哺乳动物胚胎冷冻保存研究进展-李亚强.docVIP

哺乳动物胚胎冷冻保存研究进展Advance in Cryopreservation of Mammalian Embryos李亚强 04级生物技术 13号摘要：哺乳动物胚胎的超低温保存技术不仅为动物种质资源的保存和良种家畜的国际交流提供了简单的手段,而且还是胚胎移植、体外受精、转基因和克隆等胚胎生物技术不可分割的组成部分.胚胎冷冻和解冻过程中都存在好多会使胚胎受到损伤的因素,如抗冻保护剂的毒性、冷冻损伤、细胞内冰晶的形成、破裂损伤、渗透压引起的膨胀.因此,使用不同的冷冻和解冻法应避免或减少胚胎受到损伤,以提高胚胎冻后的存活率.目前主要的胚胎冷冻方法有常规慢速冷冻和玻璃化冷冻两种方法。关键词：胚胎 冷冻保存 冷冻保护剂 毒害作用胚胎冷冻是一项新的细胞冷冻保存技术, 1972年,英国学者Whittingham等人首次利用慢速冷冻法保存小鼠胚胎获得成功,此后许多学者对冷冻方法进行了广泛的研究.至今,牛、绵羊、山羊、马、兔子、猫、羚羊、狒狒、狨猴、猴和人等的胚胎冷冻保存也获成功。胚胎低温保存对于提高哺乳动物繁殖效率有很重要的意义,本文阐述了哺乳动物胚胎低温保存的研究进展和最新研究进展。1. 冷冻保护剂为防止在胚胎冷冻过程中使胚胎致死，需要加入冷冻保存剂。通常使用的冷冻保存剂包含有低分子量非渗透性冷冻保护剂，低分子量渗透性保护剂和大分子物质。1.1低分子量渗透性冷冻保护剂这类冷冻保护剂能保证细胞里的水份及时脱出，降低溶液凝固点，从而避免细胞内水分在低温下形成冰晶。它们通过与胚胎平衡，替换出细胞内水分，这样降低细胞内形成冰晶。但它们在高浓度或高温下对胚胎有强烈的毒害作用。常用的有甲醇，乙二醇，1，2-丙二醇，2，3-丁二醇，DMSO，甘油，乙酰胺等等。例如在大菱鲆胚胎的玻璃化冷冻保存中就选择乙二醇，1，2-丙二醇，2，3-丁二醇，DMSO，葡萄糖配制玻璃化液。1.2低分子量非渗透性冷冻保护剂低分子量非渗透性冷冻保护剂是胚胎冷冻液中的另一个关键性成分。其主要只糖类，如单糖（果糖，葡萄糖，山梨糖和甘露糖），二糖（蔗糖，海藻糖）和多糖（棉子糖）。其中应用最广泛的是蔗糖。糖类可以提高渗透压来促使细胞脱水，还能保持细胞完整性，减少达到玻璃化所需渗透性冷冻保护剂的浓度，从而降低冷冻保护剂对胚胎的毒害作用。除此之外，糖类还可以作为渗透压缓冲物质，通过减少解冻时细胞的膨胀速度和程度来减少渗透压损伤的发生。该保护剂冷冻时对胚胎无损伤，但高温时有毒害作用。1.3大分子物质该类冷冻保护剂较渗透性冷冻保护药剂毒性低。常用的大分子物质有聚乙二醇，聚蔗糖，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇，透明质酸钠，葡聚糖等。它们能促进玻璃化的作用，能部分替代渗透性冷冻保护剂，降低冷冻保护液毒性，同时克服解冻时形成致死冰晶。2. 冷冻方法自从1972年,英国学者Whittingham等人首次利用慢速冷冻法保存小鼠胚胎获得成功以来，许多科学家开始对胚胎冷冻保存方法进行研究，其热点主要在提高冷冻保存胚胎活力和简化冷冻程序上。到目前为止，胚胎冷冻方法主要有常规慢速冷冻法，玻璃化冷冻法。