病毒学7病毒感染与细胞凋亡.ppt

病毒感染与细胞凋亡 微生物教研组 郑方亮 细胞凋亡的含义 n多细胞生物的一种生理性细胞死亡的过程； n凋亡过程中，细胞的形态变化是特有的； n凋亡过程中需要基因表达和蛋白质合成，特 别是酶的合成。 概念：是由一系列基因控制并受复 杂信号调节的细胞自然死亡 的现象。 细胞凋亡和细胞程序性死亡 n从严格的词学意义上来说，细胞程序性死亡与细胞凋亡是 有很大区别的。 细胞程序性死亡的概念是个功能性概念，描述在一个 多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的 ，并受到严格程序控制的正常组成部分。 细胞凋亡则是一个形态学的概念，描述一件有着一整 套形态学特征的与坏死完全不同的细胞死亡形式。 n一般认为凋亡和程序性死亡两个概念可以交互使用，具有 同等意义。 凋亡形态特征 Apoptosis “叶子凋落” 左，正常胸腺细胞；右，凋亡胸腺细胞 凋亡形态特征 坏死细细胞凋亡 受累范围围多为连续为连续 的大片细细胞多为单为单 个细细胞 细细胞膜完整性受到破坏仍保持完整性 细细胞体积积增大、细细胞肿胀肿胀 减小、固缩缩 固缩缩性 坏死 核染色质质散在的小集聚，呈絮状 积积聚在核膜下，呈半 月状 细细胞器 肿胀肿胀 ，尤以内质质网明 显显崩解 仍保持完整，未崩解 溶酶体破坏，酶外溢保持完整，酶不外溢 后期 细细胞破裂、溶解、残 屑被巨噬细细胞吞噬 细细胞胞浆浆裂解成许许多 碎片（ 凋亡小体 ）， 被邻邻近细细胞或巨噬细细 胞吞噬 炎症反应应 引起周围组织围组织 炎症反 应应 不引起周围组织围组织 炎症 反应应 分子生物学机制 细胞程序性死亡是细胞之间信号传导的 结果之一。环境和发育的刺激通过配体和 受体之间的相互作用传递到胞内，即配体 携带的信号通过与穿膜细胞受体胞外区域 的结合反应到受体的胞内区域，完成信号 由胞外到胞质的传递，然后开始胞内一系 列蛋白质与蛋白质之间的复杂作用，最后 导致凋亡的发生。 凋亡的过程 n信号传递阶段 死亡信号的探测 胞外信号（配体与受体的特异结合） 胞内信号（毒素、射线引起的损伤或病毒 感染） 下游死亡机制的传递 n效应阶段 Caspase的激活最终造成细胞死亡。 凋亡信号转导系统特点 n 多样性：不同种类的细胞系统不同 n 偶联性：与增殖分化的信号系统交叉偶联 n 同一性：多因素，共用同一系统触发 n 多途性：同一诱导因素启动多条信号转导 途径 凋亡的激活途径 nFas介导的细胞凋亡 n线粒体参与的细胞凋亡 Fas介导的细胞凋亡 富含半胱氨酸 死亡结构域 death effector domain 线粒体参与的细胞凋亡 BID n Caspase 可激活名叫CAD（caspase-activated Dnase）的核酸酶， CAD能在核小体的连接区将其切断，形成约为200bp整数倍的核酸片段。 正常情况下CAD存在于胞质中，并且与抑制因子ICAD/DFF-45蛋白结合， 不能进入细胞核。Caspase活化后可以降解ICAD/DFF-45，释放出CAD，使 它进入细胞核降解DNA。 nCaspase可直接破坏细胞结构，如裂解核纤层，核纤层（Lamina）是由 核纤层蛋白通过聚合作用而连成头尾相接的多聚体，由此形成核膜的骨 架结构，使染色质（chromatin）得以形成并进行正常的排列。在细胞发 生凋亡时，核纤层蛋白作为底物被Caspase在一个近中部的固定部位所裂 解，从而使核纤层蛋白崩解，导致细胞染色质的固缩。 n Caspase可作用于几种与细胞骨架调节有关的酶或蛋白，改变细胞结 构。除此之外，Caspase还能灭活或下调与DNA修复有关的酶、mRNA 剪切蛋白和DNA交联蛋白。 效应阶段 吞噬 凋亡相关的基因和蛋白 细胞凋亡的调控涉及许多基因，包括 一些与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌基 因。其中研究较多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2 、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等。 Caspase家族 Caspase属于半胱氨酸蛋白酶，这些蛋白酶是 引起细胞凋亡的关键酶，一旦被信号途径激活， 能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆的走向 死亡。它们均有以下特点：活性中心富含半胱 氨酸；对底物天冬氨酸部位有特异水解作用， 所以命名为caspase（ cysteine-containing aspartate-spicific protease ），方便起见本文称之 为凋亡酶；都是由两大、两小亚基组成的异四 聚体，大、小亚基由同一基因编码，前体被切割 后产生两个活性亚基。 