响应面法优化光合细菌的生长条件.docVIP

响应面法优化光合细菌的生长条件摘 要:为探究污水处理用光合细菌 PSBB 的最适生长条件，本文在单因素实验的基础上，以温度、pH 和盐浓度为实验因素，根据旋转中心组合设计原理，经 DesignExpert 软件分析数据，采用三因素五水平的响应面法进行优化。确定光合细菌 PSBB 的最适生长条件为: 温度 28，pH6.80，盐浓度 0.25g/100mL。在此条件下，OD 值为 1.446。说明响应面法优化光合细菌 PSBB 的生长条件是可行的。关键词:光合细菌，响应面优化，温度，pH，盐浓度Optimization of growth condition for photosynthetic bacteria PSBB by response surfaceAbstract: The most suitable growth conditions of photosynthetic bacteria PSBB were studied for replication.On thebasis of single factor experiment，the method of response surface analysis with 3 factors and 5 levels includingtemperature，pH and NaCl concentration were adopted through design expert software with central compositerotatable design analyzing data. The most suitable growth conditions of photosynthetic bacteria PSB B weredetermined as following: temperature 28，pH value 6.80 and NaCl concentration 0.25g /100mL.Under theseconditions，OD of strain PSB B was 1.446. The results showed that the experimental value was comparable tomodel prediction and the method was practical.Key words: photosynthetic bacteria; response surface optimization; temperature; pH; NaCl concentration中图分类号: Q939.9 文献标识码: B 文 章 编 号:10020306( 2013) 15023004收稿日期:20130114作者简介:胡青平( 1972) ，女，博士，教授，研究方向: 应用微生物。基金项目: 中国博士后基金( 2011M501444) ; 山西省优秀人才支撑项目; 山西省大学生创新性实验项目( 1050532011141) 。光合细菌( Photosynthetic bacteria，简称 PSB) 是自然界中能以光合作用产能的细菌，是地球上最早出现的具有原始光能合成体的原核生物1。它具有固氮、固碳、脱氢、硫化物氧化等不同的生理生化功能，并在自然界的氮、碳、硫循环中发挥着重要作用。因此，具有重要的科学研究价值23。光合细菌分布广泛46，可直接处理高浓度有机废水，不存在污泥处理问题; 可综合利用作饵料和肥料，所需场地少费用低。还在减防鱼病、培养有益藻类和丰富饲料添加剂等方面具有巨大的应用价值7。所以已在许多科学领域内引起了人们的高度重视。目前，对光合细菌生长条件优化的研究有很多810，主要有温度、pH、光照、培养基成分等，但温度、pH、培养基盐含量对光合细菌的影响及其相互作用的研究却很少见，这些条件与光合细菌的生长繁殖也起着至关重要的作用，具有很重要的现实意义。本研究从山西临汾汾河大桥下的表层污泥中分离得到光合细菌 PSBB，该光合细菌对柠檬酸类废水有较好的降解作用( 数据未给出) 且前期实验还发现，盐浓度对 PSBB 菌的生长影响很大，因此，优化 PSBB 菌的生长条件为其进一步的开发应用奠定理论基础。1 材料与方法1.1 材料与仪器光合细菌 PSBB 分离于山西临汾汾河大桥下的表层污泥，纯化后分别保存于固体和液体培养基中，液体菌菌液颜色为深红色并有红色沉淀，菌种活力良好; 酵母膏蛋白胨液体培养基7，910: 酵母膏 3g，蛋白 胨 3g，CaCl23g，MgSO47H2O 3g，蒸 馏 水1000mL，pH6.8; 酵母膏蛋白胨固体培养基添加琼脂20g，在盐浓度的实验中，添加一定浓度的 NaCl。BSG300 光照培养箱、YXQLSSII 全自动立式电压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;722S 可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司。1.2 实验方法1.2.1 生长条件研究 单因素实验 在 250mL 的液体培养基中接种光合细菌 PSBB 的菌液 10mL，分别在 pH 为 7、盐231浓度为 0 单位的条件下，设置温度为 22、24、26、28、30、32 来分析其最适温度; 在温度为 28 、盐浓度为 0 单位的条件下，设置 pH 为 5、6、7、8、9 来分析其最适 pH; 在 pH 为 7，温度为 28 的条件下，设置培养基盐浓度为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6g/100mL 来分析其最适盐浓度。 响应曲面实验设计1114根据单因素实验结果，选择温度、pH 和盐浓度 3 个因素作为响应变量，利用 DesignExpert 软件按照旋转中心组合设计原理，以 PSBB 菌在 600nm 下的吸光度为响应值( OD) ，通过响应面曲面分析进行生长条件的优化，得到最优生长条件。各实验组的编码与取值见表 1。共 20 个实验点，其中 14 个为析因点，6 个为零点。