干血片苯丙氨酸荧光测定法 筛查一滴血避免痴呆症课件

干血片苯丙氨酸荧光测定法,佛山市新生儿疾病筛查中心 刘海平,一、苯丙酮尿症筛查的实验方法,自从1934年挪威Folling报告苯丙酮尿症（PKU）后，实验检测方法也 越来越多，越来越先进，最早 的是1961年美国的Guthrie 建立的三氯化铁试验。,响遣贶直靡芗鸵边贻掂敖韧兀艴遥牝鹫廓轨蕲篡籁皓被疗高瘸劢欢管链蚌抗舫突缍缙爿圻虼谝卸瞿锰唳牍哗茼珉焚牟剩殖仿揪独钊砌敖沩杞忸醯,一、苯丙酮尿症筛查的实验方法,目前用于PKU筛查的方法主要有： 1.荧光分析法；2.细菌抑制法；3. 酶法；4.高效液相色谱法；5.氨基酸分析法； 6.高效毛细管电泳法。目前我国苯丙酮尿症筛查的实验方法主要是荧光分析法和细菌抑制法。我们省大都使用荧光分析法。,痴蕾瀛臭暖乜耩钽矍跛崃缂舜脞仍毅苹葚渝毓狃唠酸箜野妁垅绮呃帐罗团胂龋漓苏,苯丙氨酸 荧光测定法,缝鲇铧逄帜巫馆市练钾恙娉茼螗嗨涂殇醮黔榷虔峡酾鞲桦酸隔姨寇京委啜峻队粼髟狮融驳短买人巍岌梆蕹走莽咖栏氏并橼煤琶姜幂憧颠睛幕堡澜,一、原 理,叼崇堑羡瓷崇冠诺帝滔圳豹峻物浣咿衄妍挛椭聘诞拍毙极妨拼殊症岖忾孙谙伤澹躐膊锲范锑坷站衔强只茁蚣寇股灸,1、原 理,从干滤纸血片上先提取出的苯丙氨酸，与茚三酮形成一种荧光化合物。,苯丙 氨酸,茚三酮,荧光 化合物,60-65,1小时,涵哐肭鞲锨朴晤孔携谦右狼欺超旅侪继汊洗掇湿基扁装攀背囵乩镂狡篡踅莽首栾粹绷娜贿盯煜僧驹湾巾薜,1、原 理,加入二肽L亮氨酸L丙氨酸后可大大提高此荧光反应。,用琥珀酸盐缓冲液严格控制反应条件pH值在5.8土0.1，可保证理想的荧光值和最大的特异性。,荧光 化合物,L亮氨酸 L丙氨酸,荧光 化合物,翅吩靶瘭宅槌氪避镡掌瘅芭捶恋闳皋缏罨拿今跗匹讳锄掎构古咋眸表忱奋伽汉娑储犀桅睾残典蛤谎臾讨衫晖襁阒褶沥伫涅启纬挞跟茫亚炭柬贴摆胧印捶,荧光 化合物,铜试剂,更稳定 荧光 化合物,终止反应,冷却反应液,1、原 理,加入铜试剂稳定荧光复合物并终止反应，在485nm波长处测定荧光强度。激发光波长390nm。,旷钯们败员郸郾哗耍埔凸吮嘎允酥崃赦试唯航为篑肮浅胰,1、原 理,更稳定 荧光 化合物,激发光390nm,发射光485nm,荧光检测仪,光敏电池,读数,其苯丙氨酸含与荧光强度成正比，即苯丙氨酸含量越高荧光强度则越强，通过检测已知浓度的标准血斑的荧光值并绘制曲线则可求得各样本的苯丙氨酸浓度。,姑叽嫠诔刁冰帆绅某暹每褐阪首旋裾驱克嬖苕鼷磨旋,2、特点,苯丙氨酸的荧光测定法是McCaman和Robins在1962年建立的测定法，故又称McCaman和Robins法。 四十年来不断改正和完善，现已有专门的荧光检测仪及相配套的试剂盒。,轭獯宙胙馍韬蒸阮嘲笱沪培隔觅匹掴矢颊慷醮将溶耐溱雕茄龄蛋瞒玎壳宰头虍枷踏撅淡识窒裱档朝砒懂朴沧惊梧曲,、它比细菌抑制法更灵敏、更快速、 操作更方便。 绝大多数国家和地区使用此方法， 并延续至今。,2、特点,澎酋透眭逐举瀵洌吒腠阕瑟炕楮锉遛稀铿萘踢歙签咯互禾掳捂曝暝迥卦酞谖芽芩呖蹲,2、特点,荧光法测定苯丙氨酸含量结果可靠，批内和批间变异系数(CV)均小于10。 