05kg/cm2,121.3灭菌20分钟即可,而盛于大瓶内的培养基最好以1.05kg/cm2灭菌30分钟.实验室中常用的高压蒸汽灭菌锅有立式,卧式和手提式等几种.本实验介绍手提式和立式高压蒸汽灭菌锅的使用方法. (二)高压蒸汽灭菌1.首先将内层灭菌桶取出,再向外层锅内加入适量的水,使水面与三角搁架相平为宜. 2.放回灭菌桶,并装入待灭菌物品.注意不要装得太挤,以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果.三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触,以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞.3.加盖,并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内.再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓,使螺栓松紧一致,勿使漏气.4.用电炉或煤气加热,并同时打开排气阀,使水沸腾以排除锅内的冷空气.待冷空气完全排尽后,关上排气阀,让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升.当锅内压力升到所需压力时,控制热源,维持压力至所需时间.本实验用 1.05kg/cm2,121.3,20分钟灭菌.5.灭菌所需时间到后,切断电源或关闭煤气,让灭菌锅内温度自然下降,当压力表的压力降至0时,打开排气阀,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品.如果压力未降到0时,打开排气阀,就会因锅内压力突然下降,使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口,造成棉塞沾染培养基而发生污染.6.将取出的灭菌培养基放入 37温箱培养24小时,经检查若无杂菌生长,即可待用.三、实验材料药品：待配各种培养基的组成成分、琼脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。仪器及玻璃器皿：天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿、玻璃漏斗等。其他物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花等。四、操作步骤（一）玻璃器皿的洗涤和包装（二）液体及固体培养基的配制过程1液体培养基配制称量：一般可用0.01g天平称量配制培养基所需的各种药品，先按培养基配方计算出各成分的用量然后进行准确称量。溶解：将称好的药品置于一烧杯中，先加入少量水(根据实验需要可用自来水或蒸馏水)，用玻璃棒搅动，加热溶解。定容：待全部药品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需体积。如某种药品用量太少时，可预先配成较浓溶液，然后按比例吸取一定体积溶液，加入至培养基中。调pH：一般用pH试纸测定培养基的pH。用剪刀剪出一小段pH试纸，然后用镊子夹取此段pH试纸，在培养基中蘸一下，观看其pH范围，如培养基偏酸或偏碱时，可用1mol/L NaoH或1mol/L HCl溶液进行调节。调节pH时，应逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用pH试纸测试，直至达到所需pH为止。过滤：用滤纸或多层纱布过滤培养基。一般无特殊要求时，此步可省去。2固体培养基的配制 配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基加热煮沸，再将称好的琼脂(1.52)加入，并用玻棒不断搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，最后补足因蒸发而失去水分。（三）培养基的分装 根据不同需要，可将已配好培养基分装入试管或三角瓶内，分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培养基沾污管口或瓶口时，可用镊子夹一小块脱脂棉，擦去管口或瓶口的培养基，并将脱脂棉弃去。1试管的分装取一个玻璃漏斗，装在铁架上，漏斗下连一根橡皮管，橡皮管下端再与另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一弹簧夹。分装时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃管嘴插入试管内，以右手拇指及食指开放弹簧夹，中指及无名指夹佐玻璃管嘴，使培养基直接流入试管内。装入试管培养基的量视试管大小及需要而定，若所用试管大小为15150 mm时，液体培养基可分装至试管高度14左有为宜；如分装固体或半固体培养基时，在琼脂完全融化后，应趁热分装于试管中。用于制作斜面的固体培养基的分装量为管高15(约34mI)，半固体培养基分装量为管高的13为宜。