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提高维生素C发酵中山梨醇转化率的自动控制补料方法研究 摘要：维生素C生产中的重要一步是L-山梨糖发酵。该发酵采用细菌将D-山梨醇氧化为L-山梨糖，分批发酵时，存在明显的底物抑制作用，因此很难获得高产率的山梨糖，而通过补料方式可消除底物抑制作用，改善山梨糖产率。本文在山梨糖发酵分批时采用了两种不同的补料方法：以0.6lh-1的恒定速率补入山梨醇含量为600gl-1的营养物，山梨糖的产率为12.64 gl-1h-1;以0.5-0.04lh-1的线性降低速率补入山梨醇含量为600gl-1的营养物，山梨糖的产率为17.01gl-1h-1。在产率方面后一种补料方式具有明显的优势，可以提高山梨糖产率，是较好的底物补料方法。 关键词：弱氧化醋酸杆菌 山梨醇 山梨糖 补料方法 1 材料和方法 1.1 材料 70%山梨醇溶液，酵母粉，磷酸二氢胺，硫酸镁。 1.2 菌种及种子培养 菌种：NRRLB-72。 种子培养：培养48小时后的成熟斜面接种于试管，试管培养基装量为10ml，30静止培养72小时，接种于1L摇瓶，摇瓶培养基装量为100ml，控制温度在30，摇床转速250rpm条件下发酵培养。 1.3 发酵培养 1.3.1 发酵条件 发酵采用7.0L搅拌发酵罐，培养基配方如上，通气量2.2vvm，转速700rpm，培养温度30，pH通过加入3N HCl自动控制在6.0。 1.3.2 600gl-1 山梨醇，0.6lh-1衡速补料分批发酵 发酵初始，体积为2.5L，山梨醇浓度为100gl-1 ，当生物量达4.2gl-1 时(对数生长期，约发酵8小时)开始以0.6lh-1衡速补入2.0L含有600gl-1 山梨醇的培养基，为了排除其他影响，培养基中其余成分按山梨醇比例相应增加。补料结束后继续发酵至山梨醇完全耗尽。 1.3.3 补料速率线性降低分批发酵 发酵中补料速率线性降低：F=500.00-62.64t(F单位是ml h-1，t单位是h)。发酵初始，体积为2.5L，山梨醇浓度为100gl-1 ，当生物量达3.8gl-1 时(约发酵6小时)开始补入2.0L含有600gl-1 山梨醇的培养基，为了排除其他影响，培养基中其余成分按山梨醇比例相应增加，补料速率线性降低(0.5-0.04lh-1)。补料结束后继续发酵至终点。 1.4 山梨糖总产率的计算 山梨糖总产率计算如下：产生的山梨糖(gl-1)/发酵周期(h)。 2 结果与讨论 2.1 600gl-1 山梨醇，0.6lh-1恒速补料分批发酵 0.6lh-1恒速补料对发酵的影响。此条件下发酵周期、生物量、山梨糖浓度分别为25小时、9.85、316.00gl-1 ，山梨糖总产率为12.16 gl-1 h-1。由于补料较快，导致发酵11.5小时时反应液中山梨醇浓度由10gl-1 突然增至210gl-1，不利于菌体的生长，这也可能是山梨糖产率降低的原因，此时后山梨糖产率一直较低16.5 gl-1 h-1 。因此，为了在高山梨糖浓度时依然获得高产率，需要改变补料速率使山梨醇浓度低于抑制水平。 2.2 补料速率线性降低的分批发酵 由于补料过快，使山梨醇浓度由10gl-1 突然累积到210gl-1，产生底物抑制作用，这样补料结束后，仍需要发酵一段时间。为了消除这一不利影响采取将补料速率线性降低(起始0.5lh-1)的方法。理论上，发酵与补料同时结束，有利于缩短发酵周期，提高山梨糖产率。 补料速率线性降低时的微生物生长和山梨醇、山梨糖浓度，发酵周期、生物量、山梨糖浓度分别为16小时、12.41、272.37gl-1，山梨糖总产率为17.01 gl-1 h-1 。 此补料方法与衡速补料相比，可以降低培养过程中山梨醇浓度(50-120 gl-1 ，6-13h;10-210 gl-1 ，8-11.5h)减弱对菌体生长的抑制作用(生物量12.41，9.85)，补料结束后 再发酵时间也由13.5h降低到3h。实验结果表明补料速率线性降低是个好方法，可以提高山梨糖产率。 在分批发酵的补料策略方面，也有许多其他方面的报道，Bosjnak et等尝试采用梯度补料，山梨糖产率为11.62gl-1 h-1;Mori 等采用纯氧通气，提高山梨糖产率到44.85 gl-1 h-1，但不经济;Srivastava和Lasrado的补料发酵研究山梨糖产率为12.6gl-1 h-1。与这些研究结果相比，补料速率线性降低优势明显。 3 结语 在山梨糖补分批发酵中，山梨醇浓度为600 gl-1的培养基以0.6 l h-1衡速补料时，发酵周期25h，山梨糖产率及产量分别为12.64 gl-1 h-1和316.00gl-1;然而，以线性降低速率补料时，发酵周期16h，山梨糖产率及产量分别为17.01 gl-1 h-1和272.37gl-1。前者由于补料速度过快，使发酵液中山梨醇浓度处于抑制水平，延长了发酵周期，形成所谓二次分批发酵;而后者补料量呈线性递减，发酵液中山梨醇始终处于较适宜浓度，随着发酵进入恶化阶段，补入的山梨醇量也逐渐减少，这样使发酵达到最优化。 参考文献 Lockwood LB. Ketogenic fermentation procesermentatint J. Microbial processes for ascorbic acid biosynthesis： arevodaran M， Subramanian SS. Bact