超声波辅助提取女贞子有效成分及其含量分析.doc

摘要】 目的以女贞子为原料，采用乙醇作为提取溶剂，探讨超声频率、溶剂浓度、料液体积比、超声提取时间等影响因素对女贞子中的齐墩果酸含量的影响。方法超声波辅助提取女贞子中齐墩果酸并用高效液相色谱仪检测其含量。结果超声波辅助提取齐墩果酸的适宜工艺条件为：料液体积比540，乙醇浓度95%，超声频率44 000 Hz，提取时间60 min。在此条件下，女贞子中齐墩果酸提取含量可达到(1.2710.002)%。 结论超声波辅助提取女贞子有效成分是行之有效的方法。论文百事通【关键词】 女贞子; 齐墩果酸; 超声波辅助提取女贞子为木犀科植物女贞的干燥成熟果实，具有抗炎、抑菌、降血糖、降血脂、保肝、抑制血栓形成、抗衰老及抗疲劳作用，为临床 治疗 各种肝肾阴虚型疾病的常用中药。近年来，女贞子被作为保健性食品原料进行开发，为女贞子的应用开辟了新途径13。女贞子药源广、价格低廉。我国女贞子主要分布于浙江金华、江苏大丰等地区，其齐墩果酸含量较高，可以作为提取齐墩果酸的原材料之一。石力夫等4采用高效液相色谱法，对女贞子中有效成分齐墩果酸进行了含量测定，测得回收率为97.9%。曹艳丽等5采用薄层扫描法，将女贞子粗粉用乙醇汇流提取后，对齐墩果酸进行含量分析，结果平均回收率为98.83%，周静等6采用气相色谱法，将样品先酸水解，再过滤烘干后，用氯仿提取，测定女贞子中齐墩果酸含量，结果平均回收率为100.6%。传统的中草药提取方法主要有煎煮法、回流法、索氏法、浸泡法、渗漉法等，但大都存在周期长、成分损失大、提取率不高等缺点。近年来，超声辅助提取中草药成分具有提取时间短、提出率高、提取成分完全、污染少、设备简单等优点，得到了广泛的研究79，而超声波辅助提取女贞子中齐墩果酸的相关报道甚少。本文采用超声波辅助提取女贞子中活性成分，然后用HPLC分析萃取产物中的有效成分的含量，以期为超声波辅助提取女贞子有效成分提供行之有效的工艺条件，为 工业 化生产奠定良好的实验基础。 1 材料与仪器 1.1 材料女贞子(成都市医药公司，经鉴定符合 中国 药典的规定);95%乙醇、甲醇为分析纯试剂(成都市科龙化工试剂厂);甲醇(色谱纯，上海陆都试剂厂);齐墩果酸标准品(色谱级，中国药品生物制品鉴定所);色谱用水为Mini-Q水等。1.2 仪器与设备 电子 天平(TB-214，北京赛多利斯);旋转蒸发仪(RE-52B，上海亚荣生化仪器厂);超微台式离心机(WTL，江苏金坛市金城国胜实验仪器厂);真空干燥器(DZF-6021，上海一恒 科学 仪器有限公司);高效液相色谱仪(HPLC-20A，日本岛津)、超纯水仪(Milli-Q，Millopore 公司);KQ-100DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);UV-1000紫外可见分光光度计(日本岛津)。 2 方法 2.1 紫外波长的选择使用齐墩果酸标准品扫描起点300 nm，扫描终点200 nm，扫描间隔1 nm，选择出齐墩果酸最大吸收波长，以指导HPLC的吸收波长。2.2 标准曲线的绘制方法10精密称取齐墩果酸对照品0.001 0 g至试管中，加1 ml甲醇溶解，摇匀，作为对照品溶液(浓度0.001 mg/ml)，即得标准品溶液。精密称取齐墩果酸对照品1 mg，加甲醇定容至1 ml试管中，摇匀，得到1 mg/ml的对照品溶液。分别取对照品溶液3.0，6.0，9.0，12.0，15.0 l进样，记录峰面积。2.3 女贞子的预处理将女贞子粉碎，过40目筛，取一定量的女贞子粉末于恒温鼓风干燥箱中105干燥2 h，备用。2.4 超声辅助回流提取精确称取5g干燥女贞子粉末于500 ml圆底烧瓶中，按照预定条件加入一定量的乙醇，按照一定的超声辅助提取的温度、时间和频率进行超声辅助回流提取，提取完毕后，将提取液于旋转蒸发仪中回流乙醇至无醇味，转至分液漏斗中，加入一定量的正丁醇分3次萃取，合并萃取液，再于旋转蒸发仪中回收正丁醇至无醇味，最后用甲醇定容于50 ml比色管中备用。2.5 游离齐墩果酸含量的测定吸取10 ml萃取液于低速离心机中，3 000 r/min离心5 min，用1 ml移液枪精密吸取1 ml上层清液于EP管中，过0.45 m微孔滤膜滤过，进样检测。