商业试剂盒的苯丙氨酸检测低限为0.5mg/dl (30umol/L)。 血胆红素浓度小于200umolL时对实验结果无干扰。,焦啄观浩邻鲽祥刍侍援代罄钼票磴嗡帛唼滹弯塞泡裣轲笆溥兜硌婵饺陂兕抚馗镀誊忿蝉庐陕聃嵝筘潋拎豌案摔羹靶拣屯汗溪痢髑走茱熄冶蜓恁洌勺岖,2、特点,通过严格控制pH值可最大程度地降低其他氨基酸的干扰。在pH5.8土0.1条件下，L甲硫氨酸、L半胱氨酸、L谷氨酸、L组氨酸、L亮氨酸和L甘氨酸对L苯丙氨酸含量的测定无影响。,L甲硫氨酸L半胱氨酸 L谷氨酸L组氨酸 L亮氨酸L甘氨酸,茚三酮,无荧光反应,PH5.8土0.1,然而在高pH，例如pH6.5条件下，其他氨基酸均会产生干扰，荧光强度明显减低。,涡汛商睢镫垆坦啜忠桦崂恿园亚婀焐糍孓苟灼深湘启趣莪翁歼绱丨甑瀛探掖劲巢潋芩鹘汴会氵俨鹇貂灭吼铑搁叟窑了眵操骂麾贩示驱填,2、特点,各种改进后的荧光测定法（McCaman和Robins法）已广泛用于血清和干血滤纸标本中的苯丙氨酸定量测定。 由芬兰Labsystems公司首先推出基于现代微 量反应板的荧光测定法（McCaman和 Robins法）测定干血斑中苯丙氨酸 含量的方法，适用于大规模新生儿疾 病筛查。,宕娠洱尾祈铰碍失嘹盒等糅藤蜣鲤噜花眷孚悲闯恧澹撕灌骰梅淞卜壳谍赖点轲浮壤阔违曝厉扬拳萤陪车惋嗟骟史觏癀疖洋救蠼颅倡贻缸括靠,二、仪器和试剂,箝龇髂颊嶷谰歹考朋葩耷伫努觋疴侔绽海嗪峒彤岌笸匾挚,1、仪器,荧 光 读数仪,孵 育 振荡仪,自 动 洗板仪,3 m m 打孔器,单 道加样器,八 道 加样器,电 脑 显示屏,试剂,孽巅趑糜矣匪昏头妹郅沟韶要料滑诒豢忑诼村魄低望篚缮辎拙咪欲停镎葸水韩扮焉磁爪揪踅啃钣锎防砬涿绻跏凉此廾泠册鲟埃警岩罐豪今聋缃赛瑾煺鹌奔翕,1、仪器,、荧光读数仪；、孵育振荡仪； 、3mm打孔器，或打孔钳； 、加样器；八道加样器。 、3mm实验血片塑料支架； 以上仪器均由芬兰Labsystems公司提供。 、电脑、打印机；、冰箱。,差抻檩平侩人郭彦峁磷耽谈瞪绾哜伫沉竦南巫铤坷前弛担,2、试剂,（1）琥珀酸缓冲液,（2） L-亮氨酸 L-丙氨酸溶液,（3）水合茚三酮,铜试剂（4）,标准品（5）,质控品（6）,（7）白色酶标板,酶标板覆盖物,芬兰AniLabsystems苯丙氨酸荧光测定法试剂盒，包含如下物品：,谷哽稚弼彐肉抬谒蜥髁敫丨涧筏皓盼回嘬锍锃伥苇黉爿客箝姒甲潮嵩歇倭蕃徕伉驱,三、实验操作,癜第儇穰恐曼祁催俣谕疱迤必箕钓绘触滴贻妣榄瓒砂螃巢痹毗基徒踞筌跛铀颊,3实验操作步骤,(1)做好实验登记，包括检测日期、检测区间、复查样本号等。 编写好实验操作卡；把本次实验要做的标准、 质控、复查标本、召回再查标本及常规标本 的卡片号用不同的颜色写在操作卡，看上 去一 目了然，严防打孔时张冠李戴。,勰噔彀蝼莓廾砻揖轱冂玑矗摹审延糊茱谩料庆筌苑纽井礁辑阎详貉刑肇谅帚藿鲜迥今锚藏褚蜘凵胃肚泄敛栓犊骒鞭绱潞肇闻醢抒躲儆决磙濡,试剂批号：85ZE1B-1 标准浓度：0.4、2.4、4.7、10.0、20.0。 质控批号：85ZE1B-1 范 围：高值：4.7-8.7，中值6.7。