硫丹检测试剂盒使用说明.doc

硫丹检测试剂盒使用说明1.检测原理 该试剂盒基于免疫学中抗原抗体的反应原理制成。硫丹抗体包被于酶标板孔中，样品中存在的硫丹能与硫丹酶标记物竞争性地结合板中定量的抗体，采用直接竞争酶联免疫吸附法检测硫丹。1.1 含有硫丹的样品提取液加到包被有抗体的酶标板中，同时加入硫丹酶标记物，两者竞争性的结合抗体结合位点。1.2 混合物室温放置60分钟，然后将未结合的物质洗掉。1.3 将底物溶液加入酶标板中，与酶作用后显色。因为酶标板每孔包被有相同量的抗体，每孔将会结合等量的游离抗原及酶标记抗原，当样品中含有较多的硫丹时，每孔抗体结合的酶标记抗原的量则少，酶显色后的颜色则浅，反之，颜色深，因此颜色深浅与样品中待检抗原的量成一定相关性。2.产品特性该试剂盒适用于有机氯农药硫丹的快速检测，不能检测其他种类农药。适于土壤，水，蔬菜，水果，茶叶，烟草，畜肉，虾等试样。3.试剂盒组成硫丹标准溶液(10ug/mL)硫丹酶标记物掩蔽剂浓缩液（注：每次使用前需用PBS溶液1：20稀释得到掩蔽剂稀释液）酶底物A液、B液5PBS溶液洗涤液（注：每次使用前需用Millipore超纯水1：5稀释）包被有硫丹特异抗体的96孔酶标板一个（12*8）4.试剂盒未提供而检测需要的其他试剂及设备4.1仪器酶标仪(含450nm,650nm)单道微量移液器：1-20 uL，2001000 uL 和10005000 uL多道移液器：50200 uL振荡器：用于样品提取玻璃器皿：玻璃瓶，试管，量筒洗板机或洗瓶：用以冲洗酶标板涡旋混合器4.2试剂终止液： 1.25M硫酸掩蔽剂稀释液：将试剂盒提供的掩蔽剂浓缩液用PBS溶液1：20稀释磷酸盐缓冲液PBS：13.8g Na2HPO4.12H2O ，1.6 g NaH2PO4.H2O，9.0 g NaCl，溶于1L超纯水中，调pH7.4溶液：含10甲醇的掩蔽剂稀释液5. 样品处理5.1前处理干燥产品：将样品全部磨碎，四分法缩分。水果蔬菜类：如有泥沙，先用水洗掉，然后除去表面附着的水分，取食用部分，沿纵轴剖开，切成四等分，取相对的两块，切碎，混匀。5.2提取红豆，绿豆，芹菜：称取10g粗粉碎样品到玻璃瓶中，加入50mL甲醇，机械振荡（250rpm/min）提取1小时。静置，吸取少量上清液用掩蔽剂稀释液稀释20倍后进行测定。水果：称取10g粗粉碎样品到玻璃瓶中，加入50mL甲醇，机械振荡（250rpm/min）提取1小时。静置，吸取少量上清液用掩蔽剂稀释液稀释20倍后进行测定。蔬菜（大白菜，蒜，葱，茼蒿，小松菜，甘蓝，芦笋）：称取5g粗粉碎样品到玻璃瓶中，加入25mL甲醇，机械振荡（250rpm/min）提取过夜。静置，吸取少量上清液用掩蔽剂稀释液稀释10倍后进行测定。胡萝卜：称取5g粗粉碎样品到玻璃瓶中,加入25mL甲醇，机械振荡（250rpm/min）提取过夜。静置,吸取少量上清液用掩蔽剂稀释液稀释15倍后进行测定。牛肉,羊肉,鸡肉：称取10g粗粉碎样品到玻璃瓶中，加入20mL甲醇，涡旋剧烈混合2min，过滤,吸取少量上清液用掩蔽剂稀释液稀释10倍后进行测定。姜,毛豆:称取10g粗粉碎样品到玻璃瓶中,加入20mL甲醇,机械振荡(250rpm/min)提取1小时。静置,吸取少量上清液用掩蔽剂稀释液稀释50倍后进行测定。花生：称取10g粗粉碎样品到玻璃瓶中，加入20mL甲醇，机械振荡（250rpm/min）提取1小时。25，4800r/min下离心5min，吸取少量上清液用掩蔽剂稀释液稀释100倍后进行测定。菠菜：称取5g粗粉碎样品到玻璃瓶中，加入25mL甲醇，机械振荡（250rpm/min）提取过夜。静置,吸取少量上清液用掩蔽剂稀释液稀释80倍后进行测定。茶叶：称取5g粗粉碎样品到玻璃瓶中，加入25mL甲醇，机械振荡（250rpm/min）提取过夜。静置，吸取少量上清液（一般为20uL-50uL）用掩蔽剂稀释液稀释900倍后进行测定。