2三角瓶的分装 用于振荡培养微生物时，可在250 m1三角瓶中加入50 m1的液体培养基；若用于制作平板培养基用时，可在250 m1三角瓶中加入150ml培养基，然后再加入3g琼脂粉(按计算)，灭菌时瓶中琼脂粉同时被融化。（四）棉塞的制作及试管、三角瓶的包扎 为了培养好气性微生物，需提供优良通气条件，同时为防止杂菌污染，则必须对通入试管或三角瓶内空气预先进行过滤除菌。通常方法是在试管及三角瓶口加上棉花塞等。1试管棉塞的制作制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的团孔上，用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞然后直接压入试管或三角瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折叠卷塞法制作棉塞。制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的23在试管内，13在试管外。目前也有采用硅胶塞代替棉塞直接盖在试管口上。将装好培养基并塞好棉塞或硅胶塞的试管捆成一捆，外面包上一层牛皮纸。用记号笔注明培养基名称及配制日期，灭菌待用。图8-3 棉塞的制作图8-4 正确与不正确的棉塞1.金属塞 2正确 3、4不正确2三角瓶棉塞制作通常在棉塞外包上一层纱布，再塞在瓶口上。有时为了进行液体振荡培养加大通气量，则可用8层纱布代替棉塞包在瓶口上，目前也有采用硅胶塞直接盖在瓶口上。在装好培养基并塞好棉塞或包扎八层纱布或盖好硅胶塞的三角瓶口上，再包上一层牛皮纸并用线绳捆好，灭菌待用。（五）培养基的灭菌培养基经分装包扎后，应立即按配制方法规定的灭菌条件进行进行高压蒸汽灭菌。（六）斜面和平板的制作1斜面的制作将已灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒或玻棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面。斜面长度不超过试管长度l2为宜。如制作半团体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至凝固。2平板的制作将装在三角瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，待冷至50左右倾入无菌培养皿中。温度过高时，皿盖上的冷凝水太多；温度低于50，培养基易于凝固而无法制作平板。平板的制作应在火旁进行，左手拿培养皿，右手拿三角瓶的底部或试管，左手同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入1015mL培养基，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿中，冷凝后即成平板。（七）培养基的灭菌检查灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好取出12管(瓶)，置于37温箱中培养12天，确定无菌后方可使用。（八）无菌水的制备在每个250mL的三角瓶内装100mL的蒸馏水并塞上棉塞或硅胶塞。在每支试管内装4.5mL蒸馏水，塞上棉塞或硅胶塞。再在棉塞上包上一张牛皮纸，高压蒸汽灭菌。0.1MPa灭菌2030min。五、实验内容根据要求清洗各种玻璃器皿，并进行包扎。根据要求配制各种培养基。用电热鼓风干燥箱对玻璃器皿进行干热灭菌。用高压蒸汽灭菌锅对所配各培养基灭菌。六、实验报告简述移液管和培养皿的包扎注意事项。简述配制培养基的基本步骤及注意事项。为什么微生物实验室所用的移液管口或滴管口的上端均需塞入一小段棉花，再用报纸包起来，经高压蒸汽灭菌后才能使用?为什么微生物实验室所用的三角瓶口或试管口都要塞上棉塞（硅胶塞）才能使用？配制培养基时为什么要调节pH？高压蒸汽灭菌为什么比干热灭菌要求温度低、时间短？附录 灭菌技术一、目的要求了解消毒和灭菌的原理，并掌握各种灭菌方法的操作步骤。二、实验材料仪器或其他用具：上述包扎的培养皿、试管、移液管等，电热鼓风干燥箱，高压蒸汽灭菌锅，微孔滤膜过滤器，0.22m滤膜，注射器，镊子，玻璃涂棒。培养基：上述配制的培养基及生理盐水三、基本原理在微生物实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此必须对所用器材、培养基和工作场所进行灭菌和消毒。灭菌是指杀死一定环境中的所有微生物，包括微生物的营养体、芽孢和孢子。实验室常用的灭菌方法包括直接灼烧、恒温干燥箱灭菌、高压蒸汽灭菌、间歇灭菌、煮沸灭菌等方法。这些方法的基本原理是通过加热使微生物体内蛋白质凝固变性，从而达到灭菌的目的。四、操作步骤（一）干热灭菌法干热灭菌是在电热干燥箱内利用高温干燥空气（160170）进行灭菌，它是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌目的。此法适用于玻璃器皿如移液管、试管和培养皿的灭菌。培养基、橡胶制品、塑料制品不能采用干热灭菌。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160170），时间长（12h）。