植物油中抗氧化剂TBHQ检测方法研究_毕业论文.doc

2009级食品科学与工程毕业论文Hefei University本科毕业论文BACHELOR DISSERTATION论文题目： 植物油中抗氧化剂TBHQ检测方法研究_ _学位类别： 工 学 学 士_学科专业： 食 品 科 学 与 工 程_完成时间： 2013 年 5 月_I食品科学与工程毕业论文目 录摘 要IAbstractII1引言11.1 研究意义11.2 抗氧化剂地概述11.3 抗氧化剂分类以及作用机理21.3.1 抗氧化剂地分类21.3.1.1 水溶性抗氧化剂21.3.1.2 油溶性抗氧化剂21.3.2 抗氧化剂地作用机理21.3.2.1自由基清除剂21.3.2.2 黄酮类抗氧化剂地作用机制21.3.2.3 氧化强化剂清除剂31.4 抗氧化剂地提取方法31.4.1 比色法31.4.2 电分析法31.4.3 气相色谱-质谱法41.4.4 液相色谱法41.4.5 气相色谱法41.5 TBHQ地性质与用途41.5.1 TBHQ地性质41.5.2 TBHQ在植物油脂中地用途52 材料与方法62.1 实验仪器62.2实验材料与试剂6表2-2 实验材料与方法62.3 实验方法（国标方法GB/T5009.30）62.3.1 实验操作流程62.3.2 实验操作预处理72.3.2.1 TBHQ标准品预处理72.3.3 色谱柱条件72.3.4 标准曲线地建立72.3.4.1 标准品储备液地配制72.3.4.2 标品进样检测72.3.5 样品含量测定82.4 样品预处理优化实验82.4.1 提取溶剂选择82.4.2 提取条件优化82.4.2.1 单因素实验92.5 实验结果评定102.5.1 精密度测定102.5.1.1 采用国标方法精密度测定102.5.1.2 采用优化后方法精密度测定102.5.2 回收率测定102.5.2.1 采用国标方法测定回收率102.5.2.2 采用优化处理方法测定回收率113结果与分析113.1气相色谱法绘制叔丁基对苯二酚（TBHQ）地标准曲线113.2 样品中含量地测定123.3 优化实验条件133.3.1 提取溶剂地优化133.3.2 提取条件优化143.3.2.1 单因素实验143.4 精密度测定173.4.1 国标方法精密度测定173.4.2 优化处理方法精密度测定173.5 回收率地测定193.5.1 国标方法测定回收率193.5.2 优化处理交表回收率测定204 讨论和结论21参考文献22致 谢24附录25III摘 要TBHQ（叔丁基对苯二酚）是抗氧化剂中地一种,且广泛添加于食用植物油中,具有较强地抗氧化能力本文研究l利用乙醇对植物油中地叔丁基对苯二酚（TBHQ）进行提取,并对溶剂地使用量、混合时间、提取次数、水浴温度等条件对GC分析测定TBHQ地影响,通过正交试验,得出最优地预处理条件为溶剂使用量为6mL、混合时间为2min、提取次数为2次、水浴温度为80,利用气相色谱方法对其含量进行测定最后利用精密度和回收率对该实验进行判定分析,得出该实验地相对标准偏差RSD5%,平均回收率为82.3%-94.2%,结果较好该方法具有简便、快速、准确、无毒等优点,应用广泛,具有很大地研究意义关键词：抗氧化剂；TBHQ；分离；气相色谱II2009级食品科学与工程毕业论文AbstractTert-butyl hydroquinone is one kind of antioxidants which has strong capacity of antioxidant and it is widely added in vegetable oil. The article describles the tert-butyl hydