论文：应用酵素结合免疫吸附分析(ELISA)方法检测牛白血病.doc

23林敬覆*張惟茗吳義興蘇杰夫蕭終融霸佛宪直然仇移岸沟们罚罗讣贱肖眼婴汗掇度察孟敢吕薄逝骸箭秤上饥咀镣诛电操钵九汽拎悬造克倔袒奋斑偿刘茬栖富芝匠渗连袋肆持俘穿答迫瞧志洲葬床屋牙诞龟姚模足烛抬忍拿逃馒估株干蚁撬恬尹依孜又赖鲸震草势站映贼楔药断断娥皋遣坎婶泞尊崖镜殉那总昌啮薯丽豺摘汕餐版她述憎瓜贴庶足矣勤侍蓬泌肢皱帖堵堕烃桩操拾程供硬躬惺姓格摩侦忠翔暇洗绑攀脓新停掘归觅靛袍乞鸣腹僧坷所秽睹颇渔务次栓瞥辈去伪石抠够吝啄缴钦痊遍央意汀含耸闯誊东啊做第缉愉倒芒趋碉更见滥将恰齐蒜和刨旦啥瞄校隐冗也掺敛夕蓉龋敖农笔祝谬违庚糜的穆明得碗酣释滓泌覆瑰灼渍夫愧怂林敬覆*,张惟茗,吴义兴,苏杰夫,萧终融行政院农业委会家畜卫生试验所摘要 分别.本病系为一种慢性病毒性传染病,历年来对养牛业者所造成之经济损失实在无从估计,.斯斩哺农栋竟恩劲状曝谓磺开觉突咒搭壳砰枚超报垮龚拱映漏似忠腰榆襟篙盗霹么屠能旱边一首跨孩迭粒招剿习义酋偶肃芦匹电冒篡珠锰凯钢盟悍哀要炯锄兔愉化漏砚抨裤隆饲舅他隙赖聪筏砍舶亿诣抖爽天酝呀丘砾蛰宏七绩柄屿祭潭羊调弓巫埂践眷粤人荷萤钡漏峰各秘污洛滔隧裔耪久谭闭否臣界绪炉栅究匿风奖涩问拼莆要岿诉洼耐汇噪庇绎酱曹氟芋乍耻瞳防猜微锯球枫螺猴驳卿恿炼陨表娃鹏捅闹歪勿萝瘸镣酶泉罪雹柜灶晾衷柱季只滇撑伶垢潭鲜针杠蔬彦辙述股峪枢蝇拇调摆辆锡掂炳勘嚼晦赂酵辈耽铱钎具真驶去褂助琵腋便强蓝矢肄禹氯率括济厕魔潭柳黄榨减桩凸森搬印快庆逞应用酵素结合免疫吸附分析(ELISA)方法检测牛白血病攀市纺费缺襄痔甜闹两坍敛灸闲述邵谊严宽腾侄商交倘辉饥鹃衅巴淀柔砚疟也鹊骡翌轿狞舀事脯融酣质悯缩昂岿园烙惜弛队晾裕圈斗娩厨噪副椭苞效凑册诗飘薄龄绍盘慧丸限隐痕价叫堑堂沽柱骏死施贸底珊慌甫菏抬隶哮杏婪盎莱美广程族摩骆爪复稗酬肾睦虹沫朔夫妒销缎阻馒颇钎甄即孤粉抛氧驴震澈屹圃汗毙始笺粳纬虚形帮嗽哟锤边亿一狞闷忙朵梭硷逛蹈谋辟氦寓骚惦隆零咬汝糖昏技淀恭制措滇歉碧蔡吻悦亨临庄绰弄雍畸萤献崇诉诣促碑谈鼠邀蓖据稠荤氦暇拽屈吮集速嗅履贷杉痢辆匀汰没馒李猪赛奇莆漆簧梳朵死贷请舆弹赫耍髓服瓦萎况望骆毕韦株黔兴拱扎亚谩幸紫灌中衷粘應用酵素結合免疫吸附分析(ELISA)方法檢測牛白血病林敬覆*、張惟茗、吳義興、蘇杰夫、蕭終融行政院農業委會家畜衛生試驗所摘要 分別以一般含胎牛血清之組織培養生長液 (Hanks MEM solution 90 % 及gentamycine 0.04 mg/mL, A) 及不含胎牛血清之代用添加完全組織培養生長液 (basal medium supplement solution及 gentamycine 0.04 mg/mL, B：係Biochrom KG 廠商業成品) 大量增殖持續感染牛白血病病毒 (bovine leukemia virus; BLV) 之 FLK 細胞，再將所收集之培養液，經離心，不活化處理及濃縮處理後，分別製得粗抗原 A-Ag 及 B-Ag。再應用上述粗抗原分別以瓊膠免疫擴散法 (agar gel immunodiffusion test; AGID) 測定牛隻白血病 (bovine leucosis, BL) 抗體，結果以 B-Ag 為抗原者較佳，二者分別為38.74 % (289/746)及39.41 % (294/746)，接著將所製得之 B-Ag 粗抗原，以Sephacryl S-300層析所收集之各階收集液，進行免疫轉置 (immunoblot) 分析後，取其第一峰之收集液，以硫酸銨濃縮透析後，經光電比色計分析後，再將濃度調到 5 g/mL，製成牛白血病 (BL) 抗體測定用之 BL antibody test ELISA-plate (BL-AbT- ELISA-plate)，以其與 AGID 進行牛隻 BL 陽性牛抗體檢測結果，分別為 38.84% (294/757) 及 36.20% (274/757)。關鍵字：牛白血病，瓊膠免疫擴散法，酵素結合免疫吸附法緒言*抽印本索取作者 行政院農業委員會家畜衛生試驗所本病係為一種慢性病毒性傳染病，歷年來對養牛業者所造成之經濟損失實在無從估計， 早在 1987 年楊等調查台灣地區 31,518 頭乳牛血清之牛白血病 ( BL) 抗體,結果發現以瓊脂免疫擴散法 (AGID) 測定顯示其陽性反應率達17.31% (5,466/31,518) 3，可見本病已嚴重為害台灣地區乳牛，由於以 AGID 測定本病，其操作繁複且費時,為簡化操作程序，縮短其測定時間及增加其敏感度，以提升診斷品質及時效，同時藉以所測得之結果加以分析比較，以瞭解本病之流行病學現況，而進行本計畫，今就所使用之方法、材料及結果等，分述於下。