但干热灭菌温度不能超过180，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。干热灭菌使用的是电热干燥箱（干燥箱）。具体操作步骤如下：装入待灭菌物品：将包好的待灭菌物品放入电热干燥箱内，关好箱门。堆积时要留有空隙，物品不要摆放得太挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要接触电热干燥箱内壁的铁板、温度探头，以防包装纸烤焦起火。升温：接通电源，打开开关，适当打开电热干燥箱顶部的排气孔，旋动恒温调节器，使温度逐步上升。当温度升至100时，关闭排气孔。在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示电热干燥箱内停止加温，此时如果还未达到所需的160170，则需要转动温度调节器使红灯亮，如此反复调节，直至达到所需的温度。恒温：当温度升到160170时，借助恒温调节器的自动控制，保持此温度2h。干热灭菌过程中，严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。降温：切断电源，自然降温。开箱取物：待电热干燥箱内温度降到60以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。同时，应将温度调节旋钮调到零点，并打开排气孔。电热干燥箱内温度未降到60以前，切勿自行打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。（二）高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内，在一定的压力下保持1530分钟进行灭菌。此法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅夹套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中排尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，获得高于100的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在相同的温度下，湿热灭菌的效果好于干热灭菌。有三点原因：在湿热灭菌中菌体吸收水分，蛋白质容易凝固变性，蛋白质随着含水量的增加，所需凝固温度降低；湿热灭菌中蒸汽的穿透力比干燥空气大；蒸汽在被灭菌物体表面凝结，释放出大量的汽化潜热，能迅速提高灭菌物体表面的温度，从而增加灭菌效力。实验室常用的灭菌锅有非自控手提式高压蒸汽灭菌锅和自控式灭菌锅，其结构和工作原理是相同的。本实验介绍的是非自控手提式高压蒸汽灭菌锅，自控式灭菌锅的使用可参考厂家说明书。具体操作步骤如下：加水：首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面没过加热蛇管，与三角搁架相平为宜。切勿忘记检查水位，加水量过少，灭菌锅会发生烧干引起炸裂事故。装料：放回内层锅，并装入待灭菌的物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包扎的纸而透入棉塞。加盖：将盖上与排气孔相连的排气软管插入内层锅的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气，并打开排气阀。排气：打开电源加热灭菌锅，将水煮沸，使锅内的冷空气和水蒸汽一起从排气孔中排出。一般认为当排出的气流很强并有嘘声时，表明锅内的空气已排尽，沸腾后约需5分钟。升压：冷空气完全排尽后，关闭排气阀，继续加热，锅内压力开始上升。保压：当压力表指针达到所需压力时，控制电源，开始计时并维持压力至所需的时间。如本实验中采用0.1Mpa，121.5，20分钟灭菌。灭菌的主要因素是温度而不是压力，因此锅内的冷空气必须完全排尽后，才能关闭排气阀，维持所需压力。降压：达到灭菌所需的时间后，切断电源，让灭菌锅温度自然下降，当压力表的压力降至“0”后，方可打开排气阀，排尽余下的蒸汽，旋松螺栓，打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。压力一定要降到“0”后，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基或试剂由于内外压力不平衡而冲出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼伤操作者。无菌检查：将已灭菌的培养基放入37恒温培养箱培养24h，检查无杂菌生长后，即可使用。（三）过滤除菌有些物质，如抗生素、血清、维生素、糖溶液等采用加热灭菌法时，容易受热分解而被破坏，因而要采用过滤除菌法。过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法，该方法最大的优点是不破坏溶液中各种物质的化学成分。过滤除菌法除实验室用于溶液、试剂的除菌外，在微生物工作中使用的净化工作台也是根据过滤除菌的原理设计的，可根据不同的需要来选用不同的滤器和滤板材料。