制药工程专业微生物实验讲义.doc

实验1: 显微镜的使用及细菌形态的观察（2学时）目的要求(1) 熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能。(2) 学习并掌握油镜的原理和使用方法。1. 基本原理显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成。 油镜物镜的基本原理微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜（16mm，10）、高倍物镜（4mm，4045）和油镜（18 mm，95100）三种。油镜通常标有黑圈或红圈，也有的以“OI字样表示，它是三者中放大倍数最大的。根据使用不同放大倍数的目镜，可使被检物体放大10002 000多倍。油镜的焦距和工作距离（标本在焦点上看得最清晰时，物镜与样品之间的距离）最短，光圈则开得最大，因此，在使用油镜观察时，镜头离标本十分近，需特别小心。使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n=152，与玻璃相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样就减低了视野的照明度。利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径，因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（称为镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用下列公式表示：NAnsin式中 NA=数值孔径；n=介质折射率；=最大入射角的半数，即镜口角的半数。因此，光线投射到物镜的角度愈大，显微镜的效能就愈大（图-5），该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时，的理论限度为90，sin90=1，故以空气为介质时（n=1），数值孔径不能超过1，如以香柏油为介质时，则n增大，其数值孔径也随之增大。如光线入射角为120，其半数的正弦为sin60=087，则：以空气为介质时：NA=1087=087以水为介质时：NA=133087=115以香柏油为介质时：NA=152087=132显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值孔径成正比，与光波长度成反比。因此，物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，则显微镜的分辨力愈大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。因此，一个高的分辨力意味着一个小的可分辨距离，这两个因素是成反比关系的，通常有人把分辨力说成是多少微米或纳米，这实际上是把分辨力和最小分辨距离混淆起来了。显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示的。式中=光波波长。我们肉眼所能感受的光波平均长度为055m，假如数值孔径为065的高倍物镜，它能辨别两点之间的距离为042m。而在042m以下的两点之间的距离就分辨不出，即使用倍数更大的目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用数值孔径更大的物镜，增加其分辨力才行。例如用数值孔径为125的油镜时，能辨别两点之间的因此，我们可以看出，假如采用放大率为40倍的高倍物镜（NA=065），和放大率为24倍的目镜，虽然总放大率为960倍，但其分辨的最小距离只有042m。假如采用放大率为90倍的油镜（NA=125），和放大率为9倍的目镜，虽然总的放大率为810倍，但却能分辨出022m间的距离。2. 材料及器材显微镜、擦镜纸、二甲苯、香柏油、各种细菌微生物制片标本、吸水纸、纱布、瓷盘、酒精灯、接种工具、打火机、试剂瓶、牙签等。3. 方法与步骤(1) 观察前的准备A. 置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约34cm。镜检者姿势要端正，一般用左眼观察，右眼便于绘图或记录，两眼必须同时睁开，以减少疲劳，亦可练习左右眼均能观察。B. 调节光源，对光时应避免直射光源，因直射光源影响物像的清晰，损坏光源装置和镜头，并刺激眼睛。如阴暗天气，可用日光灯或显微镜灯照明。调节光源时，先将光圈完全开放，升高聚光镜至与载物台同样高，否则使用油镜时光线较暗。然后转下低倍镜观察光源强弱，调节反光镜，光线较强的天然光源宜用平面镜；光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜。在对光时，要使全视野内为均匀的明亮度。凡检查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调节光线。(2) 低倍镜观察找目的物(3) 高倍镜观察将高倍镜转至正下方，在转换物镜时，需用眼睛在侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后由目镜观察，并仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜，同时用粗调节器慢慢升起镜筒至物像出现后，再用细调节器调节至物像清晰为止，找到最适宜观察的部位后，将此部位移至视野中心，准备用油镜观察。(4) 油镜观察A. 用粗调节器将镜筒提起约2cm，将油镜转至正下方。B. 在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。C. 从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头。D. 