不同药物对维氏气单胞菌的抑菌作用研究.doc

不同药物对维氏气单胞菌的抑菌作用研究水产养殖 2006级 于书萍指导老师： 黄小丽摘要：以28种常见药物为材料，测定了其对斑点叉尾鮰的维氏气单胞菌的生物学活性，结果表明，在所试的28种化学试剂中，以环丙沙星、氟苯尼考、奥福星、美福仙、罗美沙星、左氟沙星等共计14种对该菌有较强的抑制作用，而以前水产养殖中常用的四环素、青霉素、红霉素等对此病原菌无抑菌作用或作用不明显，显示出病原菌对其可能已具有抗性，不适合作为它的抑菌药物。关键词：斑点叉尾鮰 抑菌性 MIC前言：斑点叉尾鮰是一种温水性淡水鱼类，适温范围0-38 ，生长摄食温度为5-36 ，最适生长温度为18-34 ，最佳摄食温度为18-30 ，当水温超过39 时会出现呼吸变慢、行动呆滞等不良反应。在溶氧为3 mg/L 时能正常生长，当低于0.5 mg/L会出现死亡现象对pH 值的适应范围为6。5-9.0，对盐度的适应值应小于1【1 2】斑点叉尾鮰有密而细的口腔齿和咽喉齿，属于有胃鱼类，行动敏捷，体色较深一般认为它属肉食性鱼类.在我国养殖面积比较广，有着较好的经济价值。然而随着养殖面积的不断扩大，养殖水域环境的日益恶化，斑点叉尾鮰的病害越来越严重，给广大的渔民朋友们带来了巨大的经济损失。【3】目前对水产养殖动物细菌病进行控制的主要手段是采用抗菌药物治疗。但由于对病原学、药理学等方面认识不全面,在养殖过程中存在高剂量多种药物混合使用等滥用、乱用药物现象,虽然对杀灭病原菌有一定的效果,但毒副作用明显,长期使用,易导致病原微生物产生抗药性。因此,在使用药物治疗细菌性疾病之前,必须测定该药物对病原菌的敏感性研究。【4】对于水产病原的药物敏感性的研究大都采用测定MIC，MBC等方法，目前报道的测定MIC的方法有液体法和平皿法，斜面法，其中由于液体法不能测定出不溶性药物的MIC，故使用较少，以平皿法使用居多，平皿法是将细菌点种在含药平板上，足够药液浓度便可抑制细菌生长，可较快筛选药物，斜面法是在一系列试管中，以普通肉汤培养基按倍比稀释法稀释药液，每管加入等量的含菌普通肉汤和加入琼脂量为2.6%的琼脂培养基,使最终菌量为104CFU/ml、摇匀、摆成斜面;适宜温度下培养16-18h观察实验结果,记录无菌生长的最低药物浓度,即为该药的最低抑菌浓度1. 1:材料与方法1、试验材料 试验对象：斑点叉尾鮰维氏气单胞菌 （四川农业大学实验室）主要试剂：药敏纸片，蛋白胨，牛肉膏，氯化钠，琼脂，蒸馏水，主要仪器：光学显微镜，培养皿，镊子，烧瓶，酒精灯，PH试纸，平板。2、试验方法2.1实验准备211 培养基的配制采用以下配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂17g，蒸馏水1000mL，pH7.2。将除琼脂外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH，加入琼脂，分装于培养皿内，121，15min高压灭菌备用。212 药物敏感性试验【5】将28恒温培养1824h 的菌落, 用生理盐水制成105CUF菌悬液均匀涂抹在平板上, 贴上药敏试纸, 置恒温箱内24h 后观察并制表。抑菌圈直径14mm为敏感, 15-17mm,为中敏感, 18mm为高敏感。实验重复3次。213氟苯尼考等4种敏感药物MIC的测定【6】取菌悬液1ml, 加入含8ml 液体培养基的无菌试管中；再吸取每种各药敏纸片原药稀释液（6.4mg/ml）各5ml, 沿管壁注入装有5ml 灭菌生理盐水的灭菌试管内, 摇匀制成2倍稀释液。按上述操作顺序, 制成6个浓度梯度, 它们的浓度依次为:0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02mg/ml；再从6个不同浓度梯度试管中分别吸取1ml 药物稀释液, 依次加入到各种细菌稀释液中混合均匀, 置28培养箱中培养24h, 取出后观察测定最小抑菌浓度(MIC)并制表。2.结果与讨论2.1.药敏实验 用纸片法对病原菌维氏气单胞菌菌株进行药物敏感性试验，结果见表1， 表1:不同药物对维氏气单胞菌的抑制作用药物名称代号抑菌圈半径cm药物含量判断标准是否敏感乙酰螺旋霉素乙1.0磺胺异恶唑磺2.3氯霉素氯2.4四环素四1.8罗美沙星罗3.0多粘霉素多0.7新生霉素生0.7链霉素链2.1丁胺卡那霉素丁1.6氯洁霉素洁0.6妥布霉素妥1.6麦迪霉素麦0.9新霉素新1.1美满霉素满1.2氟苯尼考尼3.1奥福星奥2.5美福仙美2.7青霉素青0.7恩诺沙星恩2.4利福平利1.5左氟沙星左3.2红霉素红1.8复方新诺明复2.3卡那霉素卡1.8克拉霉素克1.8痢特灵痢1.2环丙沙星环2.9阿奇霉素奇2.6注：每种药物含药量均为30ug/片。