维生素C发酵研究进展.doc

维生素C发酵研究进展摘要：生物发酵法是产生维生素C的主要途径。用常压输送流动相的方法为经典液相色谱法，这种色谱法的柱效能低、分离周期长。高效液相色谱法（high performance liquid chromatography），简称（HPLC）。是在经典液相色谱的基础上发展起来的一种色谱方法。与经典的液相色谱法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点：应用了颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高；采用高压输液泵输送流动相，流速快，一般试样的分析需数分钟，复杂试样分析在数十分钟内即可完成；广泛使用了高灵敏检测器，大大提高了灵敏度。目前，已经发展了多种不同的固定相，有多种不同的分离模式，使高效液相色谱法的应用范围不断扩大。下面介绍高效液相色谱法的有关知识，新的方法和技术以及在药物分析中的应用。高效液相色谱法是以液体作为流动相并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱对样品的适用性广不受分析对象挥发性和热稳定性的限制因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中可用气相色谱分析的约占20%而80%则需用高效液相色谱来分析。液相色谱根据分离机理的不同可分为液液分配色谱、液固吸附色谱、离子交换色谱和排斥色谱(或凝胶渗透色谱)。目前高效色谱法在天然药物，复方药物，手性药物及临床治疗药物监测等方面应用广泛并有一定的发展前景。关键字：高效液相色谱，药物分析，应用高效液相色谱法也称高压液相色谱法。是一种高灵敏度，高效能，高选择性，快速的分离分析方法。可以用于多种不同性质的溶剂作为流动相，且流动相队分离的选择性影响很大，因此分离选择性高。HPLC是将一定急性的单一或混合溶剂作为流动相用泵将流动相注入装有填充剂的色谱内。注入的供试液被流动相代入柱内进行分离然后分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图和进行数据处理。高效液相色谱仪基本由输液系统，进样系统，分离系统，检测系统和色谱数据处理系统五部分组成。 高效液相色谱法按分离机理的不同可分为以下几类：一吸附色谱法（adsorption chromatography）以吸附剂为固定相的色谱方法称为吸附色谱法。使用最多的吸附色谱固定相是硅胶，流动相一般使用一种或多种有机溶剂的混合溶剂。在吸附色谱中，不同的组分因和固定相吸附力的不同而被分离。组分的极性越大、固定相的吸附力越强，则保留时间越长。流动相的极性越大，洗脱力越强，则组分的保留时间越短。二液液分配色谱法（liquid- liquid chromatography) 液液分配色谱的固定相和流动相是互不相溶的两种溶剂，分离时，组分溶入两相，不同的组分因分配系数（K) 的不同而被分离。目前广泛使用的化学键合固定相是将固定液的官能团键合在载体上而制成的，使用化学键合固定相的色谱方法（简称键合相色谱法）可以用分配色谱的原理加以解释。键合相色谱法在HPLC中占有极其重要的地位，是应用最广的色谱法。按照固定相和流动相极性的不同，分配色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法两类 。三离子交换色谱法(ion exchange chromatography) 离子对交换色谱法是以离子交换剂为固定相的色谱方法，组分因和离子交换剂亲和力的不同而被分离。柱填料含有极性可离子化的基团，如羧酸、磺酸或季铵离子，在合适的PH值下，这些基团将解离，吸引相反电荷的物质。由于离子型物质能与柱填料反应，所以可被分离。样品中不同的组分因离子交换平衡常数的不同而分离。离子交换色谱的流动相一般为一定PH值的缓冲溶液，有时也加入少量的有机溶剂，如乙醇、四氢呋喃、乙腈等，以增大组分在流动相中的溶解度。流动相) 的PH值影响离子交换剂的交换容量。对弱酸或弱碱性的被分离组分，流动相的PH值还会影响其电离状况，流动相的PH值必须使待分离组分处于离解状态，才能被分离。离子交换色谱法用于分离在测定条件下呈离解状态的组分，如具有酸性或碱性的化合物，反相离子对色谱法在药物分析中的应用非常广泛，例如生物碱、磺胺类药物、某些抗生素及维生素等的分析均可采用此方法。除此之外还有空间排阻色谱法，手性色谱法，亲和色谱法等。HPLC在药物分析中的应用 由于具有高选择性、高灵敏度，并可同时用于有关物质检查与含量测定的特点，已成为医药研究的有力工具。如在中草药有效成分的分离和纯度测定、人工合成药物成分的定性和定量测定、新型高效手性药物中手性对映体含量的测定以及药物代谢物的测定等方面都需要用到。天然药物分析 天然药物的来源有动物、植物和矿物之分，其中以植物类为主。