应用最广泛的过滤器种类有：微孔滤膜过滤器：是一种新型过滤器，它由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑料盒组成，出口处可连接针头，入口处可连接针筒，使用时将滤膜装入两塑料盒之间，旋紧盒盖，当溶液从针筒注入滤器时，各种微生物被阻留在微孔滤膜上面，而液体和小分子物质通过滤膜，从而达到除菌的目的。其滤膜是由硝酸纤维素、醋酸纤维素等制成的薄膜，有孔径大小不同的多种规格（如0.1m、0.22m、0.3m、0.45m等），实验室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般为0.22m。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。该滤器的优点是吸附性小，即溶液中的物质损耗少，过滤速度快，每张滤膜只使用1次，不用清洗。蔡氏（Seitz）过滤器：是一种金属制成的过滤漏斗，其过滤部分是一种用石棉纤维和其他填充物压制成的片状结构。溶液中的细菌通过石棉纤维的吸附和过滤而被去除，但对溶液中其他物质的吸附性也大，每张纤维板只能使用1次。玻璃过滤器：是一种玻璃制成的过滤漏斗，其过滤部分是由细玻璃粉烧结成的板状构造。玻璃滤器的规格很多，5号（孔径25m）和6号（孔径2m）适用于过滤细菌，其优点是吸附量少，但每次使用后要洗净再用。本实验采用微孔滤膜过滤器进行过滤除菌，具体操作步骤如下：组装、灭菌：将0.22m孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧压平，包装灭菌后待用（0.1Mpa，121.5，灭菌20分钟）。连接：将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作方式连接于装有待滤溶液的注射器上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。压滤：将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤入过滤到无菌试管中，滤毕，将针头拔出。压滤时用力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过滤膜。无菌检查：无菌操作吸取除菌滤液0.1mL于肉汤蛋白胨平板上，均匀涂布，置37恒温培养箱培养24小时，检查是否有杂菌生长。清洗：弃去塑料滤器上的微孔滤膜，将塑料滤器清洗干净，并换上一张新的微孔滤膜，组装包扎，再经灭菌后使用。整个过程应严格按照无菌操作，以防污染，过滤时应避免各连接处出现渗透现象。实验五 土壤微生物的分离纯化一、 实验目的1 了解土壤微生物培养基的分离纯化的基本原理。2 学习并掌握微生物分离纯化技术方法。3 学习并掌握微生物培养基平板菌落计数的技术方法。二实验原理土壤是微生物生活的大本营，是微生物生长和栖息的良好基地，土壤具有绝大多数微生物生活所需的各种条件，是自然界微生物生长繁殖的良好基地。因此，土壤是微生物资源的巨大宝库。其中含有大量不同类型的微生物培养基，可按照一定的方法将各类微生物通过分离进行纯培养，并能对特定类群进行数量测定。基本原理是通过稀释使菌体细胞充分分散，单细胞得以生长发育形成菌落，可使用稀释法或平板划线法进一步纯化，还可通过平板菌落计数，推算单位重量土壤样品含有微生物的数量。牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，可用于培养细菌。 链霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，对酵母菌和霉菌不起作用。加入一定量链霉素的培养基可以从混杂的微生物群体中分离出酵母菌和霉菌。重铬酸钾或苯酚对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用，可用于选择分离放线菌。一、 实验器材1、材料：10cm左右深层土壤。2、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基、高氏号培养基3、其他物品：试管、三角瓶、烧杯、量筒、电子天平、精密pH试纸、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、移液枪、枪头、接种环、酒精灯、链霉素(1万单位/ml) 、10%苯酚 、无菌水。二、 实验步骤1、土样采集：取10cm左右深层土壤10g备用。2、制备土壤稀释液：称取土壤1g，放入有99mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀，即为稀释102的土壤悬液。然后进行十倍梯度稀释，依次制备 103、104、105、106 、107 稀释度的土壤稀释液。 3、培养基平板制备：按培养基配方各配置牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基、高氏号培养基各100ml。灭菌后分别倒3个平板。（高氏号培养基灭菌前加入10滴10%苯酚；马丁氏培养基倒平板前加入2ml去氧胆酸钠(2%)和0.4ml 1万单位/ml链霉素）4、接种：用无菌吸管吸取0.1ml相应浓度土壤稀释液，以无菌操作技术接种在平板上，涂布均匀。