课件：病毒的传分析.ppt

Chapter 5,病毒的遗传分析 Genetic Analysis of Virus,病毒(virus)既不同于原核生物，也不居于真核生物，因为它们没有一般的细胞结构。在病毒中没有合成蛋白质外壳所必需的核糖体，所以只能寄生在动物、植物和细菌的细胞内繁殖，它能使宿主细胞的机构转而合成它自身新的病毒物质。尽管病毒能形成晶体，自身不能进行代谢等，但仍将病毒视为生物，因为它们能够繁殖。 病毒离开宿主细胞虽然不能繁殖，但仍可以存活。根据宿主细胞的不同而将病毒分为动物病毒、植物病毒和细菌茵病毒3种。细菌病毒又称噬茵体(phage)。,根据宿主不同，可以分为： 动物病毒 植物病毒 细菌病毒-噬菌体（bacteriophage, phage),冠状病毒,SARS病毒为单链（+）RNA病毒，全长29.725kb,具有11个ORF（Open Reading Frames），分别编码：依赖于RNA的RNA聚合酶、4种结构蛋白（S，E，M，N蛋白）、5种未知蛋白（图5）。与其它宿主来源冠状病毒的序列比较，进化分析，呈一单独的分支。病毒在增殖过程中虽没有逆转录过程，但RNA聚合酶没有矫正机制，变异较大，SARS的变种很多。,Phage T4,研究最为广泛的是T噬菌体：,Viruses - non-living particles -reproduce only within a host Virus has protein coat + nucleic acid core - ssDNA, dsDNA, ssRNA, dsRNA - may be linear or circular molecule Viral genome integrated into host genome or separate,病毒的一般特性：,病毒在遗传学研究中的优越性 : 1、繁殖快, 世代短。 病毒一小时可繁殖百个。 2、易于培养化学分析。 一个试管可装很多; 易于获得大的数量用于分析。 3、遗传物质简单, 只含裸露DNA或RNA。适用基因结构和功能研究。 4、便于研究基因突变。 5、便于研究基因的作用。 6、可用作研究高等生物的简单模型。,第一节 噬菌体的繁殖和突变型,一、噬菌体的形态结构,1. 噬菌体的形态,（1）20面体，无尾,PM-2,（2）20面体，有尾,SPO1,（3）丝状,M13,2. 几种噬菌体的染色体特点,3. T4 噬菌体的结构,二、噬菌体的生活周期,1. 噬菌体吸附到宿主细胞上,2. 尾丝鞘收缩，中轴刺穿宿主细胞,3. 头部的DNA被送入宿主细胞,4. 在数分钟内，所有的细菌核酸和蛋白质合成都被抑制。,5. 噬菌体大分子合成，细菌的核酸被降解。,（1） 噬菌体DNA复制。,（2） 噬菌体外壳蛋白合成。,(1) DNA被包到头部,(2) 组装尾部,(3) 装上尾丝,6. 噬菌体组装,约200个噬菌体导致细菌被噬菌体基因编码的溶菌酶（lysozyme)溶解。,7. 宿主细胞破裂,二、噬菌体的繁殖,1951年，J. Lederberg 的妻子Esther lederberg证明了Lederberg和Tatum使用的K12 E.coli中含有原噬菌体，并命名为。 10年后终于搞清了溶源化的实质。,二、噬菌体的繁殖,1烈性噬菌体（virulent phages） 概念：感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出噬菌体。 繁殖：吸附在特异的受体上酶细胞壁形成微孔注入核酸停止细菌的代谢合成phage的成分裂解，释放。,烈性噬菌体溶菌,2. 温和噬菌体（temperate phage）,温和噬菌体感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中，形成原噬菌体（prophage)，这一过程称为溶源化（lysogenization)。,整合到细菌染色体的噬菌体DNA随细菌的染色体复制而复制。 经过若干世代后才从寄主的染色体上脱离下来复制和合成噬菌体蛋白，组装成新的噬菌体，并导致菌体细胞裂解。,温和型噬菌体（temperate phage）： 具有裂解和溶源两种途径 ： (1)裂解途径：和烈性噬菌体相同,温和噬菌体溶源,(2)溶源途径：溶源周期经诱导进入裂解周期。,噬菌体的生活史,噬菌体：噬菌体侵入后，细菌不裂解,附在E.coli染色体上的gal和bio位点间的att座位上,通过交换整合到细菌染色体，并能阻止其它噬菌体的超数感染。,P1噬菌体：不整合到细菌的染色体上，而是独立存在于细胞质内。 原噬菌体：整合到宿主基因组中的噬菌体。仅少数基因活动，表达出阻碍物关闭其它基因。原噬菌体经诱导可转变为烈性噬菌体 裂解途径。