实验八纤维素酶活力测定实验.doc

实验八 纤维素酶酶活力的测定实验【实验目的】1、 了解测定纤维酶活力及还原糖的原理。2、 掌握测定纤维酶活力及还原糖的方法。3、 获得部分纤维素酶。【实验原理】纤维素酶是水解纤维素生成纤维二糖及葡萄糖的一类酶的总称。它包括C1、CX酶及纤维二糖酶（葡萄糖苷酶）。作用方式： C1酶 CX酶 纤维二糖酶天然纤维素-直链纤维素-纤维二糖-葡萄糖其中C1酶是使天然纤维素晶体都分链，起一个分离作用和水合作用，从而使天然纤维素裂解成为直链纤维素。CX酶不能水解天然纤维素，而能水解直链纤维素的-1，4-葡萄糖酶键，生成纤维二糖，纤维二糖再经过纤维二糖酶水解成为葡萄糖。本法以滤纸和羧甲基纤维素钠盐作为底物加入一定量的酶液，在一定的条件下起作用，然后观察滤纸的溃崩情况来判断C1酶活力的大小，同时，测定CMC水解液中还原糖的含量用来表示CX酶活力的大小。用羧甲基纤维素钠盐(CMC)作底物，经纤维素酶水解后生成还原糖，然后用DNS法测定还原糖的含量，从还原糖的数量来求得酶活力的大小。纤维素分子是由-葡萄糖从1，4键相连的长链，由于纤维素的分子间氢键数目极其多，因此不溶于水，在纤维素分子中-葡萄糖上第2，3及5个碳原子都有一个游离的羧基，如羧基上的氢被羧甲基取代，由于羧基有着很强的亲水性，因此，CMC就能溶于水而成为胶状溶液。羧甲基纤维素无论在结构上或是在性质上都很大程度地不同于纤维素。因为它溶于水。所以，非常容易被纤维素酶水解，在相同的条件下，同一纤维素酶水解CMC所产生的还原糖远大于水解纤维素所产生的还原糖，因此CMC酶活力只能代表CX酶的活力，而且它的数值总是比较高的，所以CMC的酶活力只能供参考。测定还原糖的方法很多，只是采用DNS（3，5-二硝基水杨酸）法，比较简便，3，5-二硝基水杨酸是一种氧化剂，能与还原糖作用，使硝基还原成氨基，溶液变为橙色，在一定还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比。因此，可采用比色法求得还原糖的含量。葡萄糖与DNS的显色反应如下： COOH CHO OH + 2(CHOH)4 - | CH3OH O2N NO23,5-二硝基水杨酸 COOH COOH OH + 2(CHOH)4 | CH3OH O2N NH2 3-氨基,5-硝基水杨酸由于不同来源的纤维素酶对各种不同的天然纤维素的分解能力是不同的，即是同一种酶，由于不同的天然纤维素的分解能力各不相同，因此，分解滤纸纤维素较强的酶，对于分解天然纤维素的能力有可能强，为此，在菌种筛选过程中，最好测定在生产上所采用的纤维素原料的分解能力。【仪器、材料和试剂】1、 菌种：纤维素酶产生菌，青霉菌2、 培养基：（1） 斜面培养基：麸皮5%，琼脂2%，28，5-6天（2）种子培养基：药媒3%（北京中棉紫光生物科技公司，药媒2206，蛋白54%）麸皮3%、磷酸二氢钾0.25%、微晶纤维素2%、胰蛋白胨0.4%硫酸铵0.2%、硫酸镁0.03%、氯化钙0.03%、种子28，160-180r/min，培养1-2天，10%接种量接入发酵瓶（3）发酵培养基：药媒3.18%，麸皮2.95%，磷酸二氢钾0.25%，微晶纤维素3.79%，胰蛋白胨0.4%，硫酸铵0.2%，硫酸镁0.03%，氯化钙0.03%250mL三角瓶装量为25mL，160-180r/min,28-30培养6天3、 试剂a) 磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液溶液A：0.2 mol/L Na2HP04H20：取Na2HP04H20 35.6g或Na2HP0412H20 71.62g，用蒸馏水溶解后定容至1000mL。溶液B：0.1 mol/L柠檬酸液：取一水柠檬酸（C6H8O7H20）21.01g，用蒸馏水溶解后定容至1000 mL。溶液C：取A液493 mL，加入507 mL B液混合均匀即为pH4.8磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液。b) DNS试剂取酒石酸钾钠182g，溶于500mL蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3.5二硝基水杨酸6.3g，NaOH 2lg，苯酚5g，亚硫酸钠5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用，室温下放置7天后使用。有效期一个半月。c) 羧甲基纤维素钠（CMCNa）溶液取2g羧甲基纤维素钠（粘度300600厘泊）溶于 200mL蒸馏水中，水浴加热至溶，用一层纱布过滤。取滤液 100mL，加入 PH=4.8 磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液 20mL，蒸馏水 40mL混匀，贮冰箱备用。一周后应重新配制。d) 1%标准葡萄糖液精确称取经105烘至恒重的无水葡萄糖（AR）1.000g，以蒸馏水溶解，定容于100 mL容量瓶中制成1%浓度的标准葡萄糖液4、 仪器和设备：新华滤纸1#、固定床反应器、水浴恒温振荡器、台式离心机、生化培养箱、恒温制冷加热器、精密移液器。恒温水浴锅 402、 紫外分光光度计UV1601、 电子天平(0.001g) 漩涡混合器等。【实验步骤】（一）、标准曲线的绘制：分别吸取1%标准葡萄糖液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL于50 mL容量瓶中，用蒸馏水制成每mL分别含有葡萄糖200，400，600，800，1000，1200g的标准液。各取不同浓度标准液0.5 mL于试管中，加PH4.8磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液1.5 mL，DNS试剂3 mL于沸水浴中沸腾7min（样品放入重新沸腾时算起），取出后立即加入蒸馏水10 mL混匀，冷却后，在紫外分光光度计550nm比色，以所得的光密度OD值为横座标，以对应的标准葡萄糖液浓度的二分之一的值（即：100，200，300，400，500，600，此为每管中葡萄糖的g数）为纵座标，绘制标准曲线。 空白的制作：以0.5 mL蒸馏水代替0.5 mL标准葡萄糖液，以下操作步骤同标准曲线制作。（二）纤维素酶活力的测定方法 待测酶液的制备，精确称取一定量“四分法”采样取得的样品1.000g至50mL的试管中，加缓冲液19mL置于漩涡混合器中震荡至完全溶解，于40土2的水浴锅浸提60分钟，浸提过程中反复震荡34次，浸提后取上清液作为待测酶液。 待测酶液用缓冲液稀释到一定倍数（控制测定OD值在0.20.4之间），取经40预热的此稀释液0.5毫升，加入经40预热的CMC液1.5mL（每个样品同时作2 3个不同稀释倍数的梯度，每个梯度同时作两支平行试管）， 40恒温精确反应20分钟，立即加入DNS试剂3mL，立即沸水浴中煮沸7分钟，终止反应，以下步骤同标准曲线制作。 空白制作：取稀释液0.5mL后，先加入DNS试剂3mL，再加入CMC液1.5mL，以下步骤同样品操作。【实验结果】计算： r60 CMC酶活力（molhrg或ug）w20180式中：r从曲线上查得与标准葡萄糖液相对应葡萄糖微克数。 60 1小时60分钟。 1W实际参与反应的酶量即0.5稀释倍数（注：稀释