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微生物与发酵工艺实训 实训一 显微镜的使用和微生物测微技术 实训二 细菌形态的观察 实训三 细菌的简单染色和革兰氏染色 实训四 微生物细胞数的计数 实训五 培养基的制备与灭菌 实训六 微生物的纯种分离培养 实训七 紫外线诱变选育-淀粉酶高产菌株 实训八 固定化技术 实训九 酒精发酵 实训十 亚硫酸盐氧化法测定KL 实训十一 谷氨酸发酵的代谢曲线测定实验1 显微镜的使用和微生物测微技术 一、实验目的 1. 练习和掌握显微镜的使用方法（低倍镜、高倍镜、油镜）。2. 掌握使用测微尺测定微生物大小的方法，熟悉微生物大小的一般概念。二、显微镜的构造 图1-1 单目光学显微镜图1-2 双目光学显微镜 人的眼睛只能识别大小为0.1 mm的物体。显微镜是精密的放大仪器，是生物学研究不可缺少的工具。我们用它可以观察肉眼看不见的微小生物的结构。最常用的是光学显微镜，为了正确操作、妥善保管和维护显微镜，延长使用年限，我们必须首先了解显微镜的结构和功能。一台显微镜包括机械系统和光学系统两大部分。现在一般实验室里常用的，是以图1-2为代表的双筒光学显微镜。现以它为例详述显微镜结构和功能如下。（一）机械部分1镜筒 显微镜上部圆形中空的长筒，筒口上端安装两个相同放大倍数的目镜，下端与物镜转换器相连，作用是保护成像的光路与亮度。由于观察者的瞳距有所不同，双筒显微镜多配有瞳距调整装置。2转换器固定在镜筒下端，分两层，上层固定不动，下层可自由转动。转换器上有24个圆孔，用来安装不同放大倍数的物镜。3.物镜安装在转换器下半部分的透镜，多为放大倍数不同的四个。可通过旋转转换器改变观察用物镜。4粗准焦螺旋在镜臂的下部，直径较大。通过转动粗准焦螺旋，使载物台上下移动，从而粗略的调节像距。5细准焦螺旋在镜臂的下部，一般与粗准焦螺旋同心安装，直径较小。它调整像距的范围较粗准焦螺旋小，可以精细调整像距。6镜座显微镜的底部、镜臂下方呈马蹄形的金属座，用以稳固和支持镜身。7镜柱从镜座向上直立的短柱。上连镜臂，下连镜座，可以支持镜臂和载物台。8载物台从镜臂向前方伸出的金属平台。呈方形或圆形，是放置载玻片或标本的地方。中央有通光孔，通光孔左右各有一个弹性的金属压片夹，用来固定载玻片。9. 推进器较高级的显微镜，在载物台上常具有推进器，它包括夹片夹和推进螺旋，除夹住切片外，还可使切片在载物台上左右方向和上下方向移动。（二）光学系统1目镜 又叫接目镜。它是安装在镜筒上端的凸透镜镜头。每台显微镜的目镜都配有一套，一般包括例如 5、10、15、20。镜筒上只能安装一个目镜，通常选择10。2物镜是决定显微镜质量的关键部件。安装在转换器的孔上，也是由一组透镜组成的，能够把物体清晰地放大。一般转换器上同时安装三个或4个放大倍数不同的物镜，即：低倍物镜（4、8或10）、高倍物镜（40或45）和油浸物镜（90或100），根据需要选择使用。3光源双目显微镜采用电灯作为光源，并可调整光源亮度。在不使用显微镜作观察时，应尽量关闭光源，以延长灯泡使用寿命。对于单目显微镜，光源由反光镜承担，它是安装在聚光器下面的一个可作各种方向的翻转的一面平、另一面凹的双面圆镜，反射光线以供观察。光线较强时使用平面镜，反之使用凹面镜。4聚光器聚光器是安装在载物台下面的一个凸透镜，可集中光源投射来的光线。在载物台下方有一个聚光器调节螺旋，它可以使聚光器升降，用以调节光线的强弱，下降时亮度降低，上升时亮度加强。5虹彩光圈又称可变光阑，由多数金属片组成。使用时移动其把柄，可控制聚光器透镜的通光范围，用以调节光的强度。虹彩光圈下常附有金属圈，其上装有滤光片，可调节光源的色调。6遮光器有些简单的显微镜无聚光器和虹彩光圈，而是装有遮光器。遮光器呈圆盘状，上面有大小不等的圆孔（光圈）。光圈对准通光孔，可以调节光线的强弱。7.在转换器上方、与镜筒相接的部位，其内部有光亮度很高的平面镜，将从物镜透射进来的光线反射进目镜中。三、实验原理 （一） 显微镜的工作原理1.显微镜的成像原理 显微镜的放大作用是由物镜和目镜共同完成的。标本经物镜放大后，在目镜的焦平面上形成一个倒立的实像，再经目镜的进一步放大形成一个虚像，被人的眼睛所观察到。图1-3 显微镜成像原理2.影响显微镜放大效果的因素 数值孔径（numerical aperture，N.A.）：N.A.=nsin/2,其意义为物镜与标本间介质折射率n和光的最大入射角半数正弦的乘积。n是影响数值孔径的因素，空气的折射率n=1.0，水的折射率n=1.33，香柏油的折射率n=1.515，玻璃的折射率n=1.52。 显微镜的性功能还依赖于物镜的分辨率，即能分辨两点之间的最小距离的能力。分辨率用表示，=/2N.A.。增大数值孔径，缩短波长可提高显微镜的分辨率，使标本的细微结构更清晰可见。事实上，可见光的波长（380700nm）是不可能缩短的，只有靠增大数值孔径来提高分辨率。 物镜上标有：N.A.1.25、100、OI、160/0.17、0.16等字样，其中“N.A.1.25”为数值孔径1.25，“100”为放大倍数100，“160/0.17”表示镜筒长160mm、盖玻片厚度0.17mm，“OI”表示油镜，“0.16”表示工作距离0.16mm。 