《电转化方案》word版.docVIP

一、酵母菌电转化方案:方案一。1、负80度取出涂平板。30度培养二天。2、取平板单菌落接种到10ml YPD培养基的50ml的三角瓶中 30度过夜摇培3、4度30004000rpm半分钟离心收获细胞。4、用20ml TE/LioAC(0.1M/0.1M pH7.5)重悬细胞，并在30度摇床摇培45分钟5、加0。5ml 1M DTT 再摇15分钟6、加20ml双蒸水 4度3500rpm离心半分钟第一次沉淀 用30ml冰冷的无菌水重悬 第二次沉淀 用 20ml冰冷的1M 的山梨醇重悬 第三次沉淀 用 1ml冰冷的1M 的山梨醇重悬8、每40ul一个转化体系分装9、转化条件1。5KV 20uF 200 40ul yeast /reaction 100ng DNA/reaction5ul10、加150ul 1M山梨醇快速混合酵母和DNA，然后涂在选择培养基上。方案二、1、负80度取出涂平板。30度培养二天。2、取平板单菌落接种到10ml YPSD（加SORBITOL）培养基的50ml的三角瓶中 30度过夜摇培3、4度30004000rpm半分钟离心收获细胞。4、加20ml双蒸水 4度3500rpm离心半分钟5、 第一次沉淀 用30ml冰冷的无菌水重悬 第二次沉淀 用 20ml冰冷的1M 的山梨醇重悬 第三次沉淀 用 1ml冰冷的1M 的山梨醇重悬6、每40ul一个转化体系分装7、转化条件1。5KV 20uF 200 40ul yeast /reaction 100ng DNA/reaction8300RC时间常数高压工作模式126RC时间常数 安 全： 抗短路保护最长延迟10秒 其它指标： 电流量：低压工作模式限6000A高压工作模式限3000A 物理参数： 尺寸：12.512.25 5.5(WDH)重量：10磅（4.5公斤）显示：204位LCD液晶显示屏控制器：旋转式电压选择钮按压式电源开关及乒乓式触发开关监测：能监测电压峰值Vp及RC充放电时间常数3、ECM 830系列产品在转基因的应用领域中得以广泛的应用，其无以伦比的高性能得到了全球同行的厚爱。BTX的系列产品适用于动植物、细菌、酵母、哺乳动物、人类细胞（包括动物活体）的转基因等操作，体内基因导入（IVGD） （系统：ECM830）在动物活体内基因转移的非病毒技术中，直接将质粒DNA注射进入肌肉内是简单、廉价及安全的。Aihara及Miyazaki（1998）第一次指出通过在肌肉内将DNA注射与电穿孔相结合，可以将表达增强100倍。Mir等人（1999）使用多种类型的电极将基因传递进入多种种属的骨骼肌（大鼠、小鼠、兔、猴）。他们的结果显示通过使用电穿孔以及DNA注射：（1）基因转移的效率大大增加了，只是表达增强2-4倍；（2）不同实验之间的差别缩小了，而这正是单独DNA注射的主要缺点；（3）表达持续时间很长（数月），这对于长期临床应用非常重要；（4）不同种属的不同的肌肉都有阳性的反应，说明广泛的可用性；（5）基因表达非常特异仅在局部，而周围组织则没有影响到。这种技术成功用于其他组织，例如肝、睾丸、以及皮肤。最近Vicat等人（1999）通过体内电穿孔仪将基因传递如小鼠脑组织。与被称为有力的脑组织基因转移的非病毒载体的pCMV-luc与PolyEthylenlmine联合的方法相比，电穿孔的效率要高50倍。Nishi等人证明使用电穿孔可以获得有效的神经胶质瘤基因转移。Nishi还显示对实体瘤进行电基因治疗后肿瘤生长阻滞了50-90%。Dean等人将基因电导入完整的肠系膜动脉获得了成功。电穿孔已经被证实确实是进行体基因/药物转移方面一项有前途的技术，有许多新奇的用途。BTX公司特制的2针阵列电极、Genetrodes、卡钳电极、Tweezertrodes提供将基因侵入性以及侵入性转移入组织的方法。卵内基因转移（IOGD） （系统：ECM830）Muramatsu等人（1997）比较了3种转染方法用于将外源基因转入早期鸡胚进行表达。他发现与脂质体转染及基因枪相比，电穿孔是最有效的方法。Takeuchi等人（1999）使用电穿孔技术将早期鸡胚转染了tbx5及tbx4基因，以确定肢芽的翅/腿标志。对于这种用途已经开发出特用的电极。Genetrodes、L形状针电极，被用于测定鸡胚及靶向组织的特定区域。许多研究人员已经转染了眼、心或者肢体组织，方便了发育生物学方法的进一步研究。刚上市的足控开关具有遥控功能，是ECM830可以在不需要手操作的情况下进行激活，这对于卵内、体内以及体外胚胎用途非常重要。体外胚胎基因转移（IVEGD） （系统：ECM830）Tasaki等人（1999）讨论了使用电穿孔在体外小鼠胚胎方面的运用。小鼠胚胎有柱状的结构而且有比家禽更多胚胎培养基操作需求。有可能对胚胎进行电穿孔用于异位表达研究。在小鼠中后脑部的基因表达已经被观察。