牛奶中部分成分测定.doc

牛奶中部分成分的分析摘要：牛奶营养成分很高，富含蛋白质和微量元素钙、铁、锌等，是人们生活中的主要要营养食品之一。因此，分析牛奶中的营养成分含量是很有必要的工作。本实验在普通实验室条件，采用简单科学快捷的方法分析某品牌牛奶中部分成分含量。关键字：牛奶 蛋白质 钙 铁 锌1、实验目的用分光光度法测某牛奶中蛋白质、钙、铁、锌的含量。2、实验原理牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。钙与身体健康息息相关，钙除成骨以支撑身体外，还参与人体的代谢活动，它是细胞的主要阳离子，还是人体最活跃的元素之一，缺钙可导致儿童佝偻病，青少年发育迟缓，孕妇高血压，老年人的骨质疏松症。缺钙还可引起神经病，糖尿病，外伤流血不止等多种过敏性疾病。补钙越来越被人们所重视。牛奶中含有易被人体吸收得钙，有些牛奶产品中还特地加钙而成为钙奶。对于液体牛奶中钙的含量，可采用EDTA法进行直接测定。考虑到牛奶中含有Fe3+、Al3+等干扰离子，可以加入少量三乙醇胺以消除它们的，调节pH1213，以铬蓝黑R作指示剂，指示剂与钙生成红色的络合物，当用EDTA滴定至计量点时，游离出指示剂，溶液呈现蓝色。当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。 吸光度用A表示。 Aabc，其中a为吸光系数，单位L/(gcm),b为液层厚度（通常为比色皿的厚度），单位cm ， c为溶液浓度，单位g/L 影响吸光度的因数是b和c。a是与溶质有关的一个常量。此外，温度通过影响c，而影响A。符号A，表示物质对光的吸收程度。邻二氮菲也叫邻菲啰啉，是测定微量Fe2+的高灵敏度显色剂在pH 29的条件下，Fe2+与邻二氮菲生成稳定的橙红色络合物，在510nm波长处有最大吸收。该配合物的 lgk稳 21.3（20 ），摩尔吸光系数 510 =1.1104Lmol-1cm-1 。 在显色前，首先用盐酸羟胺把 Fe3+ 离子还原为 Fe2+，其反应式如下： 2Fe3+2NH2OHHCl 2Fe2+4H+ +2Cl- +N2 +2H2O测定时，控制溶液的酸度在 pH5 左右较为适宜。酸度高时，反应进行较慢；酸度太低，则 Fe2+离子水解，影响显色。当铁浓度在5.0 mgmL以内时，吸光度与Fe2+浓度呈直线关系。Bi3+、Cd3+、Hg9+、Ag+、Zn2+等离子在 pH 29 时与邻二氮菲生成沉淀。 Co2+， Ni2+， Cu2+等离子可与邻二氮菲形成有色配合物，故应注意它们的干扰。 锌是人体中必需的微量元素之一，锌缺乏会阻碍生长发育，过量又会导致胃癌等疾病。人类从牛奶等饮食中可以获得一定量的锌。在pH4.05.5的水溶液中，锌离子与双硫腙（C13H12N4S）生成红色螯合物，摩尔吸光系数 535 =9.3104Lmol-1cm-1用四氯化碳萃取后比色定量。在选定的pH条件下，用足够量的硫代硫酸钠可掩蔽水中存在的少量铅、铜、镉、钴、铋、镍、金、钯、银、亚锡等干扰金属离子。 3、实验步骤 3.1、试剂的配制3.11、pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液的配制:先配A液与B液。A液：0.2mol/L醋酸钠溶液。B液：0.2mol/L醋酸溶液。取醋酸钠固体6.5461g加水溶解并稀释至100ml，取冰醋酸5mL加水稀释至100ml，混合即得pH4.7的醋酸醋酸钠缓冲液200mL。3.12、乙醇乙醚混合液的配制：取25ml95乙醇与25ml无水乙醚混合3.13、双缩脲试剂：称取CuS045H2O 0.3g，酒石酸钾0.9 g和碘化钾0.5g，分别溶解后混匀，加6 molL-1NaOH 10mL，最后加水至100mL，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。3.14、蛋白质标准液(10mgmL-1)，用小烧杯称取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理盐水溶解后倒入l0mL容量瓶中，淋洗小烧杯数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线。待测蛋白样本：将牛奶样品用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定；将制得的酪蛋白用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定。（如若不能溶解，滴加几滴6mol/L NaOH溶液、分别用l0mL容量瓶定容）3.15、铁标准溶液(40.0gmL-1)：:准确称取0.0345g硫酸铁铵 NH4 Fe (SO4)212H2O于烧杯加入6mL6 molL-1 HCl 和少量水，溶解后用纯水定容至10mL。