从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物像为止，然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。E. 用同样的方法观察枯草芽孢杆菌染色标本。F. 观察完毕，上旋镜筒。先用擦镜纸拭去镜头上的油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留油迹，最后再用干净擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布擦净显微镜的金属部件。G. 将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将接物镜转成八字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。4. 实验作业(1) 分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的状态，包括在三种情况下视野中的变化，同时注明物镜放大倍数和总放大率。(2) 在使用高倍镜和油镜进行调焦时，应将镜筒徐徐上升还是下降？为什么？(3) 用油镜观察时，为什么要在载玻片上滴加香柏油？实验2: 细菌的革兰氏染色（2学时）1. 目的要求(1) 学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的革兰氏染色方法。(2) 巩固显微镜的使用方法。2. 基本原理所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐（缩写为MBC），它可被电离成正、负离子。带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫、碱性复红、番红（又称沙黄）等。细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。3、材料及器材(1) 载玻片，接种环，双层瓶，生理盐水，嗜碱性美蓝染色液，石炭酸复红染色液；显微镜、擦镜纸、二甲苯、香柏油、吸水纸、纱布、瓷盘、酒精灯、接种工具、打火机、试剂瓶、牙签等、培养箱、灭菌锅、革兰氏染色液。(2) 白萄球菌，枯草芽孢杆菌菌种、大肠杆菌菌种、金黄色葡萄球菌菌种、乳酸菌种4 方法与步骤A、革兰氏染色(1) 涂片将培养1416小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰12次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。(2) 初染 加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。(3) 媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。(4) 脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约2030秒钟，立即用水冲净酒精。(5) 复染 用番红液染12分钟，水洗。(6) 镜检 干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。(7) 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。5、实验作业(1) 在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各染成何色？它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌？(2) 作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？(3) 当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？(4) 绘图实验3：细菌的芽孢染色（2学时）1. 目的要求学习并掌握芽孢染色法。观察细菌的鞭毛2. 基本原理芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿或碱性品红在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。3. 材料及器材(1) 枯草芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌、鞭毛菌装片(2) 孔雀绿染液，番红水溶液，苯酚品红溶液，黑色素溶液等。载玻片，接种环，双层瓶，生理盐水，嗜碱性美蓝染色液，石炭酸复红染色液；显微镜、擦镜纸、二甲苯、香柏油、吸水纸、纱布、瓷盘、酒精灯、接种工具、打火机、试剂瓶、牙签等、培养箱、灭菌锅、革兰氏染色液。4. 方法与步骤方法1、（1） 将培养24小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。（2） 滴加35滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。（3） 用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约45分钟。这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约76）染10分钟。（4） 倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。（5） 用番红水溶液复染1分钟，水洗。（6） 待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。观察细菌的鞭毛装片。5. 实验作业结果绘图表示你观察到的两种芽孢杆菌的芽孢在形状、大小、着生位置上有什么不同？绘鞭毛菌图实验4: 放线菌、酵母菌和霉菌的形态观察（2学时）1. 目的要求掌握观察放线菌、酵母菌和霉菌形态的基本方法，并观察其形态特征。2. 