由于天然药物的化学成分复杂，其有效成分，可能有一个，也可以有多个，这对于控制药品质量，建立质量标准来说比较困难，BCDE可通过对天然药物的有效成分进行分离鉴定，再测定有效成分的含量吴茱萸是芸香科植物吴茱萸的干燥近成熟果实，具有温胃止吐、温脾止泻、镇痛、升高体温等作用。实验证明，吴茱萸的水提液中含有一定量的游离氨基酸。卢义等研究人员首次利用邻苯二甲醛柱前衍生化法，室温条件下以水甲醇腈作流动相，建立了吴茱萸中游离氨乙基酸含量的BCDE测定方法。该法灵敏度较高，是测定吴茱萸中氨基酸含量较理想的方法。天然药物及复方成药分析 增免扶正片系由当归、党参、黄芪等十几味天然药物精制而成，具有益气生津、活血养血、滋补肝肾、健脾开胃之功效，主要用于抗缺氧、抗疲劳、抗衰老，长期服用可扶正祛邪，提高机体免疫功能，健身强体，益寿延年。该药对心，肝，脾、肾虚、心脑血管疾病、神经衰弱、慢性肝炎、脂肪肝等都有较好的防治作用。谢华等以依利特ODS 柱为分析柱，选择检测波长313nm ，以甲醇-冰醋酸为流动相，25摄氏度的HPTC法测定含当归的复方制剂增免扶正片中阿魏酸的含量，方法简便、快速，灵敏度高，重复性好，可作为该制剂的质量控制指标。另一种方法为反向HPTC法以甲醇水的溶液为流动相,检测波长为205nm.。同时分离测定诺诺感冒片中扑尔敏、扑热息痛、盐酸伪麻黄碱的含量。 抗生素的分析 抗生素是由微生物或其他方法产生的化学物质，在高度稀释的情况下仍具有抑制或杀灭其他微生物的性能。抗生素的分离、分析和定量测定是药物分析中较困难的领域。采用较多的方法是微生物法、分光光度法和化学方法，但所需时间较长、专一性较差。阿奇霉素是唯一的己用于临床的氮杂十五元环大环内酯类抗生素。阿奇霉素比红霉素具有更广泛的抗菌谱，对肺炎链球菌等革兰氏阳性病原菌及流感嗜血杆菌、G内酞胺酶产生菌及黏膜炎莫拉菌有很强的抑制作用阿奇霉素在酸性环境中有较高的稳定性，具有吸收好、生物利用度高、半衰期长等优点。美国药典采用电化学检测器反向氧化铝柱测定阿奇霉素的含量，对于阿奇霉素的分离，pH的值影响较大，在pH11左右有很好的分离效果。 临床治疗药物监测 目前HPLC法是监测GCs血药浓度的相对简便而快速的方法，但仅局限于科研而未广泛应用于临床。MAJIDO等用HPLC法测定血中泼尼松、泼尼松龙和可的松的浓度，结果表明GCs血药浓度的HPLC法测定具有快速、简便、灵敏、准确的特点，且回收率及精密度高。该方法的意义在于可以随时对使用相关药物或未用药患者的血药浓度进行单独或同时测定。随着今后各种固定相的研究以及联用技术的进一步发展，必将出现更多的组合模式，在体内药物分析中有着十分广泛的应用前景。 手性药物分析 在生物体内，几乎所有具有重要生理意义的有机生物分子都有手性。绝大多数都是旋光性物质。两种化学组成、分子式完全相同的化合物，但因组成化合物的原子在空间取向不同，而成为镜像的化合物，称为手性化合物。由于对映体的物理、化学性质相同，实现它们的分离就比较困难，如大多数氨基酸都有右旋体和左旋体，但往往只能获得右旋体和左旋体的混合物。手性药物往往呈现一种对映体具有强的生物活性和药效，而另一种却无效。近年来，对手性药物的拆分定量分析进行了广泛深入的研究。其中，对生物体液中药物对映体的分离分析，有利于了解各种对映体的药代动力学、体内代谢过程和生物利用度。因此对手性药物对映体的拆分也是HPLC的分析热点。手性HPLC拆分法是以现代HPLC技术为基础引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异而进行分离。HPLC法拆分手性药物对映体可分为直接法和间接法。前者是将不对称中心引入分子间，可分为手性流动相添加剂（CMP）法和手性固定相（CSP）法；后者又称为手性试剂衍生化（CDR）法，它是将不对称中心引入分子内。张兰华等以含L苯丙氨酸、硫酸铜的水甲醇为流动相，用HPLC法测定了甲磺酸帕珠沙星中左旋体的含量。张建华等首次发展了一种新型快速的醋酸水溶液为流动相，用HPLC法直接拆分血液中手性药物盐酸哌醋甲的主要代谢产物盐酸哌醋甲酸的方法。手性试剂衍生化法是将对映体经手性试剂衍生，生成非对映异构体后，利用常规HPLC方法进行分离和测定。适用于不宜直接拆分测定的化合物如手性脂肪胺类、醇类等。该法分离效果好，分离条件简便，但对手性衍生试剂的要求较高，操作比较麻烦，多在其它方法无法实现时才采用。对生物样品中对映体拆分过程中，由于内源性物质及代谢产物的干扰，单用HPLC分析，易造成谱峰重叠，不能直接分析体内手性药物。目前，使用多柱偶联技术已成功解决了该类问题。 参考文献： （ 1 ）李玲，刘健，周践，等从历版中国药典分析方法的统计与研究看我国药物分析方法的发展【J】. 药物分析杂志，1998，18：349 （2）卢慧斌，肖静华HPLC在药物分析中的应用J内蒙古科技与经济杂志 2003：105 (3) 陈珠灵，张兰. 高效液相色谱法同时测定诺诺感冒片中扑尔敏扑热息痛、盐酸伪麻黄碱的含量【J】色谱 2001，19：236238