2.2MIC值测定从药敏实验所得结果中选择4种抗菌能力较好的药物采用两倍稀释法对维氏气单胞菌菌株作MIC值测定(表2)。表2:药物对维氏气单胞菌的MIC值药物mg/ml0.640.320.160.080.04MIC值mg/ml氟苯尼考+ + + + -+ - - - - - -0.64环丙沙星+ + + - -+ - - - - - - 0.64恩诺沙星+ + + - - - - - - - -0.64左氟沙星+ + + + -+ - - - - - -0.32“+”代表药物极其敏感性 “+”代表药物中敏感 “-”代表药物不敏感3分析 我国畜牧业和水产业发展迅速, 据统计, 2004 年全国肉类、禽蛋、奶类总产量分别达724418 万吨、272317 万吨和236814 万吨, 畜牧业总产值突破1 万亿元, 禽蛋和肉类产量均居世界首位; 水产品总量也连续几年居世界第一, 2005 年产量已超过4000 万吨7。为了使我国畜牧养殖业健康有序发展, 生产安全的畜、水产品, 了解我国养殖业中抗生素的使用现状, 为控制和限制抗生素在养殖业中的使用提供科学依据具有重要意义。1作为促生长剂的饲用抗生素1. 1饲用抗生素发展自1949 年首先在仔猪和雏鸡饲养中使用抗生素以来, 饲用抗生素的应用已有近60 年的历史。60 年代以后, 人们逐步认识了细菌耐药性的产生及其转移机制和饲用抗生素对人类健康的可能危害, 提出了饲用抗生素应与人用抗生素分开, 并开始研制专用饲用抗生素。20 世纪80 年代进入第三阶段, 重点是筛选研制无残留、无毒副作用、无抗药性的专用饲用抗生素, 并与人用抗生素分开, 以保证饲用抗生素的绝对安全。1. 2饲用抗生素存在的问题由于抗生素作为促生长剂使用所引起的病原菌耐药性和抗生素在动物体内及其产品中的残留问题, 世界上取消饲用抗生素的呼声越来越高8，9。事实上世界上不少国家已限制或禁止在饲料中使用青霉素、链霉素、四环素、泰乐星、卡那霉素、庆大霉素等抗生素, 尚在使用的抗生素, 特别是人、畜共用的抗生素, 也有严格的限制措施2养殖业滥用抗生素的危害2. 1抗生素残留对人的直接影响人体经常摄入低剂量的抗生素残留物, 会逐渐在体内蓄积而导致各种器官发生病变。抗生素的残留对人体的影响主要表现在变态反应、过敏反应、免疫抑制、致畸、致癌、致突变等作用 10 。有报道在分别食用了含有10、4、2、0106 或0103 IU m l 青霉素的奶以后,发生了广泛性瘙痒、红疹、头疼等过敏反应。人在食用了屠宰前3d 使用过青霉素的鲜猪肉后(猪肉中含青霉素0145 IU g) 出现了红疹 11 。氯霉素可引起人肝脏和骨髓造血机能的损害, 导致再生障碍性贫血和血小板减少、粒状白细胞减少症、肝损伤等。呋喃唑酮及其代谢物可使动物致癌。为此联合国粮农组织(FAO )、世界卫生组织(WHO ) 和美国食品与药品管理局(FDA ) 禁止在食用动物饲养过程中使用氯霉素和呋喃唑酮。2. 2抗生素残留对人类的间接影响抗生素的代谢途径多种多样, 但大多数以肝脏代谢为主, 经胆汁由粪便排出体外。一些性质稳定的抗生素排泄到环境中后造成环境中的药物残留。这些残留的药物可通过畜禽产品直接蓄积于人体或通过环境释放蓄积到其它植物中, 并最终以各种途径汇集于人体 11 , 导致人体的慢性毒性作用和体内正常菌群的耐药性变化。2. 3细菌耐药性对人类的危害由于在食用动物养殖中抗生素被广泛应用, 细菌耐药性的问题日趋严重和复杂。细菌耐药性不仅使抗生素的疗效降低, 表现在药物剂量增大、疗程延长、复发率升高等, 而且还会引起并发症, 导致死亡率升高。1997 年, 美国明尼苏达州空肠弯曲菌感染的大流行,卫生部门报道抽检了超市的鸡肉和火鸡肉, 鸡肉被污染率为70% , 其中20% 的分离菌株有耐药性; 火鸡被污染率为58% , 其中84% 对治疗弯曲杆菌病的抗生素有耐药性。流行病调查证明, 患者多是由于食用了未煮熟的肉食品所致 12 。根据最近WHO 统计表明, 食源性疾病的实际发病数比报告的病例数多300 500 倍, 全世界因食物污染而致病者已达数亿 13 。