绪论(医学细胞生物学).ppt

1,新兴职业学院 张承建,第1章 绪 论,3,细胞:是生物体结构和功能的基本单位。 细胞生物学(cell biology) 从细胞水平（整体、亚微结构、分子）探讨生命活动规律的科学。,医学细胞生物 学(medical cell biology)： 运用细胞生物学的理论和方法，研究人体的细胞的形态结构和功能等生命活动规律和人类疾病发生、发展及其防治的科学。,第一节细胞学与细胞生物学,自然界千姿百态，生物包罗万象，中学我们学习的是科普知识现在我们是系统性深入学习，目的是为今后的医学理论和实践打下坚实基础。 1665年英国生物学家胡克发现了细胞，随后学者们建立了传统细胞学：研究细胞化学、组织学、形态结构、及功能的学科。 科学进步，设备发展，技术更新，各学科胶着渗透，致使细胞学研究发生了质的改变。表现在整体到微观、形态到功能、表象到本质、临床到机制等各个方面。细胞生物学是：应用现代物理化学、分子生物学方法技术，从细胞整体，显微、到亚显微和分子水平上研究细胞结构、功能及生命活动规律的学科。其内容包括质膜、细胞质和细胞核的结构功能及其相互关系，细胞总体和动态的功能活动（生长、分裂、分化、生殖、遗传等）以及这些相互关系和功能活动的分子基础。,2019/3/8,细胞生物学的重要性主要在于，细胞生物学和分子生物学之间；分子生物学和个体生物学之间；相互衔接相互渗透，它们之间的关系对今天的医学，药物学，生物化学等生命学科起着核心支柱，承上启下的重要作用。 医学细胞生物学：是应用细胞生物学的理论和方法，研究人体细胞核形态结构与功能活动规律和人类疾病发生，发展及其防治的学科。,2019/3/8,第二节、细胞生物学的发展史（五个阶段）,一、萌芽阶段 1590年荷兰人发明显微镜 1665年英国人发现细胞 1673年1677年发现一些细胞器结构 这一时期，设备和技术的发展缓慢，所以只是萌芽阶段。 二、学说建立阶段 1839年德国植物学家总结：一切生物由细胞组成，细胞是生物的形态结构和功能活动的基本单位。 1858年德国病理学家提出：机体的一切病理表现都给予细胞的损伤。 以上的要点在：生物是细胞组成，是多细胞生物的基本单位。细胞是生物的结构和功能单位。细胞来源与细胞。 三、经典细胞学阶段 主要是原生质学说的建立，发现了各种细胞器和观察到多种细胞生理现象，如受精、分裂、分化等现象，人们的认识达到了新的水平。,2019/3/8,7,对象：细胞（cell，生命活动的基本单位）,构成生物有机体 代谢与功能 生物有机体生长发育 遗传（遗传全能性）,细胞是,一、细胞生物学研究的内容,研究水平： 细胞整体、亚微结构、分子水平,利用光镜描述细胞的结构 利用电镜或扫描探针探清细胞的亚微或分子结构,研究任务：,9,二、细胞生物学的发展历史,(一)细胞的发现和细胞学说的创立,(四)分子生物学的发展,(二)经典细胞学的发展,(三)实验细胞学的发展,10,细胞学说,细胞学说（cell theory） ：细胞是一切生物体构造和功能上的基本单位，整个机体是由细胞和细胞的产物所组成。,11,12,三、细胞生物学的主要分支学科,细胞形态学（形态和功能） 细胞化学（化学成分定位、分布及生理功能） 细胞生理学（生命活动规律） 细胞遗传学（染色体的结构功能） 分子细胞学（基因组的结构和功能） 细胞社会学（细胞识别、通讯及相互作用）,13,一、细胞形态结构研究技术,（一）细胞显微结构研究的技术与方法,第二节 细胞生物学研究方法概述,光学放大系统,照明系统,机械和支架系统,显微结构,14,尼康E-600显微镜,1.复式显微镜 ： 单筒目镜、双瞳目镜 最常用,2.暗视野显微镜： 利用被检物所反射或衍射的光线来观察标本 观察细菌、原生动物或提纯的细胞器等颗粒物质。,16,细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。,3.荧光显微镜,尼康E800荧光DIC显微镜,17,线粒体,干细胞,皮肤,微管,4.相差显微镜： 利用光线通过不同物质所形成的反差来观察标本 观察活细胞的细微结构和变化。,链球菌形态,20,莱卡倒置显微镜,组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。