,P1和噬菌体的生活周期特性,3、溶源性： 有些细菌带有某种噬菌体，但并不立即导致溶菌，这种现象称为溶源性，具有溶源性的细菌称为溶源性细菌（lysogenic bacteria），受温和噬菌体感染的细菌，几乎都成为溶源菌。在细菌中处于潜伏状态的噬菌体称为原噬菌体（prophage）或原病毒（provirus），带有原噬菌体的细菌称溶源性细菌（lysogenic bacterium），失去原噬菌体的细菌和为非溶源性细菌（nonlysogenic bacterium）。,溶源性细菌有两个重要特性: (1)免疫性： 原噬菌体产生一种阴遏蛋白，抑制同类噬菌体DNA的复制，因而能抵抗同类噬菌体的超感染。 (2)可诱导性： 自发万分之一； 紫外线或丝裂霉素90%。,三、噬菌体的突变型,噬菌斑（plaque）：由于噬菌体的侵染，使细菌细胞裂解，有菌落上出现的一些园形而清亮的小洞。 1、快速溶菌突变体 (1)野生型r+形成小的噬菌斑1mm，周边有朦胧的光环。 原因 ：有两个以上的噬菌体侵染一个细菌时，出现溶菌阻碍现象，混有裂解和未裂解的细胞。 (2)快速溶菌突变体r（rapid lysis）形成大的噬菌斑2mm，边缘清晰。 原因：无溶菌阻碍现象。 (3)鉴别：噬菌斑大小。,2、寄主范围突变体,(1)野生型h+ 能感染野生型的大肠杆菌Ttos，但不能感染Ttor (2)突变型h 对Ttos 和Ttor都能感染。 (3)鉴别 ：混合Ttor 和 Ttos ，野生型h+出现混浊噬菌斑，突变型出现清亮噬菌斑。 (4)噬菌体与细菌的关系侵染与抗性。,部分溶菌,3、条件致死突变体,所谓条件致死突变型，就是在某些条件下，这些突变型是致死的，那么这些条件就称为限制条件(restrictive condition)；而在另一些条件下仍可进行繁殖，从而得以扩增进行研究，所以这些条件称为许可条件(permissive condition)。,常用的有两大类条件致死突变：,（1）“温度敏感”突变(temperature sensitive mutation),（2）“抑制因子敏感”突变(suppressor-sensitive mutation, sus),（1）“温度敏感”突变(temperature sensitive mutation)： 野生型噬茵体能在很大的温度范围内感染宿主并进行繁殖。 热敏感突变型(heat sensitive mutants，ts)：通常在30(许可条件)感染宿主进行繁殖，但在40一42(限制条件)条件下就是致死的，不能形成噬菌斑； 冷敏感突变型(cold sensitive mutation，cs)：在较低温度下就是致死的。,原因：温度敏感性几乎总是一种突变的结果，基因突变后所编码的蛋白质中有一个氨基酸的替换，而这种蛋白质在“限制温度”下不稳定而丧失活性。,（2）“抑制因子敏感”突变(suppressor-sensitive mutation, sus)： 实质是原来正常的密码子变成了终止密码子，因而翻译提前终止，不能形成完整肽链而产生有活性的蛋白质，属于无义突变（nonsence mautation）。带有sus突变的噬菌体在感染一种带有抑制基因(suppressor, su)(许可条件)的宿主菌时能产生子代，但在感染另一种没有抑制基因(su)(限制条件)的宿主菌时，不能产生子代。野生型噬菌体在这两种宿主中都能产生子代。 sus突变不像“宿主范围突变”那样影响噬菌体对宿主的吸附，这种突变的噬菌体能正常地吸附、注入自身的DNA，杀死宿主细胞，但不产生子代。,（1）抑制因子敏感突变的概念： 例如：噬菌体mRNA基因 细菌tRNA基因反密码子 正常 突变 突变 正常 基因：5TAC 35TAG 3 3ATC 53ATG 5 mRNA 5UAC 3 5UAG 3 3AUC 5 3AUG 5 表型：酪氨酸 终止 5UAG 3,酪氨酸,酪氨酸,3AUC 5 酪氨酸,表5-2携带不同专一性抑制基因宿主中sus突变噬菌体的表现,（2）噬菌体的抑制因子敏感突变型类型及表现 琥珀型（amber）UAG 赭石型（ocher）UAA 乳白型（opal） UGA,sus突变分为三类；,无义抑制基因（su）实质：tRNA基因发生了突变，例如琥珀型抑制基因su3在UAG密码于上插入了一个酪氨酸，这是因为tRNA加基因的反密码子的一个突变，tRNATry，正常的反密码于是GUA，它按摆动规则译读酪氨酸密码子UAU(C)。su3菌株的tRNATry含有反密码子CUA，它识读琥珀型密码子UAG，并插入酪氨酸而防止终止。,（二）无义突变与无义抑制突变,无义突变：指一个为氨基酸编码的密码变为终止密码的突变。 无义抑制突变：指能抑制无义突变表现的突变。