分为两类：一类为执行者（ executioner或effector），如caspase-3、6、 7，它们可直接降解胞内的结构蛋白和功能 蛋白，引起凋亡，但不能通过自催化（ autocatalytic）或自剪接的方式激活；另一 类为启动者（initiator），如caspase-8、9， 收到信号后，能通过自剪接而激活，然后 引起caspase级联反应，如caspase-8可依次 激活caspase-3、6、7 Apaf-1 Apaf-1被称为凋亡酶激活因子-1（apoptotic protease activating factor-1），在线粒体参与的凋亡途径中具有重 要作用，该基因敲除后，小鼠神经细胞过多，脑畸形发育 。Apaf-1含有3个不同的结构域：CARD（caspase recruitment domain）结构域，能召集caspase-9；ced-4 同源结构域，能结合ATP/dATP；C端结构域，含有色 氨酸/天冬氨酸重复序列，当细胞色素c结合到这一区域后 ，能引起Apaf-1多聚化而激活。Apaf-1具有激活Caspase-3 的作用，而这一过程又需要细胞色素c和caspase-9参与。 Apaf-1/细胞色素c复合体与ATP/dATP结合后，Apaf-1就 可以通过其CARD结构域召集caspase-9，形成凋亡体（ apoptosome），激活caspase-3，启动caspase级联反应。 Bcl-2家族 nBcl-2为凋亡抑制基因，是膜的整合蛋白。它们在线粒体参 与的凋亡途径中起调控作用，能控制线粒体中细胞色素c 等凋亡因子的释放。 nBcl-2家族成员都含有1-4个Bcl-2同源结构域（BH1-4）， 并且通常有一个羧端跨膜结构域(transmembrane region ,TM)。其中BH4是抗凋亡蛋白所特有的结构域，BH3是与 促进凋亡有关的结构域。根据功能和结构可将Bcl-2基因家 族分为两类，一类是抗凋亡的（anti-apoptotic），如： Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1；一类是促进凋亡的（pro- apoptotic），如：Bax、Bak、Bad、Bid、Bim，在促凋 亡蛋白中还有一类仅含BH3结构，如Bid、Bad。 n虽然Bcl-2蛋白存在于线粒体膜、内质网膜以及外核膜上， 但主要定位于线粒体外膜，它拮抗促凋亡蛋白的功能。 Fas Fas又称作APO-1/CD95，属TNF受体 家族。Fas基因编码产物为分子量45KD的跨 膜蛋白，分布于胸腺细胞，激活的T和B淋 巴细胞，巨噬细胞，肝、脾、肺、心、脑 、肠、睾丸和卵巢细胞等。Fas蛋白与Fas 配体结合后，会激活caspase，导致靶细胞 走向凋亡。 p53 一种抑癌基因，其生物学功能是在G期 监视DNA的完整性。如有损伤，则抑制细 胞增殖，直到DNA修复完成。如果DNA不 能被修复，则诱导其调亡，研究发现丧失 p53功能的小鼠胸腺细胞对糖皮质激素诱导 的调亡反应和正常细胞相同，而对辐射诱 导的调亡不敏感。 C-myc 在许多人类恶性肿瘤细胞中都发现有c- myc的过度表达，它能促进细胞增殖、抑制 分化。 在凋亡细胞中c-myc也是高表达，作 为转录调控因子，一方面它能激活那些控 制细胞增殖的基因，另一方面也激活促进 细胞凋亡的基因，给细胞两种选择：增殖 或凋亡。当生长因子存在，Bcl-2基因表达 时，促进细胞增殖，反之细胞凋亡。 ATM ATM（ataxia telangiectasia-mutated gene）是与DNA损伤检验有关的一个重要 基因。正常细胞经放射处理后，DNA损伤 会激活修复机制，如DNA不能修复则诱导 细胞凋亡。ATM是DNA损伤检验点的一个 重要的蛋白激酶 细胞凋亡的检测方法 形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察 DNA电泳：DNA片段就呈现出梯状条带 TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法 彗星电泳法（comet assay） 流式细胞分析 DNA电泳鉴定 + 坏死凋亡 细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图 1细胞色素c诱导0 h 2细胞色素c诱导1 h 3细胞色素c诱导2 h 4细胞色素c诱导3 h 5细胞色素c诱导4 h 6阴性对照 7Marker （ 自赵允、翟中和） 细胞凋亡的意义 n确保正常发育生长：清除多余的细胞 n维持内环境稳定：清除受损、突变、 衰老