此溶液1.00mL含有40.0g铁。3.16、盐酸羟胺溶液(100 gL-1)：:称取10g盐酸羟胺(NH2OHHCl)，溶于水，并稀释至100m（新鲜配制，两周内有效）3.17、邻二氮菲溶液(2gL-1):：称取0.20g邻二氮菲(C12H8N2H2O)，溶解于加有2滴浓盐酸的纯水，并稀释至100mL（新鲜配制，两周内有效）3.18、醋酸钠溶液（1.0 molL-1）：:称取8.2030g醋酸钠，用纯水溶解后稀释至100mL。3.19、锌标准溶液（1.00gmL-1）：准确称取0.0100g基准锌于100mL烧杯中，加入6 molL-1HCl 0.5mL，立即盖上表面皿，待锌完全溶解后，以少量水冲洗表面皿及烧杯壁，将溶液转入100mL容量瓶中，定容，即为锌标准贮备溶液。准确移取1mL锌标准贮备溶液，稀释定容至100.0mL，即得1.00gmL-1锌标准溶液。3.20、0.1双硫酸腙四氯化碳贮备溶液：称取0.10g双硫腙（C18H12N4S），在干燥的烧杯中用四氯化碳溶解后稀释至100 mL， 倒入棕色瓶中。此溶液置冰箱内保存，可稳定数周。3.21、双硫腙四氯化碳溶液：临用前，吸取适量双硫腙四氯化碳贮备溶液，用四氯化碳稀释约30倍，至吸光度为0.4（波长535 nm，1cm比色皿）。3.22、25硫代硫酸钠溶液：称取64.60g硫代硫酸钠（Na2S2035H20)，溶于100mL纯水中。3.23、11 氨水溶液:10ml氨水加10ml水稀释3.2、牛奶中酪蛋白的提取3.21、酪蛋白的粗提 50mL鲜牛奶加热至40。在搅拌下慢慢加入预热至40、pH4.7的醋酸缓冲液50mL.用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000 r min-1）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。3.22、酪蛋白的纯化用水洗涤沉淀3次，离心10分钟（3000rmin-1），弃去上清液。在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯品。3.3、酪蛋白含量的测定3.31、标准曲线的绘制与样品的测定 取试管8支，按下表操作。各管混匀、放置37水浴中保温20min。540nm比色，以空白管调零点，读取各管吸光度值。3.32、计算在电脑上以吸光度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。从标准曲线中查出待测样本的蛋白质浓度(gL)，并求出牛奶中蛋白质浓度。由此浓度计算出100mL鲜牛奶中酪蛋白的真实含量。3.4钙含量的测定3.41、钙制剂钙含量的测定 准确移取25ml的鲜牛奶和钙奶，分别转移到100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。 准确移取上述试液20.00mL，加入三乙醇胺溶液5mL，5molL-1NaOH 4mL，加入水20mL，摇匀，加铬蓝黑R810滴，用0.01molL-1EDTA标准溶液滴定，接近终点时再补加23滴铬蓝黑，当溶液由红色变为蓝色即为终点，根据消耗EDTA的体积，计算出鲜奶和钙奶中钙的含量（g/100 mL），并与包装上注明的含量作比较。 3.42、注意事项 量取鲜奶和钙奶的量视钙含量多少而确定，以消耗0.01 molL-1EDTA体积为2030 mL。牛奶、由于钙奶均为乳白色，终点颜色变化不太明显，接近终点时再补加23滴指示剂。 3.5铁含量的测定3.51、标准曲线的绘制取25mL比色管6支，按下表顺序配制铁标准系列并记录测量的数据（注意：加入盐酸 钱干后需摇匀放置2 min，再进行下一步操作），加完试剂后摇匀，放置37水浴中保温15min，以空白液为参比，在510nm下测定各溶液的吸光度值。取25mL比色管2支，按照上表及上述方法测定510 nm下的吸光度值。3.52、计算 在电脑上以吸光度值为纵坐标，以铁质量浓度（gmL）浓度为横坐标绘制标准曲线。利用标准曲线计算鲜奶中铁的含量（mg/100mL）。3.53、样品的测定将50ml鲜奶一滴一滴加到热坩埚中避免沸腾蒸发。除去水份后, 强烈加热至450550 1小时。冷却后, 加1 mL浓硝酸蒸发近干, 重新在450550灼烧（不能溅出）。用少量稀硝酸溶解白色残液, 转入10mL容量瓶中稀释至刻度, 用稀氢氧化钠溶液调pH=78。3.6锌含量的测定3.61、标准曲线的绘制与样品的测定 将70ml鲜奶一滴一滴加到热坩埚中避免沸腾蒸发。除去水份后, 强烈加热至450550 1小时。冷却后, 加1 mL浓硝酸蒸发近干, 重新在450550灼烧（不能溅出）。用少量稀硝酸溶解白色残液, 转入10mL容量瓶中稀释至刻度, 用稀氢氧化钠溶液调pH=78。再用蒸馏水稀释到25ml.