动物源性耐药细菌的耐药性向人类的转移, 给人类的健康造成巨大影响, 甚至威胁到人类的生命安全1997 年美国明尼苏达州发生的弯曲杆菌感染流行之所以引起人们的惊慌, 一个重要原因是弯曲杆菌对氟喹诺酮类抗菌药有严重耐药性, 而氟喹诺酮类抗菌药被广泛应用于人类来治疗弯曲杆菌引起的疾病。养殖业中使用抗生素的目的主要是治疗细菌感染性疾病、预防细菌感染性疾病的发生(使用剂量低于治疗剂量) 及作为饲料添加剂促进动物生长(其使用剂量一般为治疗剂量的110 15 )。虽然使用抗生素有可能降低养殖成本, 但长期使用抗生素可诱导耐药菌的出现 14 , 尤其在动物中长期使用低于治疗剂量的抗生素(如预防剂量和促生长剂量) 可加速耐药细菌的出现。耐药菌一旦在养殖动物中出现并在动物间传播, 将使大规模养殖动物成为庞大的耐药基因储藏库, 如近期美国市售鸡肉分离的沙门菌和空肠弯曲菌已普遍对多种抗生素耐药 14, 15。有研究显示, 食品中的耐药菌可以通过直接或间接方式传递给食用动物的最终消费者人类, 对人类临床感染的治疗产生严重威胁。3养殖业滥用抗生素对经济的影响禁用抗生素生长促进剂可能会导致饲养成本的增加。主要原因一是由于动物发病率提高加大治疗费用,二由于采用新型饲料添加剂的成本高于抗生素, 三是由于饲养管理更加严格会增加管理费用。美国的资料估计停用抗生素饲料添加剂, 肉鸡的生产每年将增加成本30 亿美元16。据统计, 瑞典和丹麦在全面停用抗生素作为猪饲料添加剂后, 猪肉的价格上涨了3% 左右。有资料估计在畜牧业禁用抗生素后, 猪肉和牛肉的价格可能每磅分别增加3 和6 美分、鸡肉每磅增加1 美分17 。另外, 2007 年发表的700 万家禽饲养调查显示,停用抗生素作为饲料添加剂并不会加大养殖业成本,也不会影响市场的有效供给。丹麦在禁止使用抗生素添加剂以后, 鸡中耐万古霉素肠球菌从80% 减少到10% , 猪分离的万古霉素耐药株从65% 降至25% , 可节约费用达2550 万美元 17 。值得注意的是, 畜牧养殖业禁用抗生素增加的成本, 与使用抗生素每年300 亿美元的费用和死亡9000 人相比, 禁用抗生素促生长剂对经济和人类健康更为重要。4养殖业滥用抗生素与食源性病原菌的耐药性国家食源性疾病监测网数据显示, 1992 年 2001年十年间, 监测网地区食源性疾病的发病率整体呈下降趋势。微生物为主要的致病因素, 其中以副溶血性弧道在622 株腹泻病原菌耐药性调查中, 弧菌科分离率最高, 为458 株, 占3414%; 肠杆菌科为140 株, 占1011%。弧菌属、志贺菌属和沙门菌属对复方磺胺甲口恶唑和氨苄西林耐药率高达85% 90% 18。抗生素在水产养殖业上低剂量、长期使用, 容易导致耐药菌株的出现和蔓延。有调查表明, 与水产动物感染相关的副溶血弧菌、溶藻弧菌、海鲷弧菌和嗜水气单胞菌对常用抗生素氨苄西林、复方磺胺甲口恶唑、四环素、氯霉素和环丙沙星均产生一定的耐药性, 且逐年有不同程度的增加 1921。美国有数百万人患食源性疾病, 其中3215 万人住院治疗, 5000 人因此死亡 22 。英国有6 万食源性病人住院治疗, 1800 人死亡 23 , 其中主要的食源性病原菌为大肠埃希菌O 157、空肠弯曲菌和沙门菌。直接和间接经济损失每年达14 亿美元, 196 万患者所负担的费用达7 亿美元之多, 尤以耐药菌株感染突出。研究证明, 鸡和猪分离菌株的耐药性与畜牧业使用抗生素有关 24，25 , 其中, 耐万古霉素的肠球菌与食源性动物使用阿伏帕星密切相关26，27 。此外, 畜牧业使用抗生素与人分离菌株耐药性具有一定的相关性也已被很多研究所证实 28，29 。5 在养殖上对病原菌耐药性的检测检测抗菌药物对病原菌的感受性,通常采用MIC 作为抗菌效力的评价指标。30在本研究选用28种药物对维氏气单胞菌的抑菌圈的测定，显示出供试菌对左氟沙星、氟苯尼考、环丙沙星、罗美沙星、阿奇霉素等5种药物高度敏感；对奥福星、复方新诺明、链霉素、氯霉素、恩诺沙星、磺胺异恶唑、美福仙等7种药物中度敏感；对乙酰螺旋霉素、四环素、青霉素、多粘霉素、利福平、新生霉素、红霉素、丁胺卡那霉素、氯洁霉素、卡那霉素、妥布霉素、克拉霉素、麦迪霉素、痢特灵、新霉素、美满霉素16种药物低度敏感。众所周知,不同种类的病原对各种化学药物(尤其是抗生素类药物) 的感受性是不同的，如供试菌对左氟沙星、氟苯尼考、环丙沙星、罗美沙星等药物的耐受性可能是菌种本身所决定的，而其对以前水产养殖中常用的四环素、青霉素、红霉素等对此病原菌无抑菌作用或作用不明显，显示出病原菌对其可能已具有抗性，不适合作为它的抑菌药物。在实际应用中也以饵料中添加恩诺沙星或氟苯尼考等药物的防治为最好。