零点实验进行 6 次，做误差估计。表 1 响应面分析因素与水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis水平因素A 温度( )B pHC NaCl( g/100mL)+ 1.682 31.364 7.841 0.468+ 1 30 7.5 0.40 28 7.0 0.3 1 26 6.5 0.2 1.682 24.636 6.159 0.1321.2.2 光合细菌生长量测定 以上实验均接种于300mL 的锥形瓶中，用封口膜封口，置于光照强度为3679.74987.0Lux 的光照培养箱中培养 5d，每天定时摇晃一次，用可见光分光光度计在 600nm 处测量光密度值。2 结果与分析2.1 单因素实验结果分别研究了温度、pH 和盐浓度三个因素对PSBB菌生长的影响，结果见图 1图 3。从图 1 中可知，PSBB 菌在接种后生长迅速，随时间延长，光密度值增加，但温度为 28 时，光密度值增加最快，生长态势最好，第 5d 达到最高光密度1.319，温度过低或过高都会对 PSB B 菌生长产生不利影响，温度过低菌体生长缓慢，温度过高菌体生长受到抑制。因此，最适温度为 28。从图 2 中可知，PSBB 菌在 pH7 时光密度值最高，第 5d 达到最高光密度 1.287。pH6 和 pH8 时光密度值略低于 pH7 时的光密度值。但 pH5、pH9 时光密度值明显低于 pH7时的光密度值，因此，pH 过低或过高都会严重影响PSB B 菌生长状况。所以最适 pH7。从图 3 中可知，培养基盐浓度为 0.10.3g/100mL 时光密度值增加，盐浓度超过 0.3g/100mL 后 PSBB 菌的生长受到抑制，光密度值迅速降低。因此，最适盐浓度为0.3g /100mL。由此可知，三因素对 PSBB 菌的生长都有一定的影响，最佳的单因素实验结果分别为: 温度28 ，pH7，盐浓度 0.3g /100mL。2.2 响应曲面分析2.2.1 响应面设计实验结果分析 运用 Design 图 1 不同温度下 PSBB 菌的生长情况Fig.1 The growth of bacteria PSBBat different temperatures图 2 不同 pH 下 PSBB 菌的生长情况Fig.2 The growth of bacteria PSBB at different pH图 3 不同盐浓度下 PSBB 菌的生长情况Fig.3 The growth of bacteria PSBBat different NaCl concentrationsExpert 数据统计分析软件，得到实验方案与结果，如表 2。通过对表 2 数据进行回归分析，得回归模型:OD = 44.93 + 2.305A + 3.985B + 4.470C 0.02163AB 0.1994AC + 0.3925BC 0.03774A20.2559B23.163C2。对该模型进行回归分析，方差分析结果见表 3。表 3 可知，该模型的 p 0.0001，表明该模型在95% 水平上显著。其失拟值为 0.8836 0.05，不显著，模型较准确。说明该模型拟合程度良好，实验误差小，可以用此模型来分析和预测结果。模型中一次项 A、B 显著，二次项 A2、B2高度显著，C2显著，而交互项 AC 显著。表明对于光合细菌生长量，温度和pH 表现出显著的线性影响，温度和 NaCl 则表现出显著的耦合影响。2.2.2 响应曲面分析与优化 根据回归方程，采用Design Expert 软件对该模型绘制响应曲面图，考察所232表 3 响应面回归模型方差分析表Table 3 ANOVA for response surface quadratic model变异来源 平方和 自由度 平均方差 F p 显著性模型 0.44026469 9 0.04892 23.106 0.0001 A 0.02084079 1 0.02084 9.844 0.0106 *B 0.02500014 1 0.025 11.809 0.0064 C 0.00938926 1 0.00939 4.435 0.0615AB 0.00374113 1 0.00374 1.7671 0.2133AC 0.01272013 1 0.01272 6.0083 0.0342 *BC 0.00308113 1 0.00308 1.4553 0.2554A20.32837514 1 0.32838 155.11 0.0001 B20.05898451 1 0.05898 27.861 0.0004 C20.01441417 1 0.01441 6.8084 0.0261 *残差 0.02117106 10 0.00212失拟项 0.00509306 5 0.00102 0.3168 0.8836纯误差 0.016078 5 0.00322总值 0.46143575 19注: 表示差异极显著( p 0.01) ，* 表示差异显著( p 0.05) 。拟合的响应曲面的形状，图 4图 6 所示为回归方程预测的三个因素耦合影响下的响应面三维图及相应等高线图。表 2 旋转中心组合实验设计方案和结果Table 2 Design and results ofcentral composite rotatable experiment实验号 A B C OD6001 1 1 1 1.1582 + 1 1 1 1.1983 1 + 1 1 1.0894 + 1 + 1 1 1.0255 1 1 + 1 1.1486 + 1 1 + 1 1.0117 1 + 1 + 1 1.1408 + 1 + 1 + 1 0.9349 1.682 0 0 0.99010 + 1.682 0 0 0.89111 0 1.682 0 1.26312 0 + 1.682 0 1.11013 0 0 1.682 1.31414 0 0 + 1.682 1.24215 0 0 0 1.38816 0 0 0 1.24817 0 0 0 1.31118 0 0 0 1.39319 0 0 0 1.37520 0 0 0 1.367图 4 表明，温度和 pH 对 PSBB 菌生长影响呈抛物线型关系，且均有一个极大值点。