这个技术也用在交配后9.5天小鼠胚胎，以研究Hu基因在神经分化中的功能。BTX为这些目的提供一种全新的电极：Genepaddles。技术规格工作状况：具有开机自检功能接 口：数字式用户接口输入电压：110VAC/220Hz充电时间：最长5秒（无延时）电压范围：5-500V低压工作模式连续可调/每次1V调进20-3000V高压工作模式/每次5V调进脉宽选择：10s-999s低压工作模式/1s精度1ms-999ms高压工作模式/1ms精度1s-10s低压工作模式/0.1s精度10s-600s高压工作模式/1s精度脉冲个数：1-99脉冲间隔：100ms-10s安 全 性：抗短路保护设计其它指标：电容量：4000F电 流 量：10s 500A物理参数：尺寸：12.512.25 5.5(WDH)重量：15磅（6.8公斤）显示：204位LCD液晶显示屏控制器：旋转式电压选择钮按压式电源开关及乒乓式触发开关串连接口：RS232和RS485监测： 能监测显示电压(V)时间(t)脉冲数(n)4、ECM2001是一台万能的细胞操作仪器，它综合了电穿孔仪和电融合仪的特点 ，ECM2001在细胞融合时，分三个阶段，预融合、融合、后融合阶段ECM2001在预融合时可产生一种独特的高频交流波，交流波将细胞排列成双体或株琏，以便融合的进行，提高了融合的效率。融合阶段：交流波和直流波的转换之间设有微秒开关，能在极短时间内从交流电转成直流电。在方波长电波的作用下，使细胞高效融合，融合完成后，ECM2001立即产生了低电压的交流波可使已初步融合的细胞更完美的聚集在一起，完成细胞圆体程序。当转基因向导流需要较高的电压和较长的脉冲时，直流方波长脉冲可单独使用，完成转基因。应用举例胚胎操作/核移植/动物克隆 （系统：ECM2001/830）核移植是将细胞核从供体转入受体的过程。细胞核指导胚胎的发育，导致新生体安全出生。在这个过程中，电融合用于将供体细胞与受体卵细胞融合，并进一步激活细胞分裂，形成胚胎。Meng等人（1997）将核移植技术扩展至灵长类动物模型，克隆出恒河猴。技术的进步使研究人员能够从分裂球进展至更高分化的胚胎细胞以及静止的胚儿细胞，作为核的供应来源。胚胎产生的细胞在体外培养6-13代，然后在转入前使用血清饥饿的方法使细胞静止。如前文所述，Roble、Cibelli以及Stice是第一次在1998年报告使用非老化胚成纤维细胞作为核的供体进行核移植而产生绵羊克隆转基因牛的人。Ian Wilmut在1996年震惊了整个世界，他从成年乳腺的细胞产生出第一个动物克隆多利。使用分化的成年细胞进行克隆的能力打开了核移植广泛运用的大门即基因治疗的令人激动的模式。最近的成功事例PPL Therapeutics公司从成年体细胞克隆出猪。对于这些用途可以使用多种细胞融合样品池及微型载玻片。动物细胞融合 （系统：ECM2001）肿瘤及树突的电融合目前在过继性免疫疗法中进行使用。肿瘤细胞本身不能作为良好的抗原提成细胞，因此不会刺激T细胞生长。树突细胞是已经发现的最好的抗原提呈细胞，在融合后可以将肿瘤细胞转变成抗原提呈细胞。刺激后比未融合肿瘤细胞至少增加100倍。对于这些用途可以使用多种细胞融合附件及微型载玻片。杂交瘤/细胞杂交瘤技术 （系统：ECM2001）在过去十年中，使用电融合技术进行杂交瘤的产生及抗体大大增加。电融合的过程可以通过显微镜进行观察，与PEG相比需要的细胞数量较少。使用电融合用于这种用途还有无毒性及高效性的优点。Panova等人（1995）通过把人类B细胞与Heteromyeloma、Spam-8细胞进行电融合增强了人类杂交瘤的生成。Kreutz等人（1998）引入了一种使用电融合及FACS分选的新方法产生细胞杂交瘤。Cao等人（1995）建立了另一种快速非选择性方法通过电融合产生人类细胞杂交瘤。数据明确支持电融合用于这种重要目的的有效性。对于这些用途可以使用多种细胞融合附件及微型载玻片。植物原生质的融合 （系统：ECM2001）电融合可被用于融合植物原生质以产生杂交体及创造具有所需特性的作物。Hofmann-Tsay等人（1994）试验了可以的融合促进物质，发现一些多聚物可以便利融合过程而不影响细胞新生。Chen等人（1995）将原生质从2种种属的Porphyria进行融合，成功率高达85%。这些鼓舞人心的数据提示电融合与传统的PEG融合方法相比，可以改善融合效率以及可重复性。对于这些用途可以使用多种细胞融合附件及微型载玻片。5、BTX Electro Flow Porator T9000,与电穿孔系统一起使用，用于对大容量的细胞进行转化/转染。T9000是市场上可购到的唯一一个大容量电穿孔系统BTX Electro Flow Porator T9000,与电穿孔系统一起使用，用于对大容量的细胞进行转化/转染。T9000是市场上可购到的唯一一个大