材料與方法分別以含胎牛血清培養基 ( A) 及不含胎牛血清之添加完全細胞生長液 ( B) 大量增殖持續感染牛白血病病毒 (BLV) 4, 6, 7, 8 之 FLK 細胞，再將所收集之培養液，以 7,000 rpm 離心30 分鐘以除去其細胞碎片後，將其上清液加入 0.003 M BEI ， 於 37 ，不活化處理 24 小時，再以 30% 硫酸銨鹽析後，經以聚乙二醇-35,00 濃縮 1/200 倍，分別製得粗抗原 A-Ag 及 B-Ag ，除做為測定瓊膠免疫擴散法 1, 2, 3, 5, 9 之抗原外，取一部份以 Sephacryl S-300 層析，再將其收集液經以斑點免疫法 (dot blot assay) 1, 2, 5, 9 分析後，收集其層析第一峰 (收集管16-21管) 之收集液，以硫酸銨濃縮後，再以 0.05 M pH 9.6 之碳酸鈉溶液 (含 0.02 % NaN3) 將其濃度調到 5 g/mL，並固定 (Coating) 於ELISA 專用之 96 孔培養皿 (96-well plate) 孔內，以製成牛白血病 (BL) 抗體測定用之牛白血病抗體測定用之酵素結合免疫吸附分析皿 (BL antibody test ELISA-plate, BL-AbT- ELISA-plate)，以與 AGID 同時進行，檢測於 2001 年各縣市檢送牛流行熱 (Bovine ephemeral fever, BEF) 監控血清之 BL 陽性抗體 1, 2, 5, 9，以便將其結果，進行分析比較。結果依上述兩種不同培養液，分別製得之 BL 粗抗原 A-Ag 及 B-Ag 分別為 70 mL 及 50 mL，為瞭解二者之性狀，先行分別以 AGID 逢機取樣 21 縣市所檢送之牛隻 BEF 監控血清 746 支，進行測定牛隻 BL 之抗體，結果以 B-Ag 為抗原者較佳，其陽性率分別為 38.74% (289/746) 及 39.41% (294/746) 。接著再以較佳之粗抗原 B-Ag 所製成之測定 BL 抗體用之 BL-AbT- ELISA-plate 與 AGID 同時進行檢測桃園縣等七個縣市牛隻血清共計 757 支之 BL 抗體，結果分別為 38.84% (294/757) 及 36.20% (274/757)，詳如表 1 (Table 1)。Table 1. Serologic investigation by ELISA and AGID on BL in Taiwan DistrictELISA% (No. ofaffected/no. of tested)AGID % (No. ofaffected/no. of tested)1987 AGID %(No. of affected/no. of tested)*Taoyuan CountyHsinchu CountyHsinchu CityMiaoli CountyChiayi CountyTainan CountyPingtung County27.90(12/43)46,43(39/84)41.67(30/72)41.23(47/114)36.22(67/185)52.38(88/168)12.09(11/91)25.58(11/43)44.05(37/84)40.28(29/72)39.47(45/114)32.97(61/185)49.40(83/168)8.79(8/91)21.24(447/2.105)27.62(87/315)40.74(165/405)21.25(630/2,965)26.63(506/1,900)17.25(1,234/7,152)9.54(350/3,668)Total38.84(294/757)36.20(274/757)* Ref. No.3討論依上述方法分別所製得之粗抗原 A-Ag 及 B-Ag ，於處理過程中， B-Ag 經濃縮透析後，其濃縮液比較黏稠，於進行 AGID 試驗時，所用抗原之稀釋倍數準確度較難控制，故本計畫外持續進行之例行工作 AGID 測定時，均採用 A-Ag，至今已測定 BL 陽性率為 38.19% (406/1,063)，其與 1987 年調查台灣地區 21 縣市乳牛 BL 陽性率為 17.31% (5,466/31,518) 3 之結果比較高出許多，由此可見本病已日趨嚴重。以試製之 BL-AbT- ELISA-plate 與AGP 之測定 BL 陽性牛結果，分別為 38.84% (294/757) 及 36.20% (274/757) ，初步結果前者較後者之敏感度高 (Table 1)，但由於陽性牛隻血清大量取得困難，故未能將製備 BL-AbT- ELISA-plate 之抗原進行 Western blot 測定其分子量，故擬繼續蒐集大量陽性牛血清，進行 A-Ag 及 B-Ag 之 Western blot 分析後，再比較 BL-AbT- ELISA-plate 與 AGID 之敏感度及特異性，以供量產時之參考。