3.油镜工作原理 即使采用高倍（4510）放大时，多数细菌仍看不清，所以必须用放大倍数更大的油镜（10010）观察。在用油镜观察时必须要把油镜头（100）浸入香柏油中，香柏油的折射率（1.515）与玻璃片折射率（1.52）相近似，因此在物镜（玻璃）与标本载片（玻璃）之间加入香柏油可以使光线不致因从一个介质（玻璃）进入到另一折射率不同的介质即空气（折射率为1.0）而引起部分散射，造成观察不清楚。这对透镜弯曲度较大，直径较小（通过光线亦较小）的油镜头是特别重要的。（二） 微生物菌体大小的测量原理微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，因此测定微生物细胞的大小在了解微生物的形态特征及其分类鉴定方面，是一项重要的内容。 测定微生物菌体时要用到镜台测微尺、目镜测微尺和显微镜。1. 目镜测微尺目镜测微尺是一圆形玻片，其中央刻有一细长的等分为50格（或100格）的标尺(图1-4)，测量时将其放在接目镜的隔板上。因此，目镜测微尺不是直接测量细菌而是观测显微镜放大的物象。由于不同的显微镜放大倍数不同，故目镜测微尺每格实际代表的长度随显微镜放大倍数不同而异。这样，在使用前须用镜台测微尺校正，以求得在一定接物镜及接目镜等光学系统下目镜测微尺实际测量的长度。2. 镜台测微尺镜台测微尺(图1-4)是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将1mm等分为100格，每格等于0.01mm(10m)，专门用于校正目镜测微尺每格所代表的镜台测微尺的长度。图1-4 目镜测微尺和镜台测微尺四、实验材料和用具 （一）材料1.枯草芽孢杆菌染色涂片。2.金黄色葡萄球菌涂片。3.酵母菌染色涂片。（二）用具 显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、二甲苯、香柏油、擦镜纸五、实验方法 （一）显微镜的使用方法取镜时右手握住镜臂，左手托住镜座。 把显微镜放在水平的实验台上，略偏左（显微镜放在距实验台边缘7厘米左右处）。 将标本片放在载物台上，使观察的目的物处于圆孔的正中央。 旋转粗准焦螺旋将载物台上提，眼睛在侧向注视物镜，防止物镜和载玻片相碰。 通过目镜两眼同时观察，如果见到目的物，但不十分清楚，可旋转细准焦螺旋至目的物清晰为止。使用单筒显微镜，应习惯用左眼观察，以便右眼绘图。 使用高倍镜前，必须先用低倍镜观察，发现目的物后将目的物移至视野正中处。 旋动转换器换高倍镜。如果高倍镜触及载玻片立即停止旋动，这说明原来低倍镜并没有调准，目的物并没有真正找到，必须用低倍镜重新调节。如果高倍镜下观察目的物有点模糊，调节细准焦螺旋，直到视野清晰。调节细准焦螺旋时要注意旋转方向与载物台上升或下降的关系，防止镜头与载玻片强力接触，损坏镜头或载玻片。 如果用高倍镜目的物未能看清，可用油镜。先用低倍镜和高倍镜检查标本片，将目的物移到视野正中。 在载玻片上滴一滴香柏油（或液体石蜡），将油镜移至正中使油镜头浸没在油中，刚好贴近载玻片。用细准焦螺旋微微向上调（切忌不用粗准焦螺旋）即可。 油镜观察完毕，用擦镜纸将镜头上的油揩净，另用擦镜纸蘸少许二甲苯揩拭镜头，再用擦镜纸揩干。 （二）显微镜使用注意事项 显微镜应置于平坦的桌面上。如使用单目显微镜，照明可采用间接日光（即非直射日光）或灯光。一手旋动粗准焦螺旋，一手转动反光镜；还可以使用聚光器（上升或下降）及光圈（放大或缩小）以获得视野中的理想亮度。 将标本片夹在显微镜载物台的十字夹中，注意要正面向上。 先用低倍镜再用高倍镜观察寻找目的物，此时要控制视野不能太亮，注意区别镜头上的灰尘和目的物。 在标本中央滴加一小滴香柏油，从镜筒侧面观察，将油镜（100）轻轻旋下，使它浸在香柏油内。切勿猛烈的将镜头压在标本片上，防止损坏物镜！滴加香柏油时须注意：（a）香柏油不宜过多，仅需一滴即可。（b）自瓶中取出时，切勿搅动。滴到玻片上时，不要涂抹，以免形成气泡。 注意在旋动粗准焦螺旋时，必须特别小心。决不能在观察时将载物台很快提升，以免损伤螺旋。 假如用油镜时一再看不清目的物，可验看油中是否存在气泡。如存在气泡，可将镜头及标本片上的油擦去，重新滴加。 观察完毕后，下降载物台，取下标本片，用干净的擦镜纸蘸少量的二甲苯，轻揩去载玻片上的香柏油后，立即用干擦镜纸揩干。有些标本片没有使用盖玻片，在揩去标本片上所沾的香柏油时应格外小心。可先用擦镜纸吸去油滴，然后用干擦镜纸滴上少量二甲苯，轻轻在玻片上拖动几次后，就能揩净又不至损伤标本片。 收存显微镜时，应将最短的镜头对准透光孔，或将物镜的长镜头转成“八”字式，使两个镜头同时搁在载物台上。切勿将长镜头对准透光孔，以免与聚光器相碰而损坏。镜台、镜身上占有水及污物，必须及时擦去。最后套上显微镜罩。 （三） 微生物大小的测量1. 目镜测微尺的校正将目镜测微尺装入目镜的隔板上，使刻度朝下；把镜台测微尺放在载物台上使刻度朝上。