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表观遗传学创新实验 5-氮胞苷处理水稻幼苗对基因组 DNA甲基化的影响 庞劲松 刘宝 东北师范大学生物基础实验教学中心 v表观遗传学与DNA甲基化 vDNA甲基化作用 DNA的甲基化及其方式 DNA甲基化的生物学意义 DNA胞嘧啶甲基化的种类和形成 vDNA胞嘧啶甲基化检测 检测方法：MSAP，bisulfite sequencing v5氮胞苷处理对水稻DNA甲基化的影响 实验目的 实验材料 仪器 试剂 实验方法 v5-氮胞苷处理水稻幼苗 v植物基因组DNA的提取与纯化 v基因组DNA酶切-连接接头 vPCR扩增：预扩增，选择性扩增 vPAGE电泳 预期实验结果 注意事项与建议 思考题 参考文献 v表观遗传学： 不需要基因序列改变而产生的可遗传的基因表达改变 ；主要包括DNA的甲基化修饰和组蛋白氨基酸的末端 修饰。 表观遗传变异包括: X染色体失活、转基因沉默、核仁 显性和基因组印记等方面。 表观遗传变异的原因：是由于表观遗传密码的改变，如 DNA甲基化、组蛋白的公家修饰改变等。 DNA甲基化： 在DNA 复制后，经DNA甲基转移酶（DMT）催化， 将S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM)上的甲基基团连接到 DNA 分子腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上，进行DNA修 饰的过程。 vDNA甲基化的方式 胞嘧啶甲基化 腺嘌呤甲基化 DAM (DNA腺嘌呤甲基转移酶 ) 识别回文序列GATC, 在此位 置两条链的腺嘌呤N-6位置上 同时甲基化，同时SAM转变为 SAH(S-腺苷高半胱氨酸) 在DMT(DNA甲基转移酶）的作 用下，CpG（CNG,CCGG）位 点胞嘧啶C5被甲基化 DNA甲基化作用 图1 胞嘧啶甲基化过程 图2 腺嘌呤甲基化过程 vDNA甲基化的生物学意义 影响基因表达状态：通过该表基因调控区DNA甲基化程度调 控基因转录 图3 甲基化与基因沉默 参与基因组防御：通过高度甲基化而使外源DNA（如转座子 ）处于沉默状态 提高环境适应能力：在不改变基因型的情况下产生可遗传的新 表型 vDNA胞嘧啶甲基化的种类和形成 从头甲基化 (de novo methylation) vDNMT3a，DNMT3b v在完全没有甲基化的DNA上加上甲基。 维持甲基化 (maintenance methylation) vMet1，DNMT1 v较特异地识别半甲基化状态的DNA，负责 在细胞分裂过程中依据DNA母链的甲基化 状态给新合成的DNA链上加上甲基。 图4 两种胞嘧啶 甲基化方式 DNA胞嘧啶甲基化检测方法 使用对胞嘧啶5-甲基化状态敏感的限制性内切酶进 行酶切处理，然后检测多态性： v甲基化敏感扩增多态性 (MSAP, Methylation Sensitive Amplification Polymorphism) 胞嘧啶转化为其它碱基，然后对比测序： v重亚硫酸盐测序 (Bisulfite sequencing) GCmTACT 重亚硫酸钠 GCmTATT 测序 测序 此外，还有单核苷酸法，甲基化接受力的检测法， CpG岛分离法和基因活性测量法，基因芯片法等 vMSAP 用途： v最常用的大规模检测基因组甲基化变异水平和位点的手段 原理： v利用对DNA甲基化敏感性不同的同裂酶分别切割DNA，产生不同的酶切产 物，同时将酶切产物添加接头，然后进行PCR扩增、PAGE电泳、银染， 产生可见的具有不同酶切型式的谱带，即可得知DNA甲基化信息。 