细菌选用104、105、106 三个稀释度接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，放线菌与霉菌选用102 、103、104 三个稀释度，分别接种于高氏号培养基、马丁氏培养基。（一个稀释度一个平板）5、培养：细菌平板于37恒温培养12d，放线菌于30培养23d，霉菌于30培养35d ，观察。6、计数：用稀释水样检测平板的菌落计数方法进行计数，报告细菌总数/(CFUml-1)7、纯化：挑取典型菌落接种于相应平板，培养条件同上，培养纯化。8菌落特征鉴定：细菌：小而突起，大而平坦，透明或半透明，易挑取，粘稠，有臭味，质地均匀菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致，圆形菌落，颜色有白色、黄色等。放线菌：正面有白点而且正背面颜色不同，干燥，小而紧密，与培养基结合牢固（难以挑取），不透明，泥香味，菌落背面有同心圆形纹路。这点可以和细菌菌落区分。酵母菌：菌落为淡黄色，光滑，半透明，比细菌菌落大。霉菌：有菌丝，干燥，大而疏松，有霉味而且透明，菌落大型，肉眼可见许多毛状物，如绒毛状或棉絮状，棕色、青色等，可见黑色的分生孢子群。菌落最初往往是浅色或白色，当菌落上长出各种颜色的孢子后，由于孢子有不同形状、构造和色素，菌落表面常出现肉眼可见的不同的结构和色泽，如黄、绿、青、黑、橙等各色。有的霉菌由于产生的色素能扩散到培养基内，使培养基正面和反面显示出不同颜色，故菌落特征也是鉴定霉菌的主要依据之三、 思考题1、分离放线菌和真菌为什么需要分别加重铬酸钾和链霉素？2、怎么检验培养皿上的某个单菌落是不是纯培养？实验六 水中细菌总数测定一、目的要求l学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。2了解平板菌落计数的原则。二、基本原理本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。三、器材l培养基肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌水。2.仪器或其他用具灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。四、操作步骤l水样的采取(1)自来水先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。(2)池水、河水或湖水应取距水面l015cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。2细菌总数测定(1)自来水用灭菌吸管吸取lml水样，注入灭菌培养皿中。共做两个平皿。分别倾注约15mL己溶化并冷却到45左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL作空自对照。培养基凝固后，倒置于37温箱中，培养24h，进行菌落计数。两个平板的平均菌落数即为lml水样的细菌总数。(2)池水、河水或湖水等稀释水样取3个灭菌空试管，分别加入9ml灭菌水。取lml水样注入第一管9ml灭菌水内、摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10-1、10-2与10-3。稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。一般中等污秽水样，取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度，污秽严重的取10-2、10-3、10-4三个连续稀释度。自最后三个稀释度的试管中各取lmL稀释水加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。各倾注15ml已溶化并冷却至45左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即放在桌上摇匀。凝固后倒置于37培养箱中培养24h。3菌落计数方法(1)先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。(2)首先选择平均菌落数在30300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数(见表1，例1)。(3)若有两个稀释度的平均菌落数均在30300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中较小的菌落总数(见表l，例2及例3)。(4)若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数(见表l，例4)。(5)若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数(见表l，例5)。(6)若所有稀释度均无菌落生长，刚应按1乘以最低稀释度倍数报告（表1中例6）(7)若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数(见表1，例7)。