用低倍镜找到目镜测微尺的刻度，移动镜台测微尺和旋转目镜测微尺，使两者的第一条刻度线重合，顺着刻度找到另一条重合刻度线。计算在该放大倍数下目镜测微尺每个小格的实际长度。例如，目镜测微尺的5格等于镜台测微尺的2格(即20m)。则目镜测微尺1格21054m。在低倍镜下求出目镜微尺每格长度后，再用同法求出在高倍镜下和油镜下(镜台测微尺上需加1滴香柏油)目镜测微尺每格的长度。 图1-5 用镜台测微尺校正目镜测微尺2. 菌体大小的测量将镜台测微尺取下，换上标本片，选择适当的物镜测量目的物的大小，分别测出菌体的长和宽各占目镜测微尺的格数，再按照目镜测微尺1格的长度计算出菌体的长度和宽度，即可得到标本（菌体）的大小。六、实验报告 低倍镜：目镜测微尺格=镜台测微尺格，目镜测微尺每格=m高倍镜：目镜测微尺格=镜台测微尺格，目镜测微尺每格=m油镜：目镜测微尺格=镜台测微尺格，目镜测微尺每格=m枯草芽孢杆菌在油镜下：长=目镜测微尺格=m，宽=目镜测微尺格=m金黄色葡萄球菌在油镜下： 直径=目镜测微尺格=m酵母菌在高倍镜下：长=目镜测微尺格=m，宽=目镜测微尺格=m七、思考题 1. 使用油镜时为什么要先用低倍镜和高倍镜检查标本片？ 2. 使用油镜时为什么油镜头一定要浸在香柏油里？ 3. 为什么目镜测微尺必须用镜台测微尺校正？实验2细菌形态的观察 一、实验目的 1.认识细菌的基本形态。2.学习并掌握细菌压滴片及悬滴片的制作方法。二、实验原理 1.压滴法将细菌悬液滴于载玻片中央，加上盖玻片，置于显微镜下观察。此法是研究微生物形态最简单、最基本的方法之一。2.悬滴法将细菌悬液滴于盖玻片中央，翻转，置于凹玻片的凹窝中央，由于细菌不受盖玻片的压力影响，所以此法常用于观察并区别细菌运动的方式，也可观察细菌的繁殖方式及孢子萌发等。3.利用暗视野显微镜形成黑暗背景、被检物构成亮点的特性，可进行细菌运动方式的观察。三、实验材料和用具 1.菌种金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)大肠杆菌 (Escherichia coli)普通变形杆菌 (Proleus vulgaris)枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)黏质沙雷氏菌 (Serratia marcescens)细菌三种基本形态的染色片2.用具显微镜、载玻片、凹玻片、接种环、纱布、镜头纸、镊子、盖玻片、特种铅笔、无菌水、凡士林、火柴、酒精灯、玻片架、香柏油、二甲苯等，722s型分光光度计，0.85NaCl溶液。四、实验方法 1.压滴标本制作取清洁载玻片，放在酒精灯的右侧桌面上，用记号笔在玻片右侧注明观察菌体的名称。点燃酒精灯，取一小滴清洁的无菌水置于玻片中央。用无菌操作取出少许菌苔，于玻片水中，涂匀(见图2-1)。用镊子取清洁的盖玻片。由一端与玻片的菌液接触，徐徐放下盖玻片，注意避免产生气泡。将压滴标本放于显微镜下观察（图2-2）。2.悬滴标本制作取清洁的凹玻片和盖玻片各一片 图2-3 (a)、(b)；用火柴杆取少许凡士林涂于盖玻片的四角；在盖玻片中央用接种环蘸取一小滴无菌水，然后用无菌操作取少许菌苔在水滴上轻沾一下，注意水滴大小要适宜，放菌苔时不要使水滴破散；将凹玻片翻转向下，使凹窝中央对准盖玻片中央液滴，然后轻压。使凹玻片与盖玻片粘合紧密，以免蒸发，然后很快将凹玻片翻转，使盖片向上 图2-3 (c)、(d)。将制作好的悬滴片置于显微镜下观察。 图2-1无菌操作制片示意图1接种环火焰灼烧灭菌；2在火焰3cm处拔出硅胶泡沫塞(或棉塞)；3斜面管口火焰灼烧灭菌；4挑取菌苔；5从斜面试管中取出接种环，管口火焰灼烧再次灭菌；6在火焰3cm处塞上硅胶泡沫塞(或棉塞)；7涂片；8再次火焰灼烧接种环灭菌。图2-2压滴标本 图2-3悬滴标本制片步骤五、实验内容 1.在油浸物镜下观察细菌三种基本形态的染色片。2.用无菌操作制金黄色葡萄球菌的压滴片，置油镜下观察。3.用无菌操作制大肠杆菌的悬滴片，置油镜下观察细菌的运动。4.观察示范片：胸膜肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae)的标本片，细胞成对生长；乳链球菌(Streptococcus lactis)的标本片，细胞成链状排列；北京棒杆菌Asl299(Corynebacterium pekinense)的标本片，细胞排列成“八字形”或栅状；植质乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)的标本片，杆状细胞并成链排列；四联高夫克氏菌(Gaffkya tetregena)的标本片，细胞呈四联体状；藤黄八叠球菌(Sarcina lutea)的标本片，细胞呈有规则的八叠状；普通变形杆菌 (Proteus vulgaris)在暗视野显微镜下观察，黑背景，菌体为一亮点，观察菌体用周身鞭毛进行翻滚运动。5.细菌菌苔的观察和液体培养菌体浓度的检测观察大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黏质沙雷氏菌、枯草芽孢杆菌、变形杆菌、直线接种的斜面，注意菌苔的表观形态。