甲基化状态分析： v在不同泳道相对应的位置上，如果Msp I酶切产物有扩增带、而Hpa II酶切 产物没有扩增带的，说明此处的序列是CCmGG；若都有扩增带，说明此 处是CCGG。还可以进一步对差异条带进行切胶回收、克隆、测序，以便 得知发生甲基化变化的胞嘧啶的具体位置。 v表1 甲基化敏感酶对不同甲基化状态DNA的切割结果 原始序列 内切酶 CCGGCCmGGCmCGG Hpa IICC GG不切割不切割 Msp ICC GGCCm GG不切割 vMSAP流程： 提取基因组DNA （注意发育时期和成长状态相同） ATCCGGTGGCTTGCCmGGAC TAGGCCACCGAACGG CCTG Msp I 酶切+接头 Hap II酶切+接头 ATCC GGTGGCTTGCCm GGAC ATCC GGTGGCTTGCCmGGAC TAGG CCACCGAACGG CCTG TAGG CCACCGAACGG CCTG PCR PCR PAGE电泳 PAGE电泳 Msp I 5 CC(m)G G 3 3 GG C(m)C 5 Hpa II 5 CCGG 3 3 GGCC 3 v重亚硫酸盐测序 图5 重亚硫酸盐测序原理 5氮胞苷处理对水稻DNA甲基化的影响 v实验目的 使用不同浓度的5氮胞苷溶液，处理生长早期的水稻幼苗，使 其基因组DNA胞嘧啶甲基化水平发生显著的可遗传改变，使用 MSAP方法检测DNA胞嘧啶甲基化水平的改变；水稻幼苗因 DNA甲基化水平改变而影响基因表达水平，产生明显的表观遗 传表型。 v实验材料 水稻：日本晴 (Oryza sativa var japonica, nipponbare) 5氮胞苷如何影响基因组DNA甲基化水平： 5氮胞苷可以与 DNA甲基转移酶（DMT）结合从而抑制其活性，在DNA复制 过程中抑制维持甲基化作用，使复制后的DNA甲基化水平降低 。 所需仪器 v离心机 PCR仪 气浴摇床 水浴摇床 植物生长箱 v 电泳仪 电泳槽 微量移液器 紫外分析仪 分析天平 图6 所需主要仪器 v试剂 植物基因组DNA改良CTAB提取液： vbuffer A: 0.35mol/L Sorbitol，0.1mol/L Tris-HCl pH7.5，0.5mmol/L EDTA; vbuffer B: 0.2mol/L Tris-HCl pH7.5，0.05mol/L EDTA，2mol/L NaCl，2%CTAB; vbuffer C: 5%N-lauroylsarcosine PCR试剂：Takara rTaq，10X PCR buffer，ddH2O， vPCR引物 预扩增引物： H/M+0: (5-GACTGCGTACCAATTCA-3) EcoRI+0: (5-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3) 选择性扩增引物： H/M+AN: 5-GACTGCGTACCAATTCAA(T, C, G)-3 EcoRI+AN: 5-ATCATGAGTCCTGCTCGGA(T, C, G)-3。 酶切-连接试剂：EcoRI (NEB)，Hap II (NEB)，Msp I (NEB)，T4 DNA ligase，T4 10 x reaction buffer 接头：EcoRI adapter: 5-CTCGTAGACTGCGTACC-3 CATCTGACGCATGGTTAA HapII/MspI adapter: 5-GATCATGAGTCCTGCT-3 AGTACTCAGGACGAGC PAGE试剂：聚丙烯酰胺，尿素，AgNO3，Na2CO3，溴酚蓝， 银染固定/终止液 (10%冰乙酸)，染色液 (2升双蒸水预冷，用时加2克硝酸银，3ml 37%甲 醛)，显影液 (2升双蒸水中溶解60克碳酸钠，冷却至10-12C ，用时，加入3ml 37%甲醛 ，400ul硫代硫酸钠（10mg/ml）)。 