同一病原菌对不同类型抗菌药物的耐药性产生速率是不一样的,而不同的病原菌对同种抗菌药物的耐药性获得速率也不同. 佐古清等用鳗弧菌对氯霉素获得速率的测试结果表明,经过连续10 次药物浓度递增继代培养,使V. anguillarum 对氯霉素的耐药性增强了4 倍【31】 . Aoki et al. 的研究结果证明,迟缓爱德华氏菌对氯霉素的耐受性获得速率,经过15 次继代培养后,增加了125250 倍。【32】 我国的渔药药学基础理论还相当薄弱，渔药使用安全是水产养殖的一个重要问题,已引起社会高度关注水产品的药物残留问题已经引起了社会的普遍关注,为什么会出现高药残？大都因为养殖户在长期不停使用传统抑菌药物的过程中增大了致病菌的耐药性，要治病就要更多的加大药物剂量；【33】因此要控制水产品的药物残留,保证水产品的安全,就必需要重视渔药的安全使用与科学管理。近几年先后出现的氯霉素、恩诺沙星、孔雀石绿等涉及到渔药使用安全的事件是长期不科学使用渔药所引起的矛盾的集中暴发【34】。现在我们的国家制定了水产养殖质量安全管理规定、水产苗种管理办法及农产品质量安全法的制定, 为水产品质量安全管理提供了保障，其中渔药使用、药物残留限量和渔用饲料安全限量等有关水产品质量安全的基础性标准的制定取得突破性进展 35 。伴随小康社会的建设, 我国人民生活水平不断提高, 生活质量将日益改善, 特别是在肉、蛋和奶等动物源性食品的消费上越来越注重安全和质量, 限制或完全消除动物性产品的抗生素残留, 须做到有法必依,加强养殖、流通和销售环节的监管力度。现今应进一步深化药动学、药效学研究,探讨渔药在水产动物体内的代谢规律,只有弄清渔药的疗效、毒性与渔药浓度之间的关系,渔药在体内的蓄积部位及蓄积程度,才能做到安全、合理地使用渔药,才能制定出合理的休药期,从而为临床安全和合理用药提供依据,为剂型的选择和新药的开发提供方向，而研究药物对病原的敏感性也作为安全使用鱼药的一个重要方面必须给予重视，致病病原药物敏感性研究是一项很有前景的技术，可为致病病原的防治起到指导的作用【36】，新出现的斑点叉尾鮰疾病还没有一个好的防治方法，对其的敏感性的研究可以对于该病在生产实际中的预防治疗提供依据。参考文献：1 陈昌福. 斑点叉尾鮰主要疾病与防治对策. 科学养鱼, 2004(12) : 12132 F. P.Meyer Aquaculture Disease and Health Management.JAnim Sci.1991Oct,69 (10):4201 - 8.3王玉堂, 刘绯. 我国斑点叉尾鮰产业发展现状及对策J. 中国水产 , 2007,(12)4陈辉. 渔用药物无公害使用技术J. 渔业现代化 , 2004,(02), 2007,(04)5耿毅,汪开毓,黄小丽等. 一种斑点叉尾鮰急性暴发性细菌性传染病初报. 科学养鱼, 2005 (3) : 516姜新发. 中草药提取物对水生动物常见病原菌的体外抑菌试验J. 饲料工业7 孔凡真. 我国肉类企业的现状与展望J . 山东食品科技,2004, 6 (5) : 3 5.8 Go rbach S L. A nt im icrobial use in animal feed2t ime tostop J . N ew E ng l J M ed , 2001, 345 (16) : 1202 1203.9 A lliance fo r the p rudent use of ant ibio t ics. The need toimp rove ant im icrobial use in agriculture: Eco logical andhuman health consequences J . C lin Inf ect D is,2002, 34(S3) : S71 S14410 杨华, 许冰白. 畜禽产品中药物残留监控的进展及重要意义J . 兽药与饲料添加剂,2001,6 (4) : 39 41. 11 陈西钊, 朱蓓蕾. 食品动物组织中兽药结合残留的毒性J . 中国农业科学, 1995, 28 (6) : 74 82. 12 Barke M G, W ilson N A. Ch icken meat is clearly themo st impo rtant source of human Campylobacter infect ionin N ew Zealand J . N Z J M ed L ab S ci, 2007, 61: 4447.13 凌文华, 朱惠莲. 