基本原理酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化，菌体比细菌大。繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过用美蓝染色制成水浸片，和水-碘水浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对酵母的活细胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。但美蓝的浓度、作用时间等均有影响，应加注意。霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，而且孢子很容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片其特点是：(a)细胞不变形；(b)具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间；(c)溶液本身呈蓝色，有一定染色效果。霉菌自然生长状态下的形态，常用载玻片观察，此法是接种霉菌孢子于载玻片上的适宜培养基上，培养后用显微镜观察。此外，为了得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态还可利用玻璃纸透析培养法进行观察。此法是利用玻璃纸的半透膜特性及透光性，将霉菌生长在覆盖于琼脂培养基表面的玻璃纸上，然后将长菌的玻璃纸剪取一小片，贴放在载玻片上用显微镜观察。放线菌的插片培养法：放线菌的菌丝沿盖玻片生长，可清楚观察菌丝呈管状，孢子丝的形态 3、材料及器材(1) 曲霉，青霉，根霉，毛霉、5406放线菌培养物及装片(2) 乳酸石炭酸棉蓝染色液，查氏培养基平板，马铃薯培养基；显微镜，载玻片，接种环，双层瓶，生理盐水，、擦镜纸、二甲苯、香柏油、吸水纸、纱布、瓷盘、酒精灯、接种工具、打火机、试剂瓶、牙签等、培养箱、灭菌锅、冰箱、超净工作台、盖玻片等4、方法与步骤放线菌的观察：在载玻片上滴一滴香柏油-抽出培养好的盖玻片-檫净背面-放在玻片上-低倍镜下找一条白白的粉线-高倍镜下观察。 在高倍镜下观察放线菌装片。霉菌的观察于洁净载玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液-用解剖针从霉菌菌落的边缘处取小量带有孢子的菌丝置染色液中，再细心地将菌丝挑散开-小心地盖上盖玻片，注意不要产生气泡-置显微镜下先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜。 在低倍镜或高倍镜下观察霉菌装片。5、 实验作业(1) 绘图说明你所观察到的霉菌形态特征、放线菌的形态(2) 比较细菌、放线菌、酵母菌和霉菌形态上的异同 实验5: 培养基的配制和高压蒸汽灭菌（2学时）1. 目的要求3、 了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。4、 了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。5、 熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。2. 基本原理培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养基质，用以培养或分离各种微生物。因此，营养基质应当有微生物所能利用的营养成分（包括碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素）和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。3. 材料及器材(1) 药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO47H2O、FeSO47H2O等。(2) 高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫外线杀菌灯、其它：天平、牛角匙、电炉、1N HCl、1N NaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、标签、试管架、扎线、橡皮筋、记号笔、纱布等4. 方法与步骤(1) 培养基的配制：A. 培养基的种类据组成成分可分为：合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。从培养基的物理状态可分为：液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。半固体培养基：在液体培养基中加入0.5-1%凝固剂而成的半固体状培养基。常用凝固剂为琼脂（其次为明胶）B. 培养基的配制方法和步骤称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解调pH值：用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水分装：注意不要污染棉塞包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基灭菌备用：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用 (2) 分离培养微生物常用器皿的准备：清洗一些玻璃仪器：如三角烧瓶、试管、培养皿、吸管等棉塞的制作及包装培养皿和吸管等(3) 加压蒸汽灭菌法其步骤如下:接通电源，进行加热。排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀。当压力达15bl/in2（即1.05kg/cm2）时，此时灭菌器内的温度为1210C，维持20min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。