补充1 菌落数在100以内时，按四舍五入原则修约，采用两位有效数字报告。2大于或等于100时，第三位采用四舍五入原则修约后，取前两位数字后面用0代替位数，也可用10的指数形式来表示，按四舍五入修约后，采用两位有效数字。3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。4若空白对照上有菌落生长，则此次检验结果无效。5称重取样以cfu/g为单位报告，体积取样以cfu/mL为单位报告.表1稀释度选择及菌落数报告方式例次稀释液及菌落数两稀释液之比菌落总数n/或n/mL报告方式n/g或n/mL10-110-210-311365164201640016000或1.6*10422760295461.63775038000或3.8*10432890271602.22710027000或2.7*1044多不可计4650513513000510000或5.1*105527115270270或2.7*10260001*10107多不可计305123050031000或3.1*104五、实验报告（水中细菌国家标准是100/ml）1将实验测出的样品数据以报表方式报告结果2样品中菌落是否符合国家卫生标准。综合实验 生物、化学抑菌剂对细菌生长的影响一实验目的：1掌握化学因素、生物因素对微生物生长的影响的原理。2熟悉微生物的接种方法。二实验原理：微生物的生命活动是由其细胞内外一系列物化环境系统统一体所构成的，除营养条件外，影响微生物生长的环境因素，包括物理因素、化学因素和生物因素对微生物的生长繁殖、生理生化过程均能产生很大影响，总之一切不良的环境条件均能使微生物的生长受抑制，甚至导致菌体死亡。物理因素如温度，渗透压，紫外线等，对微生物的生长繁殖新陈代谢过程产生重大影响，甚至导致菌体的死亡。不同的微生物生长繁殖所需要的最适温度不同，根据微生物生长的最适温度的范围，分为高温菌，中温菌和低温菌。自然界中绝大多数微生物中属于中温菌。不同的微生物对高温的抵抗力不同，芽孢杆菌的芽孢对高温有较强的抵抗能力。渗透压对微生物的生长有重大的影响。等渗溶液适合微生物的生长，高渗溶液可使微生物细胞脱水发生质壁分离，而低渗溶液则会使细胞吸水膨胀，甚至可能使细胞破裂。紫外线主要作用于细胞内的DNA，使同一条链的DNA相邻嘧啶间形成的腺嘧啶二聚体。引起双链结构的扭曲变形，阻碍剪辑的正常配对，从而抑制DNA的复制，轻则使微生物发生突变，重则造成微生物的死亡。紫外线照射的量与所用紫外灯光的功率、照射距离和照射时间有关。紫外线光灯照射距离固定、照射的时间越长，则照射剂量越高。紫外线透过物质的能力弱，一层纸足以挡住紫外线的透过。环境因素中的化学因素和生物因素，如化学药品、PH、氧、微生物间的拮抗作用和噬菌体，对微生物的生长有不同的影响化学药品中的抑菌剂或杀菌剂，有抑菌作用或杀菌作用。本实验选数种常用的药物，以实验其抑菌效能和同一药物对不同的抑制效力。微生物作为一个群体，其生长的PH范围很广，但绝大多数种类都在PH59之间，而每种微生物都有生长的最高、最低和最适PH。根据微生物对氧的需求，可把微生物分为需氧微生物和厌氧微生物量大类。在半固体深层培养基管中，穿刺接种上述对氧需求不同的细菌，适温培养后，各类细菌在半固体深层培养基中的生长情况各有不同。需氧微生物生长在表面厌氧微生物生长在培养基广的底部，兼性微生物按照其好氧的程度生长在培养基的不同深度。物理因素PH通过影响细胞质膜的通透性，膜结构的稳定性和物质的溶解性或电离性来影响营养物质的吸收，从而影响微生物的生长速率。化学因素结晶紫（染料）通过诱导细胞裂解的方式杀死细胞。化学药剂对微生物生长的影响化学药剂对微生物的作用取决于药剂浓度、作用时间和微生物对药物的敏感性。1重金属及其化合物 重金属离子尤其是Hg+、 Ag+和CU2+具有很强的杀菌力。重金属离子进入细胞后主要与酶或蛋白质上的-SH基结合而使之失活或变性。微量的重金属离子还能在细胞内不断累积并最终对生物发生毒害作用，此即微动作用。2卤化物 杀菌力高低顺序是：FCLBrI，最常用的是碘和氯。碘 碘不可逆地与菌体蛋白质（或酶）的酪氨酸结合，生成二碘酪氨酸，使菌体失活。常用于皮肤消毒。氯 氯与水结合成次氯酸，后者易分解产生新生态氧，为强氧化剂。Cl2+H2OHCl+HClO HClOHCl+O常用于饮水和游泳池水消毒。3有机化合物 常用作杀菌剂的有机化合物是酚、醇、醛和有机酸等。酚及其衍生物 酚类化合物的作用主要是损伤微生物的细胞膜，钝化酶和使蛋白质变性。酚系数被广泛用作比较化学药剂杀菌效力的标准。甲酚是酚的衍生物，杀菌力比酚强几倍。乳化的甲酚溶液即煤酚皂液（俗称来苏尔）。醇类 通过溶解细胞壁和膜中的类脂，破坏膜结构及使蛋白质脱水变性，而起杀菌作用。醇类的杀菌力，随分子量增大而增强，但丙醇以上的醇不易与水相混，所以一般不作消毒剂。甲醇杀菌力较乙醇差，且对人尤其对眼有害，也不适于作消毒剂。70的乙醇，杀菌效果最好。醛类 能与蛋白质氨基酸中的多种基团共价结合而使其变性，是常用的杀细菌与杀真菌剂。福尔马林溶液即3740的甲醛水溶液。10的甲醛溶液熏蒸厂房、无菌室以及传染病患者的住房等，消毒效果较好。酸类 有机酸能抑制微生物（尤其是霉菌）的酶和代谢活性，常加在食品、饮料或化妆品中以防止霉菌等微