控制食源性疾病是一项全球关注的公共卫生问题J . 疾病控制杂志, 1999, 3 (4) : 304 306. 14 L uo N , Sah in O , L in J , et al. In v ivo select ion ofCampy lobacter iso latesw ith h igh levels of fluo roquino loneresistance associated w ith gy rA mutat ions and the func2t ion of the CmeABC efflux pump J . A ntim icrob A g entsChem other, 2003, 47 (1) : 390 394. 15 Cui S, Ge B, Zheng J , et al. P revalence and ant im icro2bial resistance of Campy lobacter spp. and S alm onellaserovars in o rganic ch ickens from M aryland retail sto resJ . A pp l E nv ironM icrobiol, 2005, 71 (7) : 4108 41116 N at ional Research Council. Co sts of elim inat ing subther2apeut ic use of ant ibio t ics, chap ter 7 M . W ash ington:N at ionalA cadem ies P ress, 1999: 79. 17 Graham J P, Bo land J J , Silbergeld E. Grow th p romo t2ing ant ibio t ics in food animal p roduct ion: an econom icanalysis J . P ublic H ealth R ep , 2007, 122 (1) : 79 87.18 姜波, 方云霞, 苏兆兰, 等. 烟台地区急性腹泻病原菌及耐药性分析J . 中华检验医学杂志, 2000, 23 (6) : 36. 19 李爱华, 蔡桃珍, 吴玉深, 等. 我国鱼类病原2嗜水气单胞的耐药性研究J . 微生物学通报, 2001, 28 (1) : 58 63.20 石亚素, 童国忠, 薛超波, 等. 舟山养殖大黄鱼烂尾病中哈氏弧菌的分离鉴定及药敏试验J . 中国卫生检验杂志,2005, 15 (3) : 267 269. 21 刘军, 赵婷. 副溶血弧菌致病性及耐药性分析J . 中国卫生工程学, 2005, 4 (5) : 321.22 WHO , Food2bo rne D isease: A focus fo r health educat ionM . Geneva: WHO , 2000: 1 6 23 M ead P S, Slutsker L , D ietz V , et al. Food2related ill2ness and death in the U nited States J . Em erg Inf ectD is, 1999, 5 (5) : 607 625.24 Engel C. W ild Health: How animals keep them selvesw ell and w hat w e can learn from them M . London:W eindenfeld &N ico lson, 2002: 24 38.25 L athers C M. Clinical pharmaco logy of ant im icrobial usein humans and animals J . J C lin P harm acol, 2002, 42(6) : 587 600.26 Shea K M. A nt ibio t ic resistance: w hat is the impact ofagricultural uses of ant ibio t ics on ch ildrens health J .P ed iatrics, 2003, 11 (2) : 253 258.27 Garofalo C, V ignaro li C, Zandri