在当前实验范围内，当温度不变，随着 pH 的升高，OD 值先升高后降低，当 pH 不变，随着温度的升高，OD 值先升高后降低。OD 值变化速率显示，温度的主效应略强于pH 效应，等高线接近圆形，说明温度和 pH 的交互作用不显著。图 4 温度和 pH 对 PSBB 菌生长影响Fig.4 Response surface for the effect of temperature andpH on the growth of bacteria PSBB图 5 表明，温度和盐浓度对 PSBB 菌生长影响呈抛物线型关系，且均有一个极大值点。在当前实验范围内，当温度不变，随着盐浓度的升高，OD 值降低，当盐浓度不变，随着温度的升高，OD 值先升高后降低。OD 值变化速率显示，温度对 PSBB 菌生长影响大于盐浓度的影响，等高线呈椭圆型，说明两个因素之间交互作用显著，与方差分析结果一致。图 5 温度和 NaCl 对 PSBB 菌生长影响Fig.5 Response surface for the effect of temperature andNaCl on the growth of bacteria PSBB图6 表明，pH 和盐浓度对 PSBB 菌生长影响呈233抛物线型关系，且均有一个极大值点。在当前实验范围内，当盐浓度或 pH 为高水平时，OD 值随 pH 或盐浓度升高先升高后降低; 当盐浓度或 pH 为低水平时，OD值随 pH 或盐浓度升高不断降低。OD 值变化速率显示，pH 和盐浓度对 PSBB 菌生长影响相差不多，等高线接近圆形，说明 pH 和盐浓度的交互作用不显著。图 6 pH 和 NaCl 对 PSBB 菌生长影响Fig.6 Response surface for the effect of pH andNaCl on the growth of bacteria PSBB三组图直观地反映了各个因素对响应值的影响，利用 DesignExpert 软件进行实验结果优化，本实验主要目的在于优化 PSBB 菌最适生长条件，通过分析得到优化结果为: 当温度 27.94，pH6.80，NaCl0.25g /100mL 时，光合细菌吸光度最大，为 1.364。2.2.3 实验结果验证 为检测响应曲面法所得结果的可靠性，再次进行实验，采用上述优化条件进行 3次平行实验 实际测得的平均实验 OD 值为 1.446。实验值与理论值相对误差为8%，证明应用响应曲面优化 PSBB 菌生长条件是可行的。3 结论本文报道的 PSBB 菌株对培养条件的要求及适应范围，即通过单因素实验研究影响 PSBB 菌生长条件的主要因素，即温度、pH 和盐浓度。利用 DesignExpert 设计软件，采用旋转中心组合实验设计法建立优化 PSBB 菌最适生长条件的数学模型，根据回归分析可知 PSBB 菌最适生长条件是: 温度 28、pH6.80、NaCl 0.25g /100mL。为进一步研究提供了科学依据。参考文献1夏兵兵，康建平，苏波，等 .沼泽红假单胞菌发酵条件的响应面优化研究J.食品与发酵科技，2010，46( 4) :2935.2 Hong J L. Effects of photo catalysis on biologicaldecolonization reactor and biological activity of isolatedphotosynthetic bacteria J . Journal of Bioscience andBioengineering，2003，96( 3) : 298303.3Wu S B，Liang W Z. Purification of As CMP effluent bycombined photosynthetic bacteria and coagulation treatmentJ.Journal of Environmental Sciences，2000，12( 1) : 8185.4Dincer A R，Kargi F.Performance of rotating biological discsystem treating saline wastewaterJ.Process Biochemistry，2001，36( 8) : 901906.5Takeno K，Yamaoka Y，Sasaki K.Treatment of oil containingsewage wastewater using immobilized photosynthetic bacteriaJ.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2005，21( 89) :13851391.6Nagadomi H，Takahasi T，Sasaki K，et al. Simultaneousremoval of chemical oxygen demand and nitrate in aerobictreatment of sewage wastewater using an immobilizedphotosynthetic bacterium of porous ceramic plates J. WorldJournal of Microbiology and Biotechnology，2000，16( 1) : 5762.7黄志勇，王海胜，蒋培霞，等 .几株光合细菌的分离鉴定及在养殖罗非鱼中的应用J.微生物学通报，2005，32( 4) :7278.8徐丽丽，庄传东，贾友敦，等 .光合细菌最佳生长条件筛选J.生物技术，2007，17( 2) :7782.9操玉涛，陈刚，刘立鹤，等 .光合细菌 M01 的培养条件优化研究J.生物学杂志，2006，23( 1) :2651.10谢红刚，王三反，褚润 .光合细菌培养条件的研究J.环境科学与技术，2007，30( 5) :1920.11王 永 宏，张 强，张 兴 . 响 应 面 法 优 化 Xenorhabdusnematophila 发酵培养基的研究J.西北农