脯氨酸含量的测定.docVIP

脯氨酸含量的测定水分胁迫下植物的渗透调节【实验目的】1.了解植物对环境胁迫的抗性生理作用，及植物对胁迫的影响机制；2.了解脯氨酸对植物水分胁迫下的抗性生理。【实验原理】在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。在酸性条件下，茚三酮和脯氨酸反应生成稳定的红色化合物，产物在520nm波长下具有最大吸收峰。用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。【材料、仪器及试剂】1.实验材料：小麦幼苗：对照；100mM、200mM NaCl处理48h；5%、15% PEG-6000处理48h2.仪器：天平，烧杯 ，分光光度计，研钵，容量瓶，具塞试管，移液管，胶头滴管，水浴锅3.主要试剂：3%磺基水杨酸、冰醋酸、甲苯（使用完勿弃入下水道，请回收）、2.5% 酸性茚三酮溶液（60 ml冰醋酸、16.4 ml磷酸加蒸馏水定容至100 ml，再加入2.5 g茚三酮，溶解后避光保存）、脯氨酸标准母液：精确称取25 mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入500 ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中脯氨酸浓度50 g /ml。【实验步骤】 （一）、样品的测定1.脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.2g（每种处理至少做三个平行），用3%磺基水杨酸研磨提取，分别转移至试管中，然后向各试管分别加入5ml 3的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液用3%磺基水杨酸定容至5mL，即为脯氨酸的提取液（预先湿润滤纸，尽量全部收集Pro提取液）。2.吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入 2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，封口以防过分蒸发，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。3.冷却后加入4ml甲苯，摇荡30s，静置2h。4.用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值（注意甲苯有毒，尽量防止挥发；OD520大小为0.2-0.8之间为佳，若值太高，应适当用甲苯稀释）。（二）、标准曲线的绘制1.在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100g。2.系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及 3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6g/ml。3.取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。4.冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。5.用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。6.标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（g/2ml）。【实验记录及结果处理】根据标准曲线计算出2ml样品液中脯氨酸的浓度,然后换算出样品中脯氨酸的含量（g脯氨酸/gFW）。计算公式如下：脯氨酸含量（g.g-1） c (va)wc为由标准曲线查得脯氨酸含量g、V为提取液总体积ml、a为测定液体积mL、W为样品质量g，即脯氨酸含量（g/g）（c 5 / 2）/样重（g）（一）、标准曲线绘制浓度（g/ml）0246810OD52000.0816670.1410.2056670.3063330.338667 （二）、样品含量测定不同处理的待测植物根尖质量对照100mM NaCl200mMNaCl5%PEG-600015%PEG-60000.2092g0.2182g0.2124g0.2159g0.2097g0.2058g0.2177g0.2080g0.2182g0.2036g2mL样品中脯氨酸吸光值OD520abab对照0.1400.0830.1270.095100mM NaCl0.1320.1180.1390.110200mMNaCl0.0980.0650.1180.0895%PEG-60000.5100.4820.3170.14715%PEG-60000.1070.1720.1370.103根据标准曲线计算出2ml样品液中脯氨酸的浓度（g/ml）（y=0.0347x+0.0052）2ml样品脯氨酸浓度（g/ml）abab对照3.8852.2423.5102.588100mM NaCl3.6543.2513.8563.020200mMNaCl2.6741.7233.2512.4155%PEG-600014.54813.7418.9864.08615%PEG-60002.9344.8073.7982.818换算出样品中脯氨酸的含量（g脯氨酸/gFW）【脯氨酸含量（g/g）（c 5 / 2）/样重（g）】脯氨酸含量（g脯氨酸/gFW）abab对照46.42726.79342.63831.438100mM NaCl41.86537.24844.24034.649200mMNaCl31.47420.28039.07529.0265%PEG-6000168.458159.113102.95646.81515%PEG-600033.97957.30846.63634.602将上表中两组的四个数据浓度求均值对照：脯氨酸含量36.824（g脯氨酸/gFW） 100mM NaCl处理：脯氨酸含量39.501（g脯氨酸/gFW）200mMNaCl处理：脯氨酸含量29.964（g脯氨酸/gFW）5%PEG-6000处理：脯氨酸含量119.338（g脯氨酸/gFW）15%PEG-6000处理：脯氨酸含量43.131（g脯氨酸/gFW）【分析及讨论】1.实验表明，PEG胁迫处理的植株中脯氨酸含量明显高于对照组，Nacl条件下，脯氨酸含量变化不是很明显。2.非盐性植物在胁迫下，通常降低细胞的渗透势以利于吸水，从而维持整个植物的水势，渗透势的调节可以通过以下两条途径达到：一是植物体内积累一些无机离子和可溶性有机物来降低自身渗透势；二是通过植株叶片气孔收缩，从而降低气孔导度以降低叶片的蒸腾作用，减少水分的丧失。3.由于脯氨酸具有偶极，性其疏水端与蛋白质连结，亲水端与水分子结合，从而使蛋白质通过脯氨