检测大肠杆菌培养液的浊度a将培养1618h (3637oC) 的大肠杆菌培养液用LB液体培养基稀释510倍。b稀释后菌液用漩涡混合器振荡均匀。c以LB液体培养基为空白对照于600nm处，用722s型分光光度计测定菌液的OD值，OD值以0.20.6为宜(OD值过高，加大稀释倍数；过低，降低稀释倍数)。六、实验报告 1.绘图表示细菌的三种基本形态。2.描述所观察的细菌菌苔形态。3.报告所检测的大肠杆菌菌悬液的OD值。七、思考题 1.怎样观察细菌形态? 细菌未染色时，用油镜观察有何困难?2.试述无菌操作的步骤及其要领?实验3细菌的简单染色和革兰氏染色一、实验目的 1.学习微生物的涂片染色的操作技术。2.掌握微生物的简单染色、革兰氏染色的基本原理和方法。二、实验原理 染色是细菌学中一项重要的基本技术。由于微生物与各种不同性质的染料具有一定的亲和力，从而使微生物着色，着色后的菌体折光性弱，色差明显。在显微镜下容易观察细胞的内部结构及其内含物，因此，微生物染色是进行微生物形态观察的重要方法之一。染色分为简单染色 (也称作“单染”)，复染(革兰氏染色、抗酸染色等)。单染较简单，以同一种染料使菌体着色，以显示微生物的形态。复染中的革兰氏染色是一种重要的鉴别染色，丹麦医生CGram发明于1884年，一直沿用至今，是细菌学研究中最基本的方法之一。它是利用两种不同性质的染料，即草酸铵结晶紫和沙黄染液先后对菌体染色。当用酒精脱色后，如果细菌能保持草酸铵结晶紫与碘的复合物而不被脱色，即呈现紫色的细菌，称为革兰氏阳性菌；如果草酸铵结晶紫与碘的复合物被酒精脱掉，菌体染上沙黄的颜色而呈红色，则称为革兰氏阴性菌。现在已知，革兰氏染色结果与细菌细胞壁的成分和结构有关。三、实验材料和用具 1.菌种大肠杆菌(Escherichia coli)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)普通变形杆菌(Proteus vulgaris)2.染液简单染液：齐氏 (Ziehl) 石炭酸 (苯酚) 复红染液、吕氏美蓝染液。革兰氏染液a草酸铵结晶紫染液 (染液)b卢戈氏(Lugol)碘液 (媒染剂)c95乙醇溶液 (脱色剂)d沙黄（番红花红）乙醇溶液 (复染剂)3.用具显微镜、酒精灯、接种环、无菌水、香柏油、二甲苯、载玻片、纱布、滤纸、镜头纸、镊子、染色缸、火柴、玻片架、烧杯等。 四、实验方法 1. 制片涂片取保存在酒精溶液中的干净玻片，在酒精灯上烧去残留酒精，待凉，用记号笔在玻片的右侧，注明菌名、染色类型。在玻片中央滴加一小滴无菌水，以无菌操作(见图2-1)取少许菌苔，在玻片的水滴中涂布均匀，成一薄层。风干在空气中自然干燥。切勿在火焰上烘烤。固定将已干燥的涂片向上，在微火上迅速通过23次，使得菌体与玻片结合牢固。2. 染色简单染色：在已制好的涂片菌膜处，滴加吕氏美蓝染液染色35min，或滴加齐氏石炭酸复红染液染色12min。以流水冲洗涂片。至水无色为止，后用滤纸吸干涂片的水滴，干后，待镜检。革兰氏染色a在已制好的涂片菌膜处滴加草酸铵结晶紫染液，染色l min，水洗。b滴加卢戈氏碘液媒染l min、水洗。用滤纸吸干残存水滴。c斜置玻片于烧杯上端，滴加95乙醇脱色并轻轻摇动载玻片。直洗至流出乙醇刚刚不出现紫色时即停止(约2030s)，脱色完毕后，水洗，滤纸吸干。d滴加沙黄染液复染l min。水洗，滤纸吸干后，备镜检。五、实验内容 1. 用金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌制简单染色片，在油镜下观察。 2. 用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、普通变形杆菌、枯草芽孢杆菌制革兰氏染色片，油镜下观察，区别革兰氏阳性菌和阴性菌。 六、实验报告 1.试述革兰氏染色的程序及染色原理。2.将本实验观察结果记录于表中。染色方法 菌名染色结果简单染色吕氏美蓝染液齐氏石炭酸复红革兰氏染色七、思考题 1.为什么涂片需要固定? 为什么制片干燥后才能用油镜观察?2.革兰氏染色过程中，哪些因素是成败关键，为什么?附：微生物革兰氏染色谱 微 生 物 染色反应革兰氏阳性（G+）格兰氏阴性（G）球菌葡萄球菌链球菌肺炎球菌四联球菌脑膜炎双球菌淋病双球菌卡他球菌杆菌白喉杆菌耐酸性杆菌芽孢杆菌梭状芽孢杆菌大肠杆菌沙门氏杆菌痢疾杆菌变形杆菌绿脓杆菌嗜血性杆菌布鲁氏杆菌巴氏杆菌马鼻疽杆菌克雷伯士菌其它放线菌真菌弧菌螺旋体实验4微生物细胞数的计数一、实验目的 1.了解血球（血细胞）计数板的结构；2.掌握利用血球计数板进行微生物数量计算的方法。二、实验原理 微生物生长量的计量方法有很多种，对于单细胞的微生物如细菌、酵母菌，可以采用直接计数法进行计数，即用计数板在光学显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法。血细胞计数板是一块比普通载玻片厚的特制玻片制成。 