可准确吸取1ml水样，用纯水稀释至10.0mL。另取分液漏斗8个，依次加入锌标准溶液0、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00和5.00mL，各加纯水至10mL。向水样与标准系列分液漏斗中各加1滴甲基红指示剂，用11氨水调节溶液刚显黄色，再滴加乙酸溶液至红色（pH约4.4）。加5mL四氯化碳，振摇萃取甲基红，弃去有机相。向各分液漏斗中加入5.0mL缓冲溶液混匀，再加入1.0mL硫代硫酸钠溶液，混匀，再加入10.0mL双硫腙四氯化碳溶液，强烈振荡4min，静置分层。用脱脂棉或卷细的滤纸擦去分液漏斗颈内的水，弃去最初放出的23mL有机相，收集随后流出的有机相于干燥的10mL比色管内。于535nm波长下，用1cm比色皿，以四氯化碳为参比，测定样品和标准系列溶液的吸光度。绘制校准曲线，在曲线上查出样品管中锌的含量。注：本法测锌要特别注意防止外界污染，同时还要避免在直射阳光下操作。加入硫代硫酸钠除了掩蔽干扰金属离子的作用外，同时也兼有还原剂的作用，保护双硫腙不被氧化。由于硫代硫酸钠也能与锌离子络合，因此标准系列中硫代硫酸钠的加入量应与样品管一祥。振荡时间必须充分，因硫代硫酸钠是较强的络合剂，只有使锌从络合物 Zn(S2O3)2-中释放出来，才能被双硫腙四氯化碳溶液萃取。而锌的释放又比较缓慢，因此振荡时间要保证4min，否则萃取不完全。为了使样品和标准的萃取率一致，应尽量做到振摇强度、次数一致。4数据处理4.1牛奶中酪蛋白的提取、酪蛋白含量:6.1354g/100ml得率=4.2酪蛋白含量的测定4.21、标准曲线的绘制与样品的测定123456待测牛奶液待测酪蛋白蛋白质标准液(mL)0.200.400.600.801.00待测蛋白样品(mL)1.001.000.9%NaCl(mL)1.000.80.600.400.20-双缩脲试剂(mL)4.004.004.004.004.004.004.004.00蛋白质浓度（g/L）00.40.81.21.62.04.9573.094吸光度A00.0990.1960.3000.4010.5081.2540.78164.22、计算在电脑上以吸光度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。从标准曲线中查出待测样本的蛋白质浓度(gL)，并求出牛奶中蛋白质浓度。由此浓度计算出100mL鲜牛奶中酪蛋白的真实含量。故拟合所得y=-0.0029+0.25357x,相关系数r=0.999884.3钙含量的测定4.31、钙制剂钙含量的测定 鲜牛奶高钙奶牛奶样液/ml202020202020EDTA/ml前18.932.14.4011.208.0021.55后31.945.218.5024.9021.8035.20消耗/ml13.013.114.1013.7013.8013.65平均值/ml13.4013.72含钙量（g/100ml）0.1070.110100ml鲜奶含钙量：鲜奶包装上含钙量为100ml鲜奶含0.102g0.107g钙与测量结果基本相符100ml高钙奶含钙量：而高钙奶包装注明含钙量为100ml高钙奶含0.130g0.140g钙远远高于测量结果，说明高钙奶含钙量名不符实。4.4铁含量的测定4.41、标准曲线的绘制123456测定管1测定管2铁标准溶液(mL)0.000.501.001.502.002.50待测铁溶液0.000.000.000.000.000.001.001.00盐酸羟胺溶液(mL)0.500.500.500.500.500.500.500.50邻二氮菲溶液(mL)1.001.001.001.001.001.001.001.00醋酸钠溶液(mL)2.002.002.002.002.002.002.002.00铁溶液浓度（）0.000.801.602.403.204.000.2940.203蒸馏水(mL)稀释至25mL吸光度00.1770.3770.5810.7090.8740.0770.057故拟合所得y=0.01229+0.22036x,相关系数r=0.99773当吸光度y=0.077时，铁溶液浓度x=0.294当吸光度y=0.057时，铁溶液浓度x=0.249故其平均值为0.249每100ml鲜奶中铁含量为0.249=0.125mg4.5锌含量的测定4.51、标准曲线的绘制与样品的测定 锌标准溶液/ml蒸馏水缓冲溶液/ml硫代硫酸钠/m双流腙四氯化碳/ml标准液浓度/吸光度10稀释至10ml511000.10620.5051100.050.14831.0051100.10.19241.5051100.150.23852.0051100.20.27363.0051100.30.34274.0051100.40.39885.0051100.50.442待测样1.0051100.3610.368故拟合所得线性方程为y=0.