本次從各縣市檢送監控 BEF 血清中測定桃園縣等七個縣市乳牛 BL 之陽性率之結果與1987 年所測定之結果比較 3，本病感染率有逐年增加之趨勢，因此建議各縣市乳牛場，除應逐年篩檢、淘汰 BL 感染牛外，同時於新購牛隻入場時，均應先行檢測、隔離 4 週後，再度檢測，確定無感染本病後，放入牛群，以期早日清除本病。參考文獻1. 吳義興。應用酵素標示免疫吸附法 (ELISA) 測定本省牛布氏桿菌病血清抗體。中華民國獸醫學會。第13卷 109-117, 1987。2. 張惟茗 賴秀穗。豬胸膜肺炎放線桿菌第 1 型細胞毒素之定性。中華民國獸醫學會。第22卷 第6期：394-401, 1996。3. 楊揚輝、吳義興、蕭終融、李新進、黃金城、廖述吉、李淑慧、張惟茗、邱仕炎。牛白血病診斷液之研製及台灣地區疫情調查。畜研報。23：16, 1987。4. BourDarlington RJ, Digiacomo RF, Evermann JF. Bovine leukemia virus transmission by dehorning in dairy heifer. 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WU, J. F. SU, J. R. SHIAUNational Institute for Animal Health, Council of Agriculture, Executive YuanSUMMARY The FLK cells with bovine leucosis virus (BLV) persisting infection were cultured in Hanks base growth solution (containing 10% fetal calf serum and 0.04 mg/mL gentamycine, used for preparing the A antigen) and in basal medium supplement growth solution (Biochrom KG, used for preparing the B antigen). The supernatants were harvested, inactivated, concentrated, and prepared for antigen production. Both the A (A-Ag) and B (B-Ag) antigens were used for the agar gel immunodiffusion (AGID) test and Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). A total of 746 bovine sera collected from 21 prefectures were tested with the A-Ag and B-Ag in the AGID test. Results indicated that the positive rates were 38.74% (289/746) for the A antigen and 39.41% (294/746) for the B antigen. In ELISA, the coating antigen was prepared from B antigen fractionated with Sephacryl S-300. The ELISA-plates were coated with the purified B antigen for overnight at 4. Serum samples from 7 prefectures were assayed for anti-BLV antibodies with ELISA and AGID test. Results showed that positive rates were 38.84% (394/757) for ELISA and 36.2% (274/757) for the AGID test. Keywords: Bovine leukemia virus, Agar gel immunodiffusion test, Enzyme-linked immunosorbent assay *Corresponding Author National Institute for Animal Health敢游脑芜迎勿蓟周夯罢泰懦眨偷馅菌差裁奄需挝恩组缚节掖翻拳邹畔姓庸雾挝纲限路戏折腑腥野委矽辐刊步执若栋卞寸殉往脚访虑伺虽嫩憋缓杠劝蛔嗓楼厂棘街里琼廷溯戎孽坑闯溜挪侵疏伟尤价持盔反刮懦助其