,5.倒置显微镜,21,6.共聚焦显微镜,无法用眼睛直接观察，只能用探测器收集每个像素点的信号，再通过软件重构图像。 分辨率比普通显微镜有少量提高。,22,电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的是前者用电子束作光源，用电磁场作透镜。另外，由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍，由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。,（二）细胞超微结构研究的技术与方法,常用电子显微镜和X射线衍射仪。,23,JEM-1011透射电子显微镜,在光学显微镜下无法看清小于0.2m的细微结构，这些结构称为亚显微结构或超微结构。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。1932年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜，电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。目前TEM的分辨力可达0.2nm。,1.透射电子显微镜,内质网透射电镜图,25,于20世纪60年代问世，用来观察标本的表面结构。其工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。,2.扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）,26,JEOL扫描电子显微镜,人类血细胞SEM照片,（1）组织分离法 （2）细胞培养法 （3）超薄切片法 （4）悬滴-复染法与喷镀法 （5）冷冻蚀刻复型法 （6）放射性核素电竞自显影技术,3.电镜样品的制备,二、细胞培养及相关技术,（一）体外细胞培养技术,（二）细胞融合技术,（三）细胞显微操作技术,30,三、细胞及亚细胞组分的分离和纯化技术,（一）细胞化学免疫荧光技术 细胞化学: 在保持细胞结构的基础上，利用某些化学物质可与细胞内某些成分发生化学反应，在局部形成有色沉淀物的原理，以示待查物质存在于细胞中的部位。 例如：Feulgen法显示DNA,31,免疫细胞化学（immunocytochemistry）: 根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。,抗原：大分子或与大分子相结合的小分子。 抗体：由浆细胞针对特定的抗原分泌的球蛋白。,如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。,32,（二）细胞显微分光光度测定技术 根据细胞内某些物质对光谱吸收的原理，用以测定这些物质如核酸和蛋白质等生物大分子在细胞内的含量。 吸收光谱的波长： 230 700nm Feulgen染色后的DNA吸收的波长：546nm 细胞显微分光光度测定技术：定位和定量,33,（三）流式细胞计量术（FCM） 用氩离子激光发出的激光束为激发光，通过调节液压，迫使悬浮的细胞排成单列，按重力方向流动，当细胞通过激光束检测区时，细胞被激光束照射而向各个方向发出散射光，若经荧光染色的细胞，就会发出一定强度的荧光，仪器的检测系统，就可逐个对细胞的散射光和荧光强度进行测定，并将光信号转变成电信号，由电子控制台放大和显示。,34,测量速度：5 000个细胞/s 8个相关参数 分选出细胞纯度：9099% 检测的参数：细胞大小、体积、DNA、RNA、总蛋白含量、表面抗原、受体、染色体等 应用：细胞动力学、免疫学、体细胞学、肿瘤的诊断和治疗等。,流式细胞仪特点,35,36,37,38,（四）放射自显影术 （五）细胞器的分离与提纯技术,39,四、细胞分子生物学技术 （一）细胞原位分子杂交技术,分子杂交的基本原理：碱基的互补配对,原位杂交（in situ hybridization）： 将细胞或组织切片固定在载玻片上，保持细胞中的 DNA和RNA在原位置条件下，与标记的 DNA或RNA分子探针进行原位杂交，通过放射性自显影或显微镜可探测到待查材料中被杂交的分子。