C、N、P、S循环主要相关酶酶活测定.doc

C、N、P、S循环主要相关酶酶活测定林叶春2010-01-05A. 芳基酰胺酶(Arylamidase，EC3.4.11.2) 1g土样-试剂： 0.1M pH8.0Tris缓冲液2.44g三羟甲基氨基甲烷溶于50ml去离子水中，用0.05M H2SO4调节pH至8.0，再用去离子水定容至200ml；0.05M H2SO4；L-亮氨酸-萘胺溶液称取0.2342g L-亮氨酸-萘胺盐酸盐溶于适量去离子水中，并定容至100ml，即为8.0mM溶液；盐酸化乙醇将4.32ml浓盐酸加入到适量95%的乙醇中，并用乙醇定容至200ml，即为盐酸化乙醇；4-二甲基氨基肉桂醛(CAS:6203-18-5)溶液称取0.12g 4-二甲基氨基肉桂醛溶于95%乙醇中，并用乙醇定容至200ml，即为0.6mg/ml的溶液；-萘胺标准溶液称取12.5mg -萘胺于100ml容量瓶中，加入5ml乙醇和75ml去离子水，充分摇匀，再用去离子水定容至100ml，即为125g/ml的-萘胺标准溶液。-仪器：分光光度计(540nm)；25ml三角瓶；摇床；培养箱；离心机；试管-操作：取1.0g新鲜土壤(2mm)于25ml三角瓶中，加入3ml 0.1M pH8.0 Tris缓冲液和1ml 8.0mM L-亮氨酸-萘胺溶液，盖上瓶塞，充分混匀，于37培养1h，再加入6ml 95%乙醇，混匀。将上述悬液转移至离心管中，17000g离心1min，将上清液转移至试管中。取此上清液1ml于另一支试管中，加入1ml乙醇、2ml盐酸化乙醇和2ml 4-二甲基氨基肉桂醛溶液，充分混匀，于540nm处比色测定。对照样，在培养结束之后再加入1ml8.0mM L-亮氨酸-萘胺溶液。-校准曲线制作：分别量取1，2，3，4，5和6 ml 125g/ml -萘胺标准溶液于25ml的容量瓶中，用去离子水定容，即得5，10，15，20，25和30g/ml -萘胺工作溶液。取上述工作液各1ml于试管中，分别加入1ml95%乙醇、2ml盐酸化乙醇和2ml 4-二甲基氨基肉桂醛溶液，摇匀后于540nm处比色。 -结果： 芳基酰胺酶活性(g -萘胺g-1h-1) = CV/(dwtt)其中，C为样品-萘胺含量(g/ml)；V为土壤溶液体积(ml)；dwt为烘干土壤质量(g)；t为反应时间(h)。V. Acosta-Martnez and M. A. Tabatabai. Arylamidase activity of soils. Soil Sci. Soc. Am. J. 2000,64:215-221.B. -葡糖苷酶(-glucosidase，EC3.2.1.21) 1g土样-试剂：甲苯；pH值6.0MUB缓冲液；0.5mol/L NaOH；0.5mol/L CaCl2溶液；p-硝基酚标准溶液参见磷酸酶测定；pH12.0Tris缓冲液12.2g三羟甲基氨基甲烷溶于800ml去离子水中，用0.5mol/L的NaOH调节pH至12.0，去离子水稀释至1L；对-硝基酚-D-葡糖苷(PNG)溶液0.377g PNG溶于40ml MUB缓冲液中，用相同的缓冲液稀释至50ml，在4下贮存；去离子水MUB缓冲液(Modified Universal Buffer Solution): 将12.1 g三羟甲基氨基甲烷（THAM），11.6 g顺丁烯二酸(马来酸)，14.0 g柠檬酸和6.3 g硼酸（H3BO3）于500ml 1 molL-1 NaOH溶液中，再用去离子水稀释至1L，贮于4冰箱中。1.改进的MUB(pH6.0):取200ml储备液于配有磁力搅拌器的500ml烧杯中，滴入0.1N的HCl搅拌至pH6.0,水定容至1L.2.改进的MUB(pH11):取200ml储备液于配有磁力搅拌器的500ml烧杯中，滴入0.1NNaOH的搅拌至pH11,水定容至1L.-仪器：分光光度计(400nm)；25ml三角瓶；恒温水浴；摇床；漏斗；滤纸-操作：取1.00g新鲜土壤(2mm)于25ml三角瓶中，加入0.25ml甲苯、4.00ml pH值6.0MUB溶液和1.00ml PNG溶液，盖上瓶塞，充分混匀，于37培养1h。