玻片中央刻有四条槽，中央两条槽之间的平面比其它平面略低，正中央还有一垂直小槽，槽的两边的平面上各刻有9个大方格。中间的一个大方格为计数室，它的长、宽各为1mm，深度为0.1mm，容积为0.1mm3。计数室有两种规格，一种是把大方格分成16个中格，每一中格分成25小格，共计400小格；另一种规格是把大方格分成25个中格，每一中格分成16小格，总共也是400小格。计算方法如下：1625计数板的计算：细胞数/（mL）= 40010000稀释倍数2516计数板的计算：细胞数/（mL）=40010000稀释倍数三、实验材料和用具 1.材料 酵母菌悬液。2.用具 显微镜、血细胞计数板、计数器、镜头纸。四、实验方法 取清洁干燥的血球计数板，在计数室上面加盖玻片。取酵母菌悬液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴(不宜过多)，则菌液自行渗入，计数室不得有气泡，然后置高倍镜下计数。样品浓度要求每小格内有510个菌体为宜。计数时，用1625的计数板要按对角线方位，取左上、左下、右上、右下四个中方格(即100小格)计数酵母菌液；用2516的计数板，除计数上述对角线的四个方格外，还需数中央一个方格的酵母菌数(即80小格)。每个样品重复计数23次，取其平均值，按上述公式计算每毫升菌液所含的酵母细胞数。计数完毕，将计数板在水龙头上冲洗，切勿用硬物洗刷，自行晾干或吹风机吹干，或用镜头纸轻轻擦拭。五、实验报告 第一次计数的酵母细胞数目个。第二次计数的酵母细胞数目个。从两次的计数结果中求出酵母细胞的平均数目= 个。稀释倍数倍。求出每毫升酵母菌液中的细胞数个。六、思考题 1.使用细胞计数板应注意什么问题?图4-1血细胞计数板正面、侧面观与正面方格放大示意图实验5培养基的制备与灭菌一、实验目的 1.学会一般培养基的制备原理、方法。2.掌握培养基及器皿的灭菌方法。二、实验原理 培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的基质。其中含有微生物生长所需的水分、碳水化合物、含氮化合物、无机盐及各种必需的维生素。培养基可以为微生物生长提供能源、组成菌体细胞的原料以及调节代谢活动。由于不同微生物营养类型不同，对营养物质的要求也各不相同，因此，需要配制不同种类的培养基。一般培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，培养放线菌常用淀粉培养基，培养霉菌常用马铃薯培养基，培养酵母菌常用麦芽汁培养基(或麦芽糖、蛋白胨培养基)。培养基除了要满足微生物生长所要求的各种营养物质外，还应保证微生物所需要的其他生活条件，如适宜的酸碱度、渗透压等。因此，根据不同种类微生物的要求，应将培养基调节到一定的pH范围，如细菌培养基中性偏碱性，放线菌培养基偏碱性，霉菌、酵母菌培养基偏酸性。根据研究目的不同，可以将培养基制成固体、半固体和液体三种形式。固体培养基的营养成分与液体培养基相同，仅在液体培养基中加入凝固剂作支持物，通常加入1.52.0的琼脂，半固体培养基加入0.30.5琼脂作支持物，有时也可用明胶或硅胶作为凝固剂。三、实验材料和用具 1.材料马铃薯、蔗糖、牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉、琼脂、NaCl、KNO3、K2HPO4、MgSO47H2O、FeSO47H2O、NaOH、HCl。2.用具试管、三角烧瓶、漏斗、量筒、吸管、烧杯、纱布、棉花、玻璃棒、pH试纸、铁架台、漏斗架、止水夹、电炉、台秤、硫酸纸、药匙、牛皮纸、线绳、标签纸、剪刀、小刀、镊子、白瓷盘、铁丝筐。四、实验方法 1培养基的制作方法（1）称量按照培养基的配方，准确称取各成分于烧杯中。（2）溶化向上述烧杯中加入所需要的水量，搅动，然后加热使其溶解。用马铃薯、豆芽等配制的培养基，须先将马铃薯或豆芽按其配方的浓度加热煮沸0.5h(马铃薯须先削皮)并用纱布过滤，然后加入其他成分继续加热至其溶化，补足水量。如果配方中含有淀粉，则需先将淀粉加热煮融，再加入其他药品，并补足水量。（3）调节pH值初制备好的培养基往往不能符合所要求的pH值，故需用酸度计、pH试纸或用氢离子浓度比色计来校正，用0.1mol/L NaOH或1mol/L HCl调至合适的范围。 （4）过滤用滤纸或双层纱布(中间夹一层脱脂棉)趁热过滤。（5）分装根据不同的需要，将制好的培养基分装入试管或三角烧瓶内，管(瓶)口塞上棉塞(或硅胶泡沫塞)，用牛皮纸包扎管(瓶)口(图5-1)。液体：分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体：分装试管，每管装液量为管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过1/2为宜；倒平板的培养基每管装1520mL。半固体：分装试管一般以管高度1/3为宜，灭菌后制成斜面(见图5-2)或垂直待凝成半固体深层琼脂。