apoB基因多态性研究的意义.docVIP

1.材料和方法1.1材料EcoRI、PCR扩增引物序列均参照Gajra B等1，MspI位点的PCR扩增引物序列参照Soria LF2，3VNTR的PCR扩增引物序列参照罗超权等3，引物的序列如下（由上海铂尚生物技术公司合成）：EcoRI 5primer：CTGAGAGAAGTGTCTTCGAAG 3primer：CTCGAAAGGAAGTGTAATCACMspI 5primer：CTGAGAGAAGTGTCTTCGAAG 3primer：CTCGAAAGGAAGTGTAATCAC3VNTR 5primer：CTGAGAGAAGTGTCTTCGAAG 3primer：CTCGAAAGGAAGTGTAATCAC 模板DNA:健康人口腔黏膜上皮细胞16份(来源随机抽取健康.)PCR MIX（Taq1.25U,dNTP各0.4mM,2PCR Buffer）EcoRI 酶切体系（10l PCR产物、18l双蒸水、2l EcoRI酶切Buffer、1l EcoRI限制内切酶（10U/l）MspI 酶切体系（10l PCR产物、18l双蒸水、2l Msp I酶切Buffer、1l MspI限制内切酶（10U/l）dNTP、抽提缓冲液（100mM Tris，50mM EDTA，200mM NaCl，0.5% SDS，200ug/ml蛋白酶K，pH 8.0)、酚：氯仿( 1：1) 、氯仿：异戊醇( 24：1)、乙醇、70%乙醇、TE 缓冲液仪器：凝胶成像系统、BG-Power300电泳仪、ZD-600标准水箱、小型台式告诉冷冻离心机、Hema3200基因扩增仪、0826微型离心机1.2方法1.2.1口腔粘膜上皮细胞基因组DNA的提取将生理盐水漱口液10ml转移至15ml离心管，8000rpm离心10min。倒出上清，管内白色沉淀即为口腔粘膜上皮细胞。用酚/氯仿提取法从外周白细胞提取基因组DNA：将口腔粘膜上皮细胞细胞重悬于0.5 ml 抽提缓冲液, 65水浴30分钟, 依次加入等体积的酚：氯仿( 1：1) 和氯仿：异戊醇( 24：1) , 分别抽提1 次。DNA 用乙醇洗淀并经70%乙醇洗涤后室温干燥, 加入适量TE 缓冲液溶解，-20保存备用。1.2.2PCR扩增PCR扩增反应体系如上，扩增程序分别如下：EcoRI ：94预变性7 min ；94 变性1 min, 58 复性与延伸3 min, 进行30 个循环；最后72 再延伸5min。MspI：94预变性7min；94 变性1 min, 60 复性1 min, 72 延伸1 min，进行30 个循环；最后72 再延伸5min。3VNTR：94预变性7 min，94变性1 min，60退火及延伸共4 min，进行30个循环，最后60再延伸10min。1.2.3基因多态性的检测与分型EcoRI 酶切位点：通过PCR-RFLP技术检测，先建立31 l酶切体系，混匀后37酶切12小时，65加热20min终止反应。2%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，凝胶成像仪拍照电泳结果。MspI 酶切位点：通过PCR-RFLP技术检测，先建立31 l酶切体系，混匀后37酶切12小时，80加热20min终止反应。2%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，凝胶成像仪拍照电泳结果。3VNTR：PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像仪拍照电泳结果，然后通过软件计算PCR产物的分子量。apoB 3VNTR序列由两端152个保守序列和中间以15bp核心序列多次重复组成，核心序列重复次数由以下公式估算获得：（扩增片段bp 数152 bp）/ 15bp 。2.结果2.1 apoB 3VNTR多态性 16个样本DNA经扩增后均出现1-2条带（纯合子为1条带，杂合子为2条带），其中11个样本为杂合子，5个样本为纯合子。共检出片段大小不同的21条带（如图1）。以15bp为一重复单位，重复次数为31-57次。其中以35-36次较多，占40.7%（见图2）。