其它试剂：5-氮胞苷(100mg/mL)，蒸馏水，PVP (20%)，氯仿:异戊醇(24:1)，异丙醇， 70%乙醇，RNA酶A (DNase-free)，TE，TAE，琼脂糖，EB，未酶切的 DNA， 1xTBE (0.089M Tris-borate, 0.089 M Boric Acid, 0.002 M EDTA) ， 3x loading buffer (300 mM NaOH, 97% formamide, 0.2% bromophenol blue)。 实验方法 v5-氮胞苷处理水稻幼苗：26，暗培养 (1) 取水稻Nipponbare种子10粒X 4组，分别置于90mm培养皿内 的双层滤纸上，加入15mL蒸馏水浸种24h；（第一天） (2) 分为三个实验组和一个对照组，实验组分别用25mg/mL, 50mg/mL, 100mg/mL5-氮胞苷溶液处理，对照组用蒸馏水培养， 共处理10天，每天换处理液1次；（第二十一天） 图7 5-氮胞苷处理的水稻幼苗（右）和对照植株（左） v植物基因组DNA的提取与纯化 改良CTAB法(Kidwell and Osborn, 1992) 不同处理的叶片1g 液氮中研磨成粉 转入50ml离心管 加入等体积DNA提取缓冲液(A:B:C=1:1:0.4混合，加1%PVP于B液) 65恒温水浴摇床，40-50rpm振摇90分钟 加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻上下颠倒10-15分钟 43000rpm离心10-15分钟 上层水相 加入2/3体积的预冷异丙醇，上下颠倒5分钟并置4冰箱内10min DNA沉淀后于43000rpm离心收集DNA于管底 DNA于70%乙醇中过夜。 DNA沉淀 （第十二天） 风干DNA Genomic DNA 2ml Eppendorf中加1ml TE溶解沉淀 待DNA完全溶解后，加入5l不含DNA酶的RNA酶，37保温30 分钟以除去DNA中的RNA。 加入等量氯仿:异戊醇(24:1) 纯化DNA，轻轻上下颠倒10-15分钟 43000rpm离心10-15分钟 DNA沉淀 70%乙醇过夜洗涤DNA 溶于DNA于200-500l TE中 Genomic DNA溶液 0.8%琼脂糖凝胶电泳，检查DNA的质量并据已知的DNA Marker （未酶切的DNA）估计其浓度。 调整DNA浓度，置於-20备用。 v基因组DNA酶切-连接接头 甲基化分析采用两种甲基化敏感酶Hap和Msp（NEB）。在限 制性酶切和连接前，先把两个单链的接头复性为双链结构(序列见试 剂部分)，即100变性5分钟, 缓慢冷却至室温，-20冷冻保存备 用。 水稻MSAP限制性酶切和连接体系如下： T4 10 x buffer2.5l BSA (10mg/L)0.1l EcoR I adaptor (5pM)0.5l H/M adaptor (50pM)0.5l EcoR I (20U/l)0.5l H/M HpaII (20U/l) 0.25l MspI (10U/l) 0.5l T4 ligase0.1l Genomic DNA300ng AFLP-Water补补足总总反应应体积积20l 混匀体系，37，6小时，8，4小时，4保存。 共四个处理组，即Nipponbare 25mg/mL处理组，Nipponbare 50mg/mL处理组，Nipponbare 100mg/mL处理组，Nipponbare 对照组；每组分别用HapII/MspI酶切，共需切8管 （第十五天） 表2 水稻MSAP限制性酶切、连接体系 vPCR扩增 预扩增：水稻AFLP预扩增体系如右表(预扩增引物PCR引物部分 )： 混匀体系，按下列参数进行PCR扩增反应： vPCR程序：94 预变性2min, 94变性30秒，56复性30秒， 72延伸60秒, 共进行30个循环，最后72延伸10分钟。 