图5-1培养基的分装图5-2斜面的摆法(6)灭菌高压蒸汽灭菌，一般培养基0.1MPa，2030min，含糖培养基为0.05MPa，30min。2培养基的配方（1）牛肉膏蛋白胨培养基(W/V) (培养细菌用)牛肉膏0.3g琼脂2.0g蛋白胨1.0g蒸馏水100mLNaCl0.5gpH7.27.4（2）马铃薯(PDA)培养基(W/V) (培养霉菌用)马铃薯20g蒸馏水100mL蔗糖2.0gpH自然琼脂2.0g马铃薯汁制备：将马铃薯去皮，称量所需重量，切成小块，加水煮沸30min，纱布过滤，补足水量。（3）高氏1号(W/V) (培养放线菌用)可溶性淀粉2.0gFeSO40.001gK2HPO40.05g琼脂2.0gMgSO47H2O0.05g蒸馏水100mLKNO30.1gpH7.67.8NaCl0.05g配制时，先用少量蒸馏水将可溶性淀粉调成糊状，在沸水浴中搅拌，煮融，再加入其他成分，补足水量，0.1MPa压力下灭菌20min。3培养基制作注意事项 （1）加热溶化过程中，要用搅拌棒贴烧杯底不断搅拌，以免琼脂或其他物质粘在烧杯底上烧焦碳化，甚至可能导致烧杯破裂，加热过程中所蒸发的水分应补足。（2）每一种培养基的pH值必须按各自不同要求准确校定。（3）所用器皿要洁净，勿用铜质和铁质器皿。（4）分装培养基时，注意不得使培养基在瓶口或管壁上端沾染，以免引起杂菌污染。(5)培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证杀菌效果和不损失培养基的必要成分，培养基灭菌后，必须放在37oC温箱培育24h，无菌生长方可使用。4棉塞制作棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发，所以正确地制备棉塞是培养基制备中重要的一环。正确的棉塞是形状大小，松紧应与试管(或三角烧瓶)完全适合。过紧则妨碍空气流通，操作不便；过松则空气会毫无障碍地进入试管(或三角烧瓶)中，达不到过滤空气中微生物的目的。棉塞过小往往易掉进试管内。正确的棉塞头较大，约有13在外，23在试管内(见图5-3)。目前，有条件的实验室已使用塑料试管帽、金属试管帽、硅胶泡沫塞替代棉塞，此处介绍棉塞的制作，以备不时之需。图5-3棉塞制作5灭菌(1)培养基的高压蒸汽灭菌需灭菌的物品(分装在试管、三角烧瓶中的固、液体培养基)，加上棉塞、硅胶泡沫塞等用防潮纸包好(防止锅内水汽把棉塞淋湿)，放入灭菌锅内的套筒中。摆放要疏松，不可太挤，否则阻碍蒸汽流通，影响灭菌效果。关闭灭菌锅盖，旋紧螺栓，切勿漏气。打开放气阀，加热，热蒸汽上升，以排除锅内冷空气。灭菌锅内水沸腾，排大汽约510min，关闭放气阀。关闭放气阀后，灭菌锅处于密闭状态，随着加热，锅内蒸汽不断增多，这时压力和温度都上升，当温度升至121oC，压力达0.1MPa时，保持2030min，即达到灭菌目的。灭菌完毕，待压力表上压力读数自然降至“0”时，打开放气阀。注意不能打开过早，否则突然降压致使培养基冲腾，使棉塞、硅胶泡沫塞沾污，甚至冲出容器以外。打开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及培养基。(2)干热灭菌法常用于空玻璃器皿的灭菌。凡带有橡胶或塑料的物品、液体及固体培养基等，都不能用干热法灭菌。进行灭菌时，先将要灭菌器皿(培养皿、吸管的包装方法见示范)包好，放入电热烘箱内，调节温度至160170oC，维持12h(当温度升至80oC以上切勿打开烘箱，以免引起玻璃器皿破裂和火灾)。灭菌后，当温度降至3040oC时，打开箱门，取出灭菌器皿。五、实验内容 1.按教师指定的小组，每一小组制一种培养基300mL，其中200mL分装于23个锥形瓶中，另外l00mL分装入试管，每管57mL，待灭菌后制成斜面。2.每一小组制备无菌水1瓶(100mL三角烧瓶中加水99mL，内装少许玻璃珠)，制备无菌水试管4支(每支试管加水9mL)灭菌。3.每一小组准备1mL塑料吸嘴(湿热蒸汽灭菌)或1mL吸管(干热灭菌)5支，培养皿12套(干热灭菌)。六、实验报告 写出你所制备的培养基的配方，并分析其中所含物质对微生物生命活动所起的作用。七、思考题 1.什么叫培养基? 有什么功能? 培养微生物的培养基应该具备哪些成分和条件?2.培养微生物能否用同一培养基?细菌、放线菌、霉菌的培养基有何异同? 培养基为什么要调节pH值? 所有微生物培养基最适pH值是否相同?3.培养基为什么要灭菌后再用? 可否用橡皮塞、木塞代替棉塞或硅胶泡沫塞?4.如何检查灭菌后的培养基是无菌的?实验6微生物的纯种分离培养一、实验目的1.学会将混杂的各种微生物分离成纯种，掌握统计分析样品中微生物的种类和数量的方法。2.学会从菌落及培养特征区分细菌、酵母菌、放线菌和霉菌。3.学会好氧，兼性厌氧、专性厌氧的微生物平板及斜面培养的方法。二、实验原理在自然界中，微生物的种类很多，数量很大，为了获得单个菌体，首先必须把要分离的材料进行适当的稀释，按微生物生长所需要的条件，使其在平板上，由一个菌体繁殖成单个菌落，这样，就能从中挑选出所需要的纯种。