直接进行基因定位、定量分析。,40,原位杂交的特点:杂交在显微镜载玻片上中期染色体标本上进行。所谓原位即指标本上DNA原位变性，在利用放射性或非放射性标记的已知核酸探针杂交后，通过放射自显影或非放射性检测体系来检测染色体上特异DNA或RNA顺序，可用放射性颗粒在某条染色体的区带出现的最高频率或荧光的强弱来确定探针的位置，从而进行准确的基因定位。 原位杂交必须在已知探针的情况下方可进行，而在未知致病基因时，则无法进行基因定位。,41,荧光原位杂交 （florescence in situ hybridization, FISH） 是一种非放射性原位杂交方法。用特殊荧光素标记核酸（DNA）探针，可在染色体、细胞和组织切片标本上进行DNA杂交，对检测细胞内DNA或RNA的特定序列存在与否最为有效。探针不是放射性的而是将荧光染料与抗体蛋白结合进行检测。它们具有高度亲和力，有与放射性探针相同或更高的分辩率。,42,固定生物样本并准备显微镜涂片 预先调节显微镜 标记探针 对目标DNA进行变性 进行原位杂交和杂交后洗涤 免疫细胞化学染色 显微镜观察,荧光原位杂交（FISH）实验程序 （是一种多步骤的实验方法）,43,现已可用不同的荧光染料同时进行多重原位杂交，显示出不同的荧光色泽。这种多色FISH技术近年来发展迅速，已成为基因定位作图和医学诊断的重要手段。 1992年运用这种策略已能在中期染色体和间期细胞同时检测7个探针。科学家们的目标是实现24种不同颜色来观察22条常染色体和X、Y染色体。,44,利用FISH技术检测染色体易位,45,46,DNA探针技术 1.是以已知DNA片段作为探针与待测样品DNA或其片段进行核酸分子杂交，判断二者同源性程度。 2.根据杂交结果就可以分析待测DNA中有无该基因或该基因是否发生了变化，从而作出诊断。 3.DNA探针（基因探针）是一段与目的基因相互补的核酸序列（DNA或RNA），其长度不一，可为完整基因亦可为其一部分。 4.探针：单链，带有容易被追踪和检测出来的标记。 5.寡核苷酸探针：单碱基改变的检测。,47,目前可孕前诊断的单基因病 Prader-Willi综合征(PWS)、性畸形(SRY基因诊断)、X染色体连锁鱼鳞病、Duchenne肌营养不良（DMD）、脆性X染色体综合症、地中海贫血、地中海贫血、脊髓性肌萎缩、肯尼迪氏综合征及雄激素受体基因异常所致疾病、型粘多糖贮积症、Marfan综合征、血友病、视网膜母细胞瘤、无精子症相关基因缺失诊断、成骨发育不全、Huntington舞蹈症、Kallmann综合征、遗传性视神经萎缩、软骨发育不全、苯丙酮尿症、Wilson氏病、结节性硬化症等。,48,聚合酶链反应（PCR）： 利用耐热的DNA聚合酶,以一对与模板DNA互补的寡核苷酸为引物，在体外模拟体内的DNA复制过程，即进行变性、退火和延伸三个阶段（循环30次），使目的DNA扩增到约106个拷贝，既100百万倍。 优点：快速、简便、准确、可靠、经济、特异性强等。 扩增倍数=2n（ n：扩增周期） PCR模板DNA取材：细胞、发根、精斑、血斑、已制备成的标本、木乃伊,（二）聚合酶链反应技术,49,引物：能与模板DNA两条链上的各一段序列互补的寡核苷酸（1520bp）,上游序列： 5TTTGGAGGCAAGCAAGCA G 3,PGC-1基因引物序列：,扩增的DNA片段长度：508bp,5TATTTAGGGTTTTGCCAAGG 3,下游序列：,50,500bp,Marker PCR产物,508bp,2%琼脂糖电泳检测PGC-1基因PCR扩增产物,Marker：标准分子量,51,（三）反义技术与RNA干涉技术 反义核酸： 与有功能的RNA（主要是mRNA）互补结合，并干扰其功能的RNA或DNA。 反义技术： 利用反义核酸影响相对应的mRNA的转录、翻译，改变细胞的生物学功能的技术。 反义技术的应用：基因功能研究；病毒基因组功能的研究；作为药物；反义核酸抑制癌基因,52,RNA干涉（RNA interference，RNAi）: 由双链RNA（dsRNA）