然后加入1.00ml 0.5M CaCl2溶液和4.00ml 0.1M pH值12.0的Tris缓冲液中止反应，摇匀，悬液1500g10 min，上清液在400nm处比色测定。做空白对照时，必需在培养结束之后，加CaCl2溶液和Tris缓冲液之后加入底物PNG溶液。每个样品必需做一个空白和三次重复。-标准曲线制作：取1ml对-硝基酚标准溶液于100ml容量瓶中，用去离子水定容至刻度，再分别取该稀释液0，1，2，3，4和5ml于50ml三角瓶中，用去离子水调节溶液体积至5ml(即为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0g/ml的对-硝基酚工作液)，然后加入1.00ml0.5M CaCl2溶液和4.00ml 0.5M NaOH溶液，充分混匀后迅速过滤，同上比色测定。-结果： -葡糖苷酶活性(g对-硝基酚g-1h-1) = CV/(dwtt)其中，C为样品对-硝基酚含量(g/ml)；V为土壤溶液体积(ml)；dwt为烘干土壤质量(g)；t为反应时间(h)。(1.Tabatabai M.A.,1994.Enzymes. In: Weaver, R.W., Augle, S, Bottomly, P.J., Bezdicek, D., Smith, S., Tabatabai, A., Wollum, A. (Eds.), Methods of soil analysis. Part 2. Microbiological and biochemical properties. No. 5. Soil Science Society of America, Madison, pp.775-833.2.F. Eivazi and M. A.Tabatabai.1988.Glucosidases and Galactosidases in Soils.Soil Biol. Biochem.5.Vol.20,pp.601-606.)C. 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，EC3.1.3.1) 1g土样-试剂：通用缓冲溶液(MUB)贮备液改进的MUB(pH11):取200ml储备液于配有磁力搅拌器的500ml烧杯中，滴入0.1N NaOH的搅拌至pH11.0，去离子水定容至1L.；25mmol/L对-硝基酚磷酸钠溶液(PNP溶液)0.420g对-硝基酚磷酸二钠溶于40ml pH11.0 MUB溶液中，用相同的pH值缓冲液稀释至50ml，于4下保存。；0.5mol/LCaCl2溶液73.5g CaCl2溶于少量去离子水中，并稀释至1L；0.5mol/L NaOH20g NaOH溶于1L去离子水中；对-硝基酚标准溶液1g对-硝基酚溶于少量去离子水中，并稀释定容至1L，于4下保存。；甲苯；去离子水-仪器：分光光度计(400nm)；培养箱；摇床；50ml三角瓶；50/100ml容量瓶；恒温水浴-操作：取1.00g新鲜土壤(2mm)于50ml三角瓶中，加入0.25ml甲苯(泥炭土加5ml)、4.00ml pH11.0 MUB缓冲液和1.00ml用相同的缓冲液配制的对-硝基酚磷酸钠溶液，盖上瓶塞，充分混匀后，37下培养1h，然后加入1.00mlCaCl2溶液和4.00ml NaOH溶液，摇匀后迅速过滤，于400nm处比色。同时做空白对照，加对-硝基酚磷酸钠溶液之前加入CaCl2溶液和NaOH溶液，并迅速过滤。每个样品三次重复。-标准曲线制作：取1ml对-硝基酚标准溶液于100ml容量瓶中， 用去离子水定容至刻度，再分别取该稀释液0，1，2，3，4和5ml于50ml三角瓶中，用去离子水调节溶液体积至5ml，然后加入1.00ml0.5M CaCl2溶液和4.00ml 0.5M NaOH溶液，充分混匀后迅速过滤，同上比色测定。-结果： 土壤磷酸酶活性(g对-硝基酚/gh) = CV/(dwtt)其中，C为样品中对-硝基酚含量(g/ml)；V为土壤溶液体积(ml)；dwt为烘干土壤质量；t为反应时间(h)。(1. 吴金水,等.土壤微生物生物量测定方法及其应用M.北京:气象出版社,2006,128-129.