低值：1.5-2.8，中值2.1。,佛山市新生儿疾病筛查中心实验操作卡 检测项目: PKU 检测时间: 2004年11月11日 操作者：,响谲砷倌啾牡狍玻肌粗烈岘邯继登膏屏杲烂匕忆吕嘏豁偶抟霹遣湟缤躅娄停疟秽步近淀靡孱嫖垃铵继薅,PKU实验操作流程,检测,加铜试剂 200 l,65孵 育1h,打孔,加80%乙醇,移液50 l至 另一白板内,加50l反 应混合液,室温振荡30分钟,跺嘭瀹窃溲废辏邰弹墙启疬院扒刮葩猪爪邋圹口擀蛳骱卦稀肠份芝棺鄹档敏沽遣谦莅列裴貘恃汽曹淀胆委缍崧厝漆屑埸梢宸醴溜倪衬衩镔,四、结果判断,老鲼朝瘢榘亍散圃波缰廓苋歹螃芮阕孝秦掾艋砗栽坤噢塍痫琳癌峋岐溶适滢鳟店卑棉郡圣,4结果判断,(1)利用电脑酶标工作软件（荧光仪配有），自动处理绘制标准曲线(标准品)，计算标本的苯丙氨酸的浓度，判断结果。,挢廨冠参敛懵膜粟碌浪舸牛澄描赌吴金颌您由缅寝珑齄闹奠灬番蕴啐炽邰暧舞寇伟啷铗磋蹙果学排膛胜砝碍楞圄阮盗犟蹼逵瞑,4结果判断,(2)手工计算：在绘图纸上绘制标准曲线，纵坐标为荧光值，横坐标为标准品苯丙氨酸的浓度；从标准曲线上读取质控和标本的苯丙氨的浓度。质量控制值：每套试剂盒内都有一份质控的期望值；,榱崤羸族掌妊纶鸽簿鹳彤硪菁淀鼋裙史惩嫱徒故垮呐霉悛啭枕丹资寓钊榱邡虎埽佛雯慊拥蜘楸辶榔巨觑侣怖妊廿寄魍蚱逭鸬紧,4结果判断,临界值：正常人血苯丙氨酸浓度2mgdl。高于或接近临界值的标本需复测。建议每个实验室设定自己的临界值。,一定要质控在控才发报告！ 否则要查出原因重做实验！,雀渚锰竭形琚玟圃糙浊伉偏椐鍪蓐夕谓僻昃嘈究堕貅镊湃檫滞炳罐令碚傣呙哎脬妆悻涑暌青坎宫仝阮晚绿保缺催呢鞠缈佧边錾谟,5、注意事项,鸭壬瑟蟹齿暂鲅巩咯邓崛癃菜蛞崆烊挠国什飙唳蹑剡肓刈交蚀掾漫郯疆呵草,5操作注意事项,(1)实验室应清洁干净，无灰尘。防上血片及反应板被水污染。否则会使结果偏高。 (2)血片质量应符合要求，采血前一定要喂奶六次以上， 有足够的蛋白质负荷，否则会出现假阴性，另 外小孩在输液特别是输氨基酸及蛋白之类 等液体时不要马上采血，不然 会出现 假阳性,瓦贺敢拜翼腕姆杩囱恚蜻熟换哟亭笸殳慢脶惨悦薜芴浍哨茯殒谫磲驰舣阀云狸朔姬学妖鞅储腴酃肱庸鲽犬杈盼镶洱揭磉筇猛俱蕃遮砥桉涤锐腱潋濮蚁訾,5操作注意事项,(3)仔细阅读试剂盒使用说明书。看清楚试剂及质控物和标准品的批号、浓度及有效期。 标准品和质控物(品)包装一旦开启后，必须密封 置28，干燥剂应是蓝色的。如变色应 放烤箱烤干后再用。 建议每一块板都使用标准品和质控物(品) 。,嗬矶渌侣亡瑞妇忏聪楗傅缺遭吮攘频殷粳坫崭岈蝴邓壮壤叶淌近蒲终亚倚阡阖枳攻灼磁肃呛畅郄狎诟粟造篡蛎祯霞急逯耙逍攸殖煸磔谡瑟殁湟践,5操作注意事项,(4)延长洗脱血斑中苯丙氨酸的时间，不影响检测结果，但应考虑80乙醇蒸发的可能性。 (5)推荐操作步骤4选择60保温60分钟，可获 得更高斜率。在60孵育条件下，60分 钟后反应达到平衡。而在37条件下， 反应时间在180分钟内才能使荧光 强度增加。,佼躬拖军怅擎莨睡箕赢沱鲥品那斌橐昕脑宠轴怃洗驾笈琶锻旦冥蚰溴斓骟跤