,四、噬菌斑分析（The plaque assay）,1. 噬菌斑（plaque）,噬菌体感染固体培养基上的菌苔（lawn），溶菌后形成的圆形清亮的斑。,Opaque lawn of bacteria,Clear areas of plaque,2. 噬菌体浓度的测定方法,（1）逐步稀释原溶菌液（10-1、10-3、10-5、 10-7）,（2）感染平板培养基上的细菌菌苔（lawn）,（3）计数形成的噬菌斑,（4）计算原溶菌液中的噬菌体数目。,公式：,噬菌斑数/mL稀释倍数,原始噬菌体浓度=,23105,10ml,原始浓度：,phages/ml,噬菌体感染E.coli,第二节 噬菌体突变型的重组实验,一、T2突变型的两点测交,但10年未引起重视！,（1）1936年F.M.Burnet发现了噬菌体能产生突变体，形成的噬菌斑的外形与野生型噬菌体的噬菌斑有明显的区别。,（2）Hershey和Luria的发现,1946年第11届冷泉港会议上Hershey和Luria宣布发现噬菌体r、h突变，Delbruck和Hershey发表了噬菌体重组。,三人获1969年Nobel prize（生理或医学）, 噬菌斑的形态：, 宿主范围：,h：噬菌体能在E.coli B和B/2品系上生长,h+：只能在E.coli B品系上生长。,（3）Hershey使用两个表型特征,能在B和B/2混合菌苔上产生透明斑。,能在B和B/2混合菌苔上产生半透明斑。,r：,快速溶菌，噬菌斑大，边缘清楚。,噬菌斑小，边缘模糊。,r+：,噬菌斑与基因型,B和B/2混合菌苔,（4）、噬菌体杂交,. 亲本噬菌体（T2）基因型,hr+：透明，小斑，边缘模糊,h+r：半透明，大斑，边缘清楚，,杂交过程混合感染实验,两个亲本噬菌体混合感染E.coli B和B/2，观察菌苔上出现的噬菌斑特征。推断噬菌体的基因型。,mixed infection experiments,混合感染（mixed infection）,E.coliB或B/2,T2 phage,（5） 杂交结果,在B和B/2混合菌苔上出现了4种噬菌斑。,半大,半小,透小,透大,（6） 重组机理,h+r,h+r,h+r,h r+,h r+,h r+,h+r,h+r,h+r,hr+,hr+,h r+,噬菌体染色体在细菌体内复制,不同的噬菌体染色体在细菌体内交换重组,h+r,h+r,h+r+,h+r,h+r,hr+,hr+,h r,h+r,h+r+,h+r,h r+,h r,h+r,释放出的4种子代噬菌体,部分噬菌体DNA重组,（7）噬菌体重组值与基因作图,重组值的计算,重组噬菌体的噬菌斑数,总噬菌斑数,100%,基因图距,用两个基因的重组值表示基因间的遗传距离。,（h+r+ + hr）,total plaques,100%,Hershey和Rotman1949年的T2杂交结果,r,h,24,（8）、T2噬菌体的遗传图,Hershey的迷惑,a. Hershey后来分离出多种突变的T2 噬菌体：,r1、r7、r13,b.详细的杂交分析,用hr的不同突变体杂交，计算h与不同r之间的重组值并绘制遗传图。,h与不同r之间的重组值,r1,h,24,r7,h,13,r13,h,1.7,h与不同r之间的位置关系,r1,h,r7,r13,r1,h,r7,r13,r1,h,r7,r13,r1,h,r7,r13,4种可能,进一步杂交确定各r之间的位置,r13r7+ r13+r7,h r13r7,排列结果,r1,h,r7,r13,r1,h,r7,r13,或？,到底是那种排列？,Streisinger和Edgar的判断,10年后（1964），G. Streisinger和Edgar研究了噬菌体的很多标记基因的杂交重组，才判断出T2噬菌体的遗传图是环形的。,h,r1,r7,r13,二、T4噬菌体突变型的三点测交,噬菌体也能进行三点测交（06A/9/4） 突变型：小噬菌斑(m)、快速溶菌、浑浊溶菌班(tu),往往,M 12.9 R 20.8 tu,三 X174突变型的两点和三点测交 P127,(一) X174的两点测交 两个琥珀突变型间杂交 amA x amB su+,su+: amA、amB su-,基因型：amA- amB+ amA+ amB- amA+ amB+ amA+ amB+ amA- amB- A+B+ X 2 amA-amB间重组值： X 100% su+:amA、amB总数,许可条件:只有在这种均中才能产生子代,重组类型,两个不同抑制因子敏感突变型间的杂交 sus amber x sus opal ,限制条件：su+amber、opal su-,基因型：amb-opal+ amb+opal- amber+opal+ amb+opal+ amb-opal-,su+amber；su+opal,10-6 10-2,P128 表5-6 174突变型之间杂交观察到的双因子重组率,(二)X174的三点测交,1 确定三个基因的顺序的前提条件 只有两种可能顺序的条件下进行； 例如：要确定amA、amB、tsC三基因的顺序 已知：amA与amB较近，amA和amB离tsC都较远； 三个基因顺序有： 或：amA amB tsC 或：tsC amA amB 不存在：amA tsC amB,2 确定三个基因的顺序原理: 杂交：amA + tsC X + amB + amA + tsC + amB + P127 图5-4,如果基因顺序是: amA amB tsC 实验结果应是: + + tsC为大类，+为小类 图5-4 (正交顺序I或反交顺序I),如果基因顺序是: tsC amA amB 实验结果应是: + + + 为大类， tsC + + 为小类 图5-4 (正交顺序II或反交顺序II),四 噬菌体基因重组的特点 P130,四、烈性噬菌体的遗传体制,噬菌体在杂交中，每个亲代对子代所提供的遗传贡献取决于感染细菌时每种亲代噬萄体的相对数量； 噬菌体的基因重组是发生在噬菌体的DNA复制以后，重组型和亲本型一起复制； 噬菌体不同基因型之间可以发生多次交换； 在噬菌体中基因重组频率可以随着宿主细胞裂解时间的延长而增加，直到DNA与外完蛋白装配成为完整的噬菌体时，重组才停止。 因此噬菌体杂交时，应该注意： 控制每种亲代噬菌体基因型的投放量： 控制允许发生复制和重组的时间。只有控制这两个因素并在标准条件下进行杂交所得重组频率才能用于绘制近似的遗传图。,第三节 噬菌体突变型的互补试验,一X174条件致死突变型的互补测验 (一) X174 DNA结构复制 图5-1 (二) X174的突变型与互补测验 1 互补测验原理 在限制条件下，能长出噬菌斑： 说明：两个突变型能发生功能互补，是两个基因。 在限制条件下，不能长出噬菌斑： 说明：两个突变型不能发生功能互补，是同一基因。,2 互补测验及结果,P124 表5-4 X174突变的互补测验结果 顺反子 突 变 型 A am8,am18,am30,am33,am35,am50,am86,tsl28, B am14,am16,och5,ts9,tsl16,och1,och8,och11, C och6 D am10,amH81, E am3,am6,am27, F am87,am88,am89, amH57,op6, op9,tsh6,ts41D G am9,am32,ts,ts79 H amN1,am23,am80,am90,ts4,二 T4突变型的互补试验,第四节 噬菌体基因组与原噬菌体 一 噬菌体的基因组：由49000bp构成 1 基因分类 头部基因： 7个（必需基因：相邻） 尾部基因： 11个（必需基因：相邻） 噬菌斑形成必需的基因 复制所需基因：O、P 裂解、释放所需基因：S、R 基因 正调控基因：N、Q 附着区：att； 专一性重组所必需：int、xis 噬菌斑形成非必需的基因 溶源化所需：CI、CII、CIII 重组所必需：exo、red,P133 图5-6,噬菌体的包装过程,噬菌体的基因组,2 噬菌体基因组的结构特点: 二 原噬菌体与合子诱导 1 原噬菌体： 2 合子诱导： Hfr()X F-受体菌裂解(进入F-后),b+,原点,d+ c+,a+,3 合子诱导与整合部位的确定,Jacob和Wollman（1956年）发现了合子诱导（zygotic induction）现象，并利用合子诱导确定了几个E.coli染色体上原噬菌体的整合位点。他们发现Hfr（）F所得到的重组子频率要比HfrF（）或Hfr（）F（）要低得多。这是由于在Hfr（）F的杂交中，原噬菌体进入无阻遏物的受体细胞质中，进行大量复制使受体细胞裂解，因此不易得到重组子，此现象就称为合子诱导。现在我们再回过头来查阅一下传递等级作图，中断杂交实验以及重组作图都是采用HfrF（）就是不致产生合子诱导的缘故。,第四节 噬菌体基因组与原噬菌体,噬菌体整个基因组如图所示，可分为三个部分， 左臂：从A到J长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。中段：长约20kb，是DNA整合和切出，溶原生长所需的序列。右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及DNA复制起始均在这区域内。左右臂包含DNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。,三 原噬菌体的插入与切除,1 原噬菌体的插入与正常切除 P135 图 5-7 2 原噬