由于细菌、放线菌和霉菌所要求的营养条件不同，利用不同的培养基制成平板进行分离，然后从菌落形态上的差异，可以把细菌、放线菌和霉菌三大类群区分并可计算出其数量，分别接种到试管斜面上，然后，在平板上反复进行分离培养，最后可获得纯种。三、实验材料和用具1.材料土壤样品培养基a牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；b高氏1号培养基；c马铃薯培养基(PDA培养基)。2.用具无菌培养皿、无菌吸管、无菌水、酒精灯、接种环、接种针、火柴等。四、实验方法 1分离培养法（1）好氧性及兼性厌氧性微生物的分离连续稀释分离法A稀释土样称1g土样，在火焰旁加到有99mL无菌水和少许玻璃珠的三角烧瓶内，将瓶子依左右方向振荡数十次(或在振荡器上振荡分散)，使土样与水充分混合，将菌分散，土样中的菌被稀释了100倍，土壤悬液的稀释度为10-2。在火焰处打开无菌吸管的纸套(或用微量加样器装上无菌的塑料吸嘴)，用无菌吸管吸取土壤悬液1mL，加到一个盛有9mL无菌水的试管内，稀释至1000倍制成稀释度为10-3的土壤悬液，将此吸管在试管内反复吹吸3次，然后取出，通过火焰，再插入纸套内，以备再用。轻轻摇动试管，使菌液均匀。再用刚才用过的吸管，插入试管内，反复吹吸3次，然后取出1mL菌液，加到另一支9mL无菌水中，制成稀释度为10-4的土壤悬液(图6-1)。用微量加样器亦需反复吸吹3次，用毕弃去塑料吸嘴。图6-1稀释过程示意图同法按每级稀释10倍的次序得到10-5、10-6的土壤稀释液，稀释完后，用最后一支吸管(或塑料吸嘴)，由最小的稀释液(10-6)开始吸取0.2mL加到编号为10-6的培养皿，再依次分别从10-5、10-4试管中各吸取0.2mL稀释液，加到相应编号的培养皿内，每次吸取时，吸管都要在稀释液中反复吹吸几次。B平板的制作及培养琼脂是固体培养的支持物，它在95oC融化，40oC以下凝固，将已灭菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基融化后(水浴融化)冷却至4550oC(温度过高，培养皿盖上凝结水太多，菌易被冲掉或烫死；温度过低，则培养基凝固，不易倒出)。右手的虎口、拇指和食指握住试管，左手翻转手掌，以无名指与小指在火焰处拔出棉塞(或塑料试管帽、硅胶泡沫塞)，微烧管口一周，左手把皿盖打开一缝，容试管探入倾入培养基后，迅速将皿盖盖妥，平放桌上，轻轻旋转，使培养基与土壤稀释液充分混匀，待凝固后，即成平板。将培养皿倒置于37oC温箱中培养24h，细菌即在所固定的位置长成肉眼可见的菌落。放线菌的稀释分离法同前，只不过在制土壤悬液时，于99mL无菌水的三角烧瓶内加入10的苯酚溶液10滴，以抑制细菌生长，28oC温箱，培养710d。霉菌的分离也同前，其不同点在于培养基中先加入80的乳酸数滴抑制细菌生长，平板于25温箱培养34d。平板划线分离法将融化的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基制成平板，待冷凝后，左手持皿底，平板面向上，稍斜，靠近火焰，用接种环取稀释样品一环在平板上划线，划线分离后，置于37温箱中，培养12d，即出现单个菌落。划线分离方法见图6-2，图中1、2、3表示划线次序。 AB图6-2划线分离方式A用接种环以无菌操作取细菌悬液一环，在平板培养基的一边，做第一次平行划线23条。转动培养皿约70o角，用烧过冷却的接种环，通过第一次划线部分，做第二次平行划线。用同法通过第二次平行划线，做第三次平行划线。B先以沾有细菌悬液的接种环在平板的一端涂抹一下，使该处沾上一些细菌，然后，烧掉环上剩下的细菌，再用烧过冷却的接种环，通过刚才涂抹的部分，左右划线，不能互相接触。划线时，注意接种环与平板表面约成2030o角，划线分离对细菌、酵母菌较为适宜，而霉菌和放线菌的分离多采用稀释分离法。（2）厌氧性微生物的分离培养厌氧性细菌必须在厌氧条件下才能生长繁殖，因此在培养时必须将空气中的氧全部排出，方法如下。吸氧法A在干燥器底部放入焦性没食子酸粉末约20g，及盛有20KOH溶液(约150mL) 的烧杯。B将已进行稀释分离或划线分离的带菌平皿放入干燥器上层，干燥器盖涂凡士林，加盖密封。C轻轻摇动干燥器，使烧杯倒下，KOH与焦性没食子酸相混，产生吸氧反应，温箱培养(此法用大试管内套装小试管可以代替干燥器和培养皿)。抽气法A在真空干燥器内装入带菌平皿或斜面试管，抽真空至水银柱降至15mm为止。B温箱培养。厌氧菌用上述两种嫌气培养菌落均生长在琼脂表面。2接种方法（1）斜面接种技术操作时按图6-3的顺序，并注意教师的示范操作。试管先贴上标签，注明菌名、日期和姓名，然后将菌种斜面和欲接种斜面试管架在左手虎口之上，用食指和中指夹住试管，大拇指按在两管中央，菌种管口在外方，斜面稍朝上。先将棉塞(或塑料帽、硅胶泡沫塞)用右手扭转松动，以利接种时拔出。右手拿接种环末端，使其垂直于火焰中，烧红灭菌。用右手小指、无名指和手掌拔掉棉塞。以火焰灼烧管口，烧时应不断转动试管口，使试管口沾染的少量杂菌得以烧死。