测得峰面积代入回归方程 计算 ，最终计算得出提取出来的齐墩果酸含量。 3 结果 3.1 紫外波长选择按照“2.1”的实验方法，选择出齐墩果酸的最大吸收波长为274 nm。3.2 标准曲线的绘制按照“2.2”的实验方法，在高效液相色谱条件为：在色谱柱为Nova PakC18色谱柱(3.9 mm200 mm，5 m，中国依利特公司)，柱温30 ，流动相为甲醇：水(6040，V/V)，流速1 ml/min，检测波长为274nm的色谱条件下，平行测定3次，得出的标准曲线。见图1。经过实验可知，该HPLC条件下标准品在保留时间为4.121 min时，齐墩果酸有吸收峰，在此后的实验中也可根据此来定性判断齐墩果酸的存在。由图1可知，以齐墩果酸标准品的峰面积为横坐标，进样量为纵坐标，绘制标准曲线，经线性回归得出回归方程为：Y=3.892 710-5X-0.559，R=0.999 1，R2=0.998 1。结果表明，当齐墩果酸进样量为0.55915.812 g范围内时呈现良好的线性关系，曲线的重复性较好。图1 齐墩果酸标准品的HPLC标准曲线3.3 提取时间对于游离齐墩果酸含量的影响准确称量组方中的女贞子1 g共5份，分成5组，分别加10倍量的80%乙醇加热回流，5组提取时间为15，30，45，60，90 min，分别测定齐墩果酸的含量。结果见表1。由表1可知，提取率随着超声时间的增加而增加，在45 min时达到较高，之后基本维持恒定，这是因为细胞的渗透压在45 min后便达到了平衡，使提取率保持恒定。所以选择提取时间为45 min。表1 提取时间对齐墩果酸含量的影响3.4 乙醇浓度对于游离齐墩果酸含量的影响固定其他因素不变，准确称量组方中的女贞子1g共5份，分成5组，分别加10倍量的无水乙醇及50%，60%，80%，95%的乙醇，加热回流30 min，分别测定齐墩果酸的含量，见表2。由表2可知，提取率随着乙醇浓度的增加而增加，在95%时达到最高，之后基本维持恒定，这是因为齐墩果酸易溶于弱极性的有机溶剂中，所以提取率会随着乙醇浓度的增大而增加。而从 经济 的角度考虑，无水乙醇比较昂贵，所以选择乙醇浓度为95%。表2 乙醇浓度对齐墩果酸含量的影响3.5 料液比对于游离齐墩果酸含量的影响固定其他因素不变，准确称量组方中的女贞子1 g共4份，分成4组，加6，9，12，15倍量80%乙醇回流提取45 min，测齐墩果酸含量。结果见表3。由表3可知，提取率随着料液比的增加而增加，在12倍量时达到较大，不过从10倍量开始时就基本维持恒定，之间的差别也很小，从经济的角度考虑，选择主料质量10倍量体积的乙醇。3.6 超声频率对于游离齐墩果酸含量的影响固定其他因素不变，准确称量组方中的女贞子1 g共4份，分成4组，超声频率分别取超声波频率(原频率为44 000 Hz)的40%，60%，80%，100%。结果见表4。由表4可知：提取率开始时随着超声频率的增加而增加，在44 000 Hz处达到最大，所以选择本超声波仪最大功率的44 000 Hz为超声频率。表3 料液比对于游离齐墩果酸含量的影响表4 超声频率对于游离齐墩果酸含量的影响3.7 正交实验在单因素实验的基础上，准确称量干燥枇杷叶粉末5 g共9份，固定起始温度为室温25，选取乙醇浓度、提取时间、超声频率与料液比4个因素为变量，每个因素取3个水平(表5)，按照L9(43)安排正交，设计实验，正交设计表如表6所示。表5 正交实验因素表表6 正交实验结果由表6可知，比较R值可以看出，因素的影响顺序为乙醇浓度提取时间超声波频率 料液体积比;并可以看出：齐墩果酸提取的优化条件是A1B3C3D3，即料液体积比540，乙醇浓度95%，超声波频率原功率100%，提取时间60 min。3.8 验证实验验证最优组合A1B3C3D3，在此条件下重复做3次平行实验，按“2.4”中所给方法提取齐墩果酸，按照“2.5”是实验方法 计算 齐墩果酸含量。结果见表7。表7 验证实验结果 4 讨论 齐墩果酸是女贞子中主要的药效成分。本文采用超声波辅助提取女贞子中齐墩果酸，在单因素实验基础上，通过正交实验考察了各单因素之间的相互影响，优化了超声波辅助提取女贞子中有效成分之一