烟草：称取10g粗粉碎样品到玻璃瓶中,加入50mL甲醇，机械振荡（250rpm/min）提取1小时。静置,吸取少量上清液用掩蔽剂稀释液稀释200倍后进行测定。鳗鱼：取5g 待测样，搅碎后加入10ml甲醇，漩涡混匀提取2 min，用滤纸过滤；取滤液，用掩蔽剂稀释液稀释40倍。虾：称取10g待测样，搅碎后加入20g无水硫酸钠搅匀，再加入20ml丙酮和1.04M硫酸锌溶液、0.36M亚铁氰化钾各200l，漩涡混匀提取2 min；25，4800r/min下离心5min。取全部上清液浓缩至干；加入50%甲醇水8ml，充分溶解，滤纸过滤。注：1.此方法需要阴性样做标准曲线。阴性样处理方法同待测样，梯度稀释方法可参考6.1.2硫丹标准溶液的稀释，以阴性样品溶液代替溶液。6分析步骤检测前将所有的试剂和待测样品放置至室温，在操作过程中，不要将底物暴露在阳光下。6.1试剂准备6.1.1按4.2中试剂配方配制分析所需的试剂6.1.2硫丹标准溶液的稀释从10 ug/mL的硫丹标准溶液试剂瓶中取10uL,用990uL溶液稀释100倍,得到100 ug/L的硫丹标准溶液,进一步用溶液进行1:3梯度稀释,得到一系列不同浓度的硫丹标准溶液(100 ug/L,33.3 ug/L, 11.1 ug/L, 3.7ug/L, 1.2 ug/L 0.4 ug/L)。6.1.3硫丹酶标记物的稀释从硫丹酶标记物试剂瓶中准确移取25uL酶标记物，加入9975uL PBS（磷酸盐缓冲液），充分混匀，即为所需浓度的酶标记物。6.1.4酶底物液的配置将底物A液和底物B液用前按32：1的体积比例混合得底物液，可据实际需要,确定所需底物液量,每孔需加150 uL ,底物液应在使用前15min内配制完毕。6.2分析操作6.2.1 在微孔中分别加入100 uL不同浓度的硫丹标准溶液和样品待测液；6.2.2 当测定的样品是水样时，在空白和对照微孔中分别加入100 uL的超纯水，当测定的样品是其它样品时，在空白和对照微孔中分别加入100 uL的相应的样品稀释液，例如：茶叶样品，应在空白和对照微孔中分别加入100 uL的溶液；6.2.3 除空白微孔外，在每个微孔中加入100 uL的稀释的酶标记物；空白微孔中则加入100 uL PBS；6.2.4 室温孵育60分钟；6.2.5 将板中的液体倒掉，用洗涤液洗涤3次，用吸水纸拍干；6.2.6每个微孔中加入混合好的酶底物液150 uL，除空白外，其余微孔应显示为蓝色；6.2.7 室温放置30分钟后，每个微孔加入50 uL的终止液，轻轻晃动酶标板，使板内液体混匀，除空白外，其余微孔应显示为黄色； 6.2.8立即在酶标仪上读出每孔450nm-650nm吸光值，该过程应当迅速。7结果分析7.1抑制率的计算抑制率100A是450nm吸光值与650nm吸光值的差值X轴为硫丹浓度，y轴为抑制率，以硫丹浓度对数值及相应抑制率作图，标准曲线是典型的S型曲线。7.2硫丹含量计算根据样品孔的抑制率查标准曲线求得实测样中硫丹浓度，根据公式换算成实际样品中硫丹含量。硫丹浓度(ug/kg，ng/g) = CRMC 根据样品孔的抑制率查得实测样中硫丹浓度(ng/mL)R 某类样品的换算系数M 调整待测液浓度,使其在标准曲线范围内时所需对待测液稀释的倍数不同类样品的R值牛肉，羊肉，鸡肉：20大白菜，蒜，葱，茼蒿，小松菜，甘蓝，芦笋：50胡萝卜：75芹菜，绿豆，红小豆，毛豆，姜：100水果：100 花生：200菠菜：400 茶叶：4500烟草：1000虾：0.8鳗鱼：80附：硫丹标准曲线示意图注意事项 检测用水为Millipore 超纯水如果不使用试剂盒中推荐的溶液，可能造成实验结果的不准确酶标物稀释8h后不能继续使用试剂盒应贮存于48试剂盒放置于室温不要超过4h试剂盒不能置于0以下使用前，保证试剂盒内各溶液达到室温操作过程中请勿将底物液见光试剂盒过期后请勿使用不同试剂盒中溶液请勿混用技术咨询方式：FAX Tel:022-60601