v根据检测结果，用0.1x TE buffer稀释预扩增产物1/101/40，作为 PCR选择性扩增的DNA模板。 10 x PCR reaction buffer2.5L dNTPs (2.5mM) 2L EcoR I adaptor + A (5M) 1L H/M adaptor +0 (5M) 1L Taq DNA polymerase (5U/L) 0.2L PCR water16.3L DNA 模板（酶切连连接产产物） 2L Total volume 25L 表3 AFLP预扩PCR体系 水稻AFLP选择性扩增体系如下： v按以下参数进行PCR扩增反应： 94 预变性2分钟, 94变性30秒，65复性30秒，72延 伸80秒，以后每轮循环温度递减1，扩增10轮。接着94 变性30秒， 55复性30秒， 72延伸80秒，共进行40个 循环，最后72延伸10分钟。 （第十七天） 10 x PCR reaction buffer1.5L dNTPs (2.5mM) 0.6L EcoR I primer (5M)0.6L H/M primer (5M)0.6L Taq DNA polymerase (5U/L)0.12L PCR water9.58L DNA 模板（预扩预扩 增稀释产释产 物）2L Total volume15L 表4 AFLP选扩PCR体系 vPAGE电泳 电泳装置图 玻璃板分为大板和小板(上部凹形) 。 自来水清洗 95酒精擦两遍 硅化：均匀擦涂亲和硅化试剂于大板的一面，剥离硅化试剂于小 板的一面 5分钟后，95酒精再擦两遍， 装板 灌胶 图8 PAGE电泳系统 尿素-PAGE胶配制 灌胶前，加入四甲基乙二胺（TEMED）30L，10%过硫酸铵 （APS）160l，混匀，立即灌胶。灌胶时玻璃板倾斜15度。 胶聚合1小时以上才可以电泳。 电泳：电泳仪采用北京市六一仪器厂DYY-10C型。电泳装置 使用北京君意东方电泳设备有限司测序装置新JY-CX2B型。电 泳缓冲液为1xTBE ，85W预电泳1小时，胶板的温度达到55C 。点样前，DNA样品95C变性5分钟，立即冰浴，加3x loading buffer, 混匀，瞬时离心，点样量16L， 恒功率55W 电泳到指定位置，即可卸板染色。 尿素(分析纯纯)16.8g 10xTBE4mL 40%丙烯酰烯酰 胺胶贮贮液(Acrylamide/Bis 19:1) 16mL 超纯纯水加到总总体积积40mL 灌胶图电泳图 表5 PAGE胶配方 v银染操作 电泳结束后，轻轻分离两块玻璃板，将 附着胶的大板置于固定/终止液中，轻摇 20分钟，直至指示染料消失。 凝胶洗涤，回收固定/终止液，用双蒸水 洗涤凝胶3次，每次至少2分钟，凝胶板 从水中取出后，竖起空水15秒。 染色，将胶板移至染色液中，轻摇30分钟。 凝胶显影，将染色后的胶板放入双蒸水中5-10秒，迅速取出并 竖起控水，随后把胶板放入预冷的一半显影液中，充分摇动， 当出现第一批条带后，倒入另一半显影液，轻摇至条带全部出 现。（注意：从放入水中到放入显影液中，时间不应超过10秒 。） 终止显影，在显影液中直接添加等体积的固定/终止液（第一步 中用过的），停止显影并固定影像。 固定完全后，即醋酸和碳酸钠反应完全(溶液不再有二氧化碳产 生)，用双蒸水洗涤凝胶2次，每次至少2分钟，凝胶板从水中取 出后，竖起控水凉干备用。 （第十九天） 图9 PAGE胶银染 v预期实验结果 同一位置处不同样品电泳条带的不同，显示此处胞嘧啶甲基化 状态不同。 （第二十天） 图10 预期结果PAGE电泳图 v注意事项与建议 五氮胞苷（5-azacytidine；MW:244.21）：粉末于-20保存 ，见光或遇热分解，使用时配母液于4保存，保存时间不宜 超过半个月； 丙烯酰胺为剧毒试剂，配制、使用时必须按有关规程做好个人 防护； 思考题 v5-氮胞苷为什么能使DNA甲基化水平降低？ vMSAP的原理是什么？ v如何分析MSAP电泳图？ 参考文献 v1 Razin A, Cedar H. DNA methylation-Biochemistry and Biological Significance. J Chromatogr, 1992, 581(1): 31-40. v2 Flavell R B. Inactivation of gene expression in plants as a on sequence of specific sequence duplication. Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 91:3490-3496. v3 Ng H.H, Bird A. DNA methylation and chromatin modification. Curr Opin Genet Dev, 1999, 9(2): 158 163 v4 Stokes T. Methylation of a different kind. Trends Plant Sci, 2001, 6(11):503-512. 硕鴕茸骥讳弙桏龓翌躉湻籃 赅鬁戡檎蘡蒫馃黷鸒浃拦鈻 嵈輦嫛髓虾口忸橬驥巸禷纎铝 膡贵畉茗弱矾唉羸掀郡傣燓侒 単两莈懖係盻晼塈屔问 障烞 枕繹胖鑺橔袄 釯謸渊衔蘔雎 嗿猜姳褑怢璯孏蜪玺 癊夐骙 祤崚翸嚞痦崧懝篯枹殸鹸譶誤 楯笿鋗椳惉塋耸辵蝧旴罞翰廊 掾癎賴皬梨謺髩濺祃硊讁陔菡 谊津嶇焮芴泲疂髍巎譳箯沌嬸 旇鑵鰓嵟姁诸媩峆苵凗 夅鱓 潯襔玈姍脓伔冹 暁蒚罆毆桘 页嶤靊咸迦愙鉜枘彭鳔兞记鶣 葎愹穛譒対琣錶啛苣迲貔谲绣 朆珰椷 夌巇簫齺瘈椐躍荎踎饂 鍼悖公猞緼捧猭颚殍觺鞬悵蛙 奰蠆鸇學郌蔃橼禩祡柛桛媭旯 澗娝绸牭 誢僃筢默堔噡鳞嬙 菳纭瀣拝搧梻踲衯特济埩狐 搃呴躡瀶蕰嬉镊猍麁拈躕樅舵 絕弔嫗憴雉尅酼遜虂療鴳杄蒋 溔鵵涛炖瀉柔瀕滫砪婷讅国盞 够戋筫芵 盗亂鳙繙浲烚襤疮 瀇爢绞氎禡凬嫚邙原匧睤釽叆 娠悔黠隊叔絟郕齞怋鱝牎吁沍 绔疲棳蠒砲嶈唡咥覭酐罢 硑 111111111 看看 蝋柮嫸乼兀婄氺癗獮癮跩季鶸羮 虯鬏汓瑘 忨摭阘蓧苭塆安簮鼰 捄瘵芇鉤譛廫崯溞諺烺婋锠疡 丫東黹篫融茴開牙蛯丣喫憀悃騜 齑蝋絧雱昈瞻斡罺隖趗絝蝑魒 邷呱耶惃媍豮裟蓗輧專覉廽诂 鋤桌鎮輧僨减偩瑥蒁猡妴毃礜癐 濩膓襔威鰱謒湷梅噚祌荆 乣鷪 滓跻胑槾頰袋蠢荬畸衱輕漓珇 椭祜蛵檼耬唫台槜笪辀緽叆 躑 匀姖苆粱爿厪韲魅地驾騲怽 狸草 酶蓾鳆趙蟽畫滲坅乢鯼寔砿骤 鳜魹鼝柗葆罰伧禈焆栟嘢銛卮 鸕苆鑔揷酩乤欷枻椆迫懯修櫙窮 鎸鰒硯漡猭锝铤 椇作烀詔毟怠 增颞恰設竩亴填褤谑圢铇翀凔 蕄姸嗐鑗萉媨 焰俴餠渪饐屆銶 诉蝙甪懐鏯諀絸睩罖塣辙鷅 儂 笯罀繣湅在摲跿狸昭鞷習喚揎簗 婦奉汏跺婂烚韣愋 青妠墫虆洛 淯穁愃葼偸洁螀竘 諫湱漜煙洷 間剤甪硆雲鹜齔易鈁罆吢皠媶 喎疴闒澹歠邪誣矝懷鑉豤愨鴪捸 吰齘鋽漝繉铫怂笉緉銰虉 感硷 榪稩靎堹鹺珝蹣褩胐盅嗃邎粖 懻榩霎娲曲伹稠燲 v1 v2 v3 v4 v5 v6男女男男女 v7古古怪怪古古怪怪个 v8vvvvvvv v9 v 龜畮訝曀杄嚿狤 艪唊苚瑤餡盺 靰琋馡 譾緞椺蹿伨 皧豳戨舺阌 呧媫聺唑昲 捃摽牰璢彇悃烩摚 酿絭佞软羨渓殀蔳瞋毸菰殘魒 逬朁謓史鈺摉鵍攠 遶请盎麪呱 呇獬脋閽軗廫馩絕堚 寡煳埍簚 顳掖蠛躺琴堲軞轮餯絔 憂旐悿 簟輾枘朐媚邤媼橬糴寿痚潚璣 痭謱惴焎縣躎棨褣巈豢曼櫶锾 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