本科生科研兴趣培养计划项目-纳米零价铁对土壤氨氧化微生物群落演变的影响申报书.doc

四川农业大学本科生科研兴趣培养计划项目申报书 项目名称 纳米零价铁对土壤氨氧化微生物群落演变的影响 项目负责人 王学忠 学 院 资源学院 联系电话申报日期 2015-11- 4 四川农业大学制表项目名称纳米零价铁对土壤微生物群落演变的影响起止时间 2015 年 11 月至 2016 年 11 月负责人姓名学号年级所在学院、专业联系电话E-mail王学忠201373232013级资源学院 土地资源管目组成员贾洋措201373212013级资源学院 土地资源管兴波201373242013级资源学院 土地资源管 师姓名李云职务/职称副教授通讯地址四川农业大学成都校区电话-一、 立项依据（项目意义、现状分析等）氮循环是描述自然界中氮单质和含氮化合物之间相互转换过程的生态系统物质循环，构成氮循环的主要环节是生物体内有机氮的合成、氨化作用、固氮作用、硝化作用和反硝化作用。其中固氮作用、硝化作用以及反硝化作用对于土壤的氮素循环意义重大2，硝化作用是土壤氮素转化的重要过程,不仅关系到铵态氮在土壤中的转化,而且与过量氮肥投入导致的土壤酸化、硝酸盐淋失及其引起的水体污染和温室效应等一系列生态环境问题直接相关3，因而与此相关土壤氨氧化微生物一直是研究的热点。 一直以来,氨氧化细菌(AOB)被认为是自养氨氧化过程的最重要贡献者。然而,泉古菌门中的化能自养氨氧化古菌(AOA)的发现,将氨氧化微生物由细菌域推进到古菌域4，有研究表明在高氮投入的中性和碱性的环境中,AOB 是硝化作用的主要驱动者,而AOA 主要在较苛刻的环境包括低氮、强酸性和高温的环境中发挥功能活性5-7，然而也有学者认为,一般农田土壤和草地土壤中主导氨氧化过程的是AOB 而不是AOA8-9，因此AOA和AOB对自养硝化过程的相对贡献仍是争论的热点。复杂自然环境下不同的理化性质驱使AOA 和AOB 产生不同的反应,从而在氮循环中占据各自的生态位。不同的氨氧化古菌和细菌之间存在生理特征的差异，氨氧化古菌和细菌的群落结构与特定的环境因素有密切关系，土壤和污泥中的很多因素，如土壤质地、pH值、土壤氧气含量、土壤的温度和水分、污泥盐度、土壤氮素水平、植被类型和土壤污染状况都是影响氨氧化细菌和古菌的功能和群落结构的因素。 纳米零价铁（nanoscale zero-valent iron，nZVI）是指粒径小于100 nm 的零价铁的颗粒，由于其较强的反应活性能够快速去除卤代有机物、重金属离子及其他无机阴离子等多种环境污染物10-13，对持久性有机污染物也有很好的去除效果13-17，并且可以通过直接注射到污染区域实现原位修复，是一种高效、快速、经济的土壤及地下水污染修复材料。nZVI 越来越普遍用于土壤的修复，但其对病毒、细菌、微生物群落、以及动植物等都能导致一定的负面效应，尽管其毒性机制尚不明确，但普遍认为nZVI 暴露后铁离子的释放和氧化损伤确实可以引起生物效应，部分研究还分析了环境因素和表面改性对其毒性的影响18。nZVI 的生物安全性研究越来越成为近年来科技工作者关注的热点，国内外学者关于nZVI 毒性效应的研究中发现跟微生物生存环境以及nZVI 浓度有关，对微生物群落结构与组成影响不大，甚至还增强了某些功能细菌的功能，但是可以改变环境的某些理化性质，如氧化还原电位以及溶解氧等，这也可能是抑制某些细菌生长的原因19-22。在纳米零价铁的毒性机制探讨中提到由于其粒径非常小，nZVI 颗粒进入到细胞中,最终导致细胞失活。除此之外，nZVI 被氧化之后的粒径会增大，甚至可能达到微米级别，附着在细胞表面，很容易堵塞膜上的一些通道。纳米零价铁在土壤修复的应用中会对土壤中的氨氧化微生物造成哪些影响的研究报道还较少，因此本项目采用添加纳米零价铁进行土壤室内培养，研究纳米零价铁对土壤中氨氧化古菌及细菌的数量、结构和活性的影响，查明添加纳米零价铁下土壤中氨氧化微生物群落的演变规律。参考文献1刘正辉, 李德豪. 氨氧化古菌及其对氮循环贡献的研究进展J. 生态毒理学报, 2015, 10( 3) : 28-372侯海军,秦红灵,陈春兰,等. 土壤氮循环微生物过程的分子生态学研究进展J. 农业现代化研究, 2014, 35(5): 588594. 3Broos K, Mertens J, Smolders E. 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Environmental Science and Pollution research, 2013, 20( 2) : 1041 1049二、 项目方案（具体方案、实施计划、可行性分析）1.研究目标在查阅文献与野外实地调查基础上，选择不同类型的土壤，采用室内培养试验，测定土壤氨氧化细菌和氨氧化古菌的数量及结构，进而研究纳米零价铁对氨氧化微生物演变的影响。2.研究内容（1）纳米零价铁对土壤中氨氧化古菌（AOA）数量及结构的影响。（2）纳米零价铁对土壤中氨氧化细菌（AOB）数量及结构的影响。（3）土壤中氨氧化微生物群落演变的影响因子。3.具体方案（1）样品采集供试土壤采集于水稻收获后和休闲作物甜玉米收获后，用土钻采集土壤样品，取样时尽量远离小区边缘。在施底肥前采集6点(S形曲线)耕层(020 cm)土壤样品，将新鲜土样充分混匀，标记并分装于两个塑料袋中，其中一袋储存于4用于微生物指标分析，另一袋自然风干用于土壤基本理化性质分析。（2）土壤基本理化性质测定土壤pH值测定采用电位法；有机质测定采用重铬酸钾氧化外热法；电导率(EC)测定水土比为5：l，采用DDS-LLA型电导仪测定(鲁如坤，2000)；铵态氮和硝态氮测定采用2molL KCl溶液(水土比为5：1)浸提，振荡1h后过滤，滤液采用连续流动分析仪(荷兰Skalar)测定。与此同时采用烘干法(在105下烘24h)测定土壤水分含量。（3）土壤样品的培养及微生物DNA的提取根据田间最大持水量计算，加入适量的蒸馏水，将实验土壤含水量调节至田间最大持水量的60%,然后根据土壤含水量称取相当于5.0克风干土样的新鲜土置于瓶中，让土壤均匀分布于120mL的瓶底部，用橡胶塞将瓶口封闭并用铝盖锁紧，在黑暗条件下28培养28天。随后取约0.6克的加水培养新鲜土壤，利用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒，根据其提供的操作指南提取土壤微生物总DAN。通过微量紫外分光光度计分析土壤微生物DNA的浓度和纯度，进一步通过1.2%的琼