(4) 培养基和玻璃器材的灭菌方法间歇灭菌法:待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，每次煮沸1h，连续3d重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在370C恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。5. 实验作业(1) 固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？(2) 培养基中加琼脂的作用是什么？(3) 干热灭菌、高压蒸汽灭菌和间歇灭菌的场合有何不同？(4) 如何检查培养基灭菌是否彻底？实验6: 理化因素对微生物的影响（2学时）1. 目的要求了解紫外线、化学试剂、抗生素的杀菌作用2. 基本原理各种外界因素如紫外线、化学试剂、抗生素对微生物的生长有抑制甚至杀灭作用。紫外线具有杀菌能力，但穿透力不强。许多化学试剂能使蛋白质变性、妨碍代谢中某些重要酶的活力或损毁细胞膜等。抗生素能选择性的妨碍细菌代谢过程中某一或几个环节。3. 材料及器材菌种：大肠杆菌、葡萄球菌培养基：营养琼脂培养基试剂：碘伏、过氧乙酸，、龙胆紫、84消毒液、青霉素、庆大霉素、HgCL2其它：星形黑色亮光纸片、无菌滤纸片、镊子、无菌棉签、紫外灯、接种箱4. 方法与步骤紫外线用棉签蘸取菌液致密接种于营养琼脂平板上。把镊子在火焰上迅速通过23次以杀灭其表面杂菌，镊取“H”或“五角形”黑纸片贴于培养基的中央。打开平皿盖，至于紫外灯管下直接照射30min。揭去黑纸片，把纸片丢弃于消毒缸内。盖好皿盖，2837培养1824h后观察结果。可见到培养基上出现与黑纸片形状相同的“H”或“五角形”菌苔，其余部分没有细菌生长。化学试剂用棉签蘸取菌液致密接种于营养琼脂平板上。用无菌镊子夹取4个圆形无菌滤纸片，分别浸于碘伏、过氧乙酸、龙胆紫、84消毒液内，再一一取出，分别放在已接有细菌的平板上，各纸片间距离大小大致相等。2837培养1824h后观察各消毒纸片周围有无抑菌圈，并比较抑菌圈大小。抗生素用棉签分别蘸取两种菌液接种于营养琼脂平板上，一个平板接种一种菌。用无菌镊子夹取2个圆形无菌滤纸片，分别浸于青霉素、庆大霉素内，再一一取出，分别放在已接有细菌的平板上，各纸片间距离大小大致相等。2837培养1824h后观察结果，测量抑菌圈直径。5. 实验作业记录抑菌圈大小青霉素链霉素碘酒过氧乙酸龙胆紫HgCI2大肠杆菌mmmmmmmmmmmm葡萄球菌mmmmmmmmmmmm附录1： 染色液的配制一、吕氏(Loeffler)碱性美蓝染液 A液：美蓝(methylene blue) 06g95%酒精 30mlB液：KOH 001g蒸馏水 100ml分别配制A液和B液，配好后混合即可。二、齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液 A液：碱性复红(basic fuchsin) 03g95%酒精 10mlB液：石炭酸 50g蒸馏水 95ml将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使其溶解，配成A液。将石炭酸溶解于水中，配成B液。混合A液及B液即成。通常可将此混合液稀释510倍使用，稀释液易变质失效，一次不宜多配。三、革兰氏(Gram)染色液 1草酸铵结晶紫染液A液：结晶紫(crystal violet) 2g95%酒精 20mlB液：草酸铵(ammonium oxalate) 08g蒸馏水 80ml混合A、B二液，静置48小时后使用。2卢戈氏(Lugol)碘液碘片 10g碘化钾 20g蒸馏水 300ml先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分。395%的酒精溶液。4番红复染液番红(safranine O) 25g95%酒精 100ml取上述配好的番红酒精溶液10ml与80ml蒸馏水混匀即成。四、芽孢染色液 1孔雀绿染液孔雀绿(malachite green) 5g蒸馏水 100ml2番红水溶液番红 05g蒸馏水 100ml3苯酚品红溶液碱性品红 11g无水酒精 100ml制法取上述溶液10ml与100ml5%的苯酚溶液混合，过滤备用。4黑色素(nigrosin)溶液水溶性黑色素 10g蒸馏水 100ml称取10g黑色素溶于100ml蒸馏水中，置沸水浴中30分钟后，滤纸过滤二次，补加水到100ml，加05ml甲醛，备用。五、荚膜染色液1黑色素水溶液黑色素 5g蒸馏水 100ml福尔马林(40%甲醛) 05ml将黑色素在蒸馏水中煮沸5分钟，然后加入福尔马林作防腐剂。2番红染液与革兰氏染液中番红复染液相同。六、鞭毛染色液 A液：单宁酸 5gFeCl3 15g蒸馏水 100ml福尔马林(15%) 20mlNaOH(1%) 10ml配好后，当日使用，次日效果差，第三日则不宜使用。B液：AgNO3 2g蒸馏水 100ml待AgNO3溶解后，取出10ml备用，向其余的90mlAgNO3中滴入浓NH4ON，使之成为很浓厚的悬浮液，再继续滴加NH4OH，直到新形成的沉淀又重新刚刚溶解为止。再将备用的10mlAgNO3慢慢滴入，则出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状沉淀又消失，再滴入AgNO3，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。如所呈雾不重，此染剂可使用一周，如雾重，则银盐沉淀出，不宜使用。九、乳酸石炭酸棉蓝染色液石炭酸 10g乳酸(比重121) 10ml甘油 20ml蒸馏水 10ml棉蓝002g将石炭酸加在蒸馏水中加热溶解，然后加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，使其溶解即成。 附录2 ： 培养基 1、牛肉膏琼脂培养基牛肉膏0.3克 ，蛋白胨1.0克，氯化钠 0.5克，琼脂 1.5克，水 100毫升在烧杯内加水100毫升，放入牛肉膏、蛋白