而38次以上和32次以下出现频率较低。 图1.apoB基因VNTR电泳图 图2.apoB基因VNTR重复次数频数分布表2.2 酶切位点多态性2.2.1 EcoR I酶切位点多态性 apoB PCR产物酶切后可见两种基因型：12个样本有253 bp、227 bp两条碱基片段，是E+ E+型纯合子；4个样本有480bp、253 bp、227 bp三条碱基片段，是E+ E-型杂合子；未见有480 bp一条碱基片段的E- E-纯合子。（见图3） 图3.apoB基因EcoR I酶切电泳图注：2、5、8、10、11、12、13、16、17、18、20、21泳道为E+ E+型，3、4、9、19泳道为E+ E-型，6、14、22泳道为PCR产物未酶切的对照。2.2.2 MspI 酶切位点多态性 apoB PCR产物酶切后可见两种基因型：12个样本有395 bp、85 bp 两条碱基片段，是M+ M+型纯合子；3个样本有480 bp、395 bp、85bp 三条碱基片段的是M+ M-型杂合子，未见有480 bp 一条碱基片段的M- M-型纯合子（见图4）。其中有一样本未见条带。 图4.apoB基因MspI 酶切电泳图注：2、5、6、9、10、11、12、13、16、17、18、19泳道为M+ M+型，3、4、20泳道为M+ M-型，7、14、22泳道为PCR产物未酶切的对照，21泳道未见条带。3. 讨论apoB是人类重要的载脂蛋白，其基因独立位于2号染色体短臂末端（2p23），单拷贝。基因全长43kb，含28个内含子和29个外显子。本次实验主要探究了人群当中apoB基因3端VNTR的多态性，以及EcoR I、MspI两种酶切位点的多态性。本次实验中PCR法检测apoB基因的多态性有以下特点:时间短,一天内可获得结果;反应灵敏,使用的样本量极小;实验操作简单方便;实验要求条件低和设备易得.从实验结果看,VNTR基因的多态性不仅由短重复序列的数量形成,还由同一等位基因中多种核苷酸排列顺序造成.而本实验中,不同样本的酶切位点多态性提示apoB基因的多态性由多个等位基因构成.有相关研究证明apoB基因多态性遗传遵循孟德尔定律10.故本次实验的方法是一种可靠的有应用前景的个体识别和亲权鉴定的方法.有相关研究表明，携带长段apoB基因3端VNTR的人群相较于携带中段或小段apoB基因3端VNTR的人群拥有更高的胆固醇含量，LDL和apoB的浓度也更高。【1】脂代谢的平衡又与多种疾病相关，有研究就表明拥有长片段apoB基因3端VNTR的人群换上胆石症的几率更高，【2】也有更大的可能性换上冠心病。【3】(伟哥的参考文献)另外,它有明显的人群和地域性差异14.自从1989年Ludwig2首先检测到14种等位基因以来，国际上已发现了20多种等位基因，其中7种仅见于黑种人，分别是HVE21，HVE24，HVE25，HVE27，HVE29，HVE31和HVE33。其余的可在白种人和黄种人中发现。Hixson等7分析结果表明，黑种人apoB3VNTR等位基因的分布形式不同于白种人，其特点是，小于HVE33或大于HVE37的等位基因频率而高于白种人(P0.001)。但是，不同地区白种人的相对分布和频率极为相似8。瑞典人和高加索人HVE36最高，而南亚人则以HVE34最高。相比之下，本次实验中汉族人群HVE36的基因频率较低。 以上研究证明apoB基因3VNTR等位基因的多态性分布可为人类起源/进化/迁徙等人类学研究提供资料.10畲族人群载脂蛋白B（apoB）基因多态性遗传规律的研究11ApoB基因多态性与北京房山地区汉族人群脑卒中相关性分析12载脂蛋白BEcoRI基因多态性与中青年人颈动脉粥样硬化的关系13ApoB基因多态性与乳腺癌的相关性研究14血浆载脂蛋白B基因3_端可变数目串联重复序列的结构研究_杜珙2Ludwig EH, McCarthy BJ. High resolution analysis of a hypervariable region in the human apolipoprotein B gene. Am J Hum Genet, 1989, 45:458-4647Hixson JE, Powers PK, McMahan A