浙江大学生物化学实验甲复件酵母蔗糖酶的提取原理.doc_第1页
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酵母蔗糖酶的制备原理一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于酵母中，如啤酒酵母、面包酵母，也存在于曲霉、青霉和毛霉等霉菌和细菌及植物中，可专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。酵母蔗糖酶的分子量约270000D（因来源不同，分子量有差异），pI约5.6，最适pH4.6，耐酸和热，最适温度50。耐乙醇，因此可用乙醇沉淀进行分离纯化。二、酵母蔗糖酶的分离纯化本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：甲苯抽提，加热纯化，乙醇分级沉淀，离子交换柱层析分离纯化。前三步分离纯化的原理如下： 甲苯 石英砂 离心 上层（甲苯层）：脂溶性物质酵母细胞 破细胞 中层（水层）：蔗糖酶，可溶性糖等研磨 下层（沉淀）：细胞碎片、变性蛋白等 取中层 50水浴中 使热不稳定蛋白变性 离心 上清：蔗糖酶、可溶性糖等（水层） 保温30分钟 沉淀：变性蛋白取上清 加乙醇 使蔗糖酶沉淀 离心 上清：杂蛋白及可溶性糖等冰浴中20分钟 沉淀：蔗糖酶、杂蛋白等三、蔗糖酶活力的测定原理蔗糖酶蔗糖 葡萄糖 + 果糖 (G和F都具半缩醛羟基，该半缩醛羟基可被pH4.55.5 氧化为羧基，这样的糖称还原糖) OH -还原糖 + 3，5-二硝基水杨酸 糖酸 + 3-氨基-5-硝基水杨酸 （棕红色，540nm处具特征光吸收，OD值与还原糖含量成正比，可据此进行比色测定）蔗糖酶活力单位定义：一定条
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