图6-3斜面接种的无菌操作和穿刺接种1接种环（针）灭菌；2启开棉塞；3管口灭菌；4挑取菌苔；5接种；6塞上棉塞；7穿刺接种将烧过的接种环伸入菌种管内，先将环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烫死被接种的菌体，然后轻轻接触菌体，取出少许，慢慢将接种环抽出试管。迅速将接种环在火焰旁伸进欲接种试管，在培养基上轻轻划蛇形线，划线时要由底部到顶部，由下而上，但不要把培养基划破，也不要使菌种污染管壁。将火焰灼烧试管口，并在火焰旁将塞塞上，塞棉塞时，不要用试管去迎棉塞，以免试管在运动时污染杂菌。放回接种环前，将环在火焰上再烧红灭菌。放下接种环后，再腾出手将棉塞塞紧。（2）液体接种(由斜面培养基接入液体培养内)操作方法与前相同，但要使试管向上略斜，以免液体培养液流出。将取有菌种的接种环送入液体培养基时，要使环在液体表面与管壁接触的部分轻轻摩擦，接种后塞棉塞(或硅胶泡沫塞)，将试管在手掌中轻轻打动，使菌体在培养基中分散出来，放置于37oC温箱培养。（3）穿刺接种将取有菌种的接种针，自固体培养基的中心刺入，直到管底，但不可刺穿，然后原路拔出，塞棉塞(或硅胶泡沫塞)，37oC培养。3根据菌落及培养特征鉴别微生物的类型由于微生物个体表面结构、分裂方式、运动能力、生理特性以及产生色素的能力等各不相同。因而个体在固体培养基或液体培养基上生长的情况，往往各有特点，按照微生物在固体培养基上形成菌落的特征，可用来初步辨别是何种类型的微生物，应注意菌落特征的形状、构造、大小、颜色、透明度、气味及黏滞性等。一般来说，细菌和酵母的菌落是比较湿润的，用接种环极易将菌体挑起；放线菌的菌落硬度较大，干燥致密，且与培养基紧密结合，不易被针挑起；霉菌菌落呈蛛网状、绒状或棉絮状。如果要鉴定菌种，则对于微生物在液体培养基中以及在斜面培养基上生长的特征都应比较详细地观察，通常用接种针挑取菌体少许，在斜面上由下到上部划成直线接种，培养后，观察生长旺盛的程度，形状、颜色及光泽等。在液体培养基中培养后，应注意浑浊度，有无沉淀，有无表面生长等特性，参见图6-4、6-5、6-6。五、实验内容 1.按教师指定的小组进行从土样中用稀释分离法分离细菌、霉菌或放线菌，待单菌落长出后，移接斜面培养，并计算出每克土样中微生物的数量。2.从教师准备的混合菌悬液中用平板划线法分离出细菌的单菌落，纯化，并移接斜面培养。3.观察穿刺培养标本。4.观察厌氧菌分离的示范平板(注意菌落在培养基的着生部位)。图6-4平板上细菌菌落和斜面划线生长的形状A平板上细菌菌落的形状；B斜面划线培养后的生长情况图6-5细菌沿穿刺线生长的特征(琼脂柱穿刺和明胶柱穿刺)A在琼脂穿刺培养中的生长；B在明胶穿刺培养中的生长图6-6肉汤液体培养生长的特征六、实验报告 1.选择刚好能把菌分开，而稀释倍数最低的平板(一般含菌落20300个)，计算每克土样中微生物的数量：微生物的细胞数（个/g）=2.填写下表：菌落特征名称 形状菌落大小/cm表面光泽与培养基结合程度培养温度培养时间细菌放线菌霉菌七、思考题 1.分离微生物的目的是什么? 用稀释法分离，怎样保证准确并防止污染? 用划线法分离，怎样保证得到相互分离的菌落，由菌落如何得到纯培养菌种?2.为什么在分离霉菌时要加入几滴80的乳酸?加在何处?3.为什么在分离放线菌时要加入10的苯酚? 加在何处?4.培养微生物时应考虑哪些原则? 培养时，为什么要把已接种的培养皿倒置保温?实验7紫外线诱变选育-淀粉酶高产菌株一、实验目的 1. 学习菌种的物理因素诱变育种基本技术。 2. 通过诱变技术筛选出高产-淀粉酶的菌株。 二、实验原理 紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成突变型。紫外线诱变一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为2030 cm，照射时间依菌种而异，一般为13 min，死亡率控制在5080为宜。被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。同时，对于细菌细胞的生理状态，要求培养至对数生长期为最好。 本实验以紫外线处理产淀粉酶的枯草杆菌，通过透明圈法初筛，选择淀粉酶活力高的生产菌株。 三、实验材料 菌种产淀粉酶枯草芽孢杆菌 器材装有15W或30W紫外灯的超净工作台、电磁力搅拌器（含转子）、低速离心机、培养皿、涂布器、10mL离心管、（1、5、10mL）吸管、250mL三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球 培养基和试剂 无菌水、75%酒精 0.5碘液碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL。先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘片全部溶解后，加足水即可。 选择培养基可溶性淀粉2g，牛肉膏1g，NaCl 0.5g，琼脂2g，蒸馏水100mL，pH6.87.0，121灭菌20min。 肉汤培养基牛肉