2.1 常规慢速冷冻目前为止常规慢速冷冻法仍然是哺乳动物胚胎冷冻本村的主要方法。此法选择教低浓度的渗透性冷冻保护剂，采用缓慢降温和快速解冻的方法来冷冻保存胚胎。可以氛围一下几个步骤：室温下胚胎置于冷冻液中5到10分钟，使胚胎和冷冻液达到平衡；在-5到-9摄氏度之间植冰；降温到-30到-40摄氏度之间，投入液氮中保存；以250摄氏度每秒的速度快速解冻；在培养或移植前出去冷冻保护剂。2.2 玻璃化冷冻玻璃化冷冻法是1985年发展起来的一种快速冷冻胚胎的方法。它的主要特点是使用冷冻和解冻速率均较快的高浓度低温保护剂，操作简单，不需要昂贵的设备。玻璃化冷冻法不要求严格的降温速度，就方法而言最不利的就是高浓度的冷冻液对胚胎的毒害作用，所以应该严格控制胚胎暴露在冷冻液中的时间。影响胚胎玻璃化冷冻保存效果的两个关键因素是冷冻时间和冷冻速度。只有最大冷冻速度和最低冷冻保护剂浓度之间达到平衡才能获得好的冷冻效果。要在一定的冷冻速度下形成玻璃化状态，就需要高浓度的冷冻保护剂，但是冷冻保护剂浓度过高又会对胚胎细胞，造成毒害。因此寻求毒性低，形成玻璃化能力强的玻璃化冷冻液成为胚胎冷冻保存的热点之一。冷冻速度是形成玻璃化状态的另一个关键因素，提高冷冻速度冷冻速度可以使玻璃化溶液中冷冻保护剂的浓度降低，从而降低冷冻保护剂对胚胎的毒害作用。3. 解冻方法解冻方法对胚胎的存活和进一步发育能力有很大的影响，研究表明慢速解冻会降低胚胎的存活率。水浴解冻可以使温度变化速度为4460摄氏度每秒，在空气中解冻才达不到196摄氏度每秒，且经常导致玻璃带破裂。一般解冻时将细胞在空气中或10-28摄氏度停留10秒，然后投入22-35摄氏度间的水浴中10-30秒。解冻后立即去处冷冻保护剂，通常用蔗糖溶液将冷冻保护剂脱除。胚胎冷冻保存技术的研究已经取得很大的进展，尤其是玻璃化冷冻技术有个突破性的进展。OPS法等新型玻璃化冷冻方法的发明使该技术商业化应用成为可能，不久胚胎冷冻技术将越来越广泛得应用于胚胎生物工程和其他生物技术领域。参考文献：1. 朱增娟 袁水桥 张晓华 李东全 哺乳动物胚胎玻璃化冷冻保存的研究进展J.黑龙江牧业兽医-2005年-5期 77-79页2. 丁志丽 桑林华 王杏龙 哺乳动物胚胎冷冻保存的研究进展J. 上海畜牧兽医通讯-2004年-2期 18-19页3. 王丽娟 哺乳动物胚胎玻璃化冷冻保存的研究进展J. 上海畜牧兽医-2006年-12期 56-57页4. 张德福 吴华丽 刘东 王邵凯 王少兵 哺乳动物卵母细胞与胚胎冷冻保存的研究进展国外畜牧学-猪与禽-2006年06期 87-88页5. 李林凤 关伟军 马月辉 史问清 韩俊文 卵母细胞冷冻保存的研究进展J.中国畜牧兽医2006年-05期 37-38页6. 李辉 张居民 绵羊卵母细胞冷冻保存的研究J. 云南畜牧兽医2002年-04期 41-42页7. 李健 胡健宏 韩增胜 杨海 李青旺 猪卵母细胞冷冻保存的研究进展J. 中国农业通报-2005年-10期 55-56页8. 刘海军 薛俊 钱菊汾 牛卵母细胞冷冻保存进展J. 动物科学与动物医学2002年-01期 63-64页9. 秘祖霞 黄元华 人卵子冷冻本