(2. Tabatabai M.A., 1982. Soil.Enzymes. In: Weaver, A.L., Page, R.H, Miller and D.R., Keeney, D. (Eds.), Methods of soil analysis. Part 2. Microbiological and biochemical properties, Second Edition, No. 9. Soil Science Society of America, Madison, pp.903-943.)D. 芳基硫酸酯酶(Arylsulfatase，EC3.1.6.1) 1g土样-试剂：甲苯；醋酸；醋酸钠称取醋酸钠水合物68g溶于700ml蒸馏水中，用醋酸调节pH至5.8，再用蒸馏水定容至1000ml即得；CaCl2；NaOH；0.025M p-硝基酚硫酸酯溶液0.312g p-硝基酚硫酸钾溶于少量pH值5.8的醋酸缓冲液中，并用醋酸缓冲液定容至100ml，存于4下。-仪器：分光光度计(400nm)；50ml三角瓶；摇床；滤纸；恒温水浴；漏斗-操作：取1.00g鲜土(2mm)于50ml三角瓶中，加入0.25ml甲苯、4.00ml 0.5M pH值5.8醋酸缓冲液和1.00ml 0.005M对-硝基酚硫酸酯溶液，混匀，盖上瓶塞，在37下培养1h，再加入1.00ml 0.5mol/L CaCl2溶液和4.00ml 0.5mol/L NaOH溶液，混匀，慢性滤纸过滤，400nm处比色，空白对照应在加入CaCl2和NaOH溶液之后加底物，并迅速过滤。-标准曲线制作：取1ml对-硝基酚标准溶液于100ml容量瓶中， 用去离子水定容至刻度，再分别取该稀释液0，1，2，3，4和5ml于50ml三角瓶中，用去离子水调节溶液体积至5ml，然后加入1.00ml0.5M CaCl2溶液和4.00ml 0.5M NaOH溶液，充分混匀后迅速过滤，同上比色测定。-结果： 芳基硫酸酯酶活性(g对-硝基酚(gh)-1 = CV/(dwtt)其中，C为测定样品中对-硝基酚的含量(g/ml)；V为土壤溶液体积(ml)；dwt为烘干土壤质量(g) ；t为反应时间(h)。(1.吴金水,等.土壤微生物生物量测定方法及其应用M.北京:气象出版社,2006,133-134.2.Tabatabai MA, Bremner JM (1970). Arysulphatase activity of soils. Soil Sci Soc Am Proc 34:225-229.)E. 脱氢酶(Dehydrogenase，EC1.1.1.1) 20g土样-试剂：甲醇；碳酸钙；2,3,5-三苯基四唑氯化物(TTC)，3%3g TTC溶于80ml去离子水，稀释至100ml；三苯基甲臜(TPF)标准溶液100mg TPF溶于80ml甲醇，用甲醇定容至100ml，混匀。取10ml此溶液用甲醇稀释至100ml，即得100g/ml TPF标准溶液-仪器：分光光度计(485nm)；试管(16mm150mm)；漏斗；玻璃棒；脱脂棉-操作：取20.00g新鲜土壤(2mm)与0.20g CaCO3混匀，再从中称取三份6.00g土壤于玻璃试管中，每管加入1ml 3%的TTC溶液和2.5ml去离子水，用玻璃棒搅拌混匀，盖紧后于37培养24h。再加入10ml甲醇，盖紧摇匀1min。用塞有脱脂棉的漏斗过滤，用甲醇洗涤玻璃试管，将管中土壤全部转移至漏斗上。再加入甲醇于漏斗上直至棉塞上的红色消失为止，滤液用甲醇定容至100ml。以甲醇做空白对照，在485nm处比色。-标准曲线制作：吸取10mlTPF标准溶液，并用甲醇定容至100ml，得到100g/ml TPF溶液。分别吸取0，5，10，15，20和25 ml 100g/ml TPF溶液于100ml容量瓶中，用甲醇稀释定容，即得0，5，10，15，20和25g/ml系列TPF工作液，摇匀后同试样于485nm处比色，绘制TPF标准曲线。-结果： 土壤脱氢酶活性(g TPFg-1h-1) = CV/(dwtt)其中，C为滤液的TPF量(g/ml)；V为滤液体积(ml)；dwt为烘干土壤质量(g)；t为反应时间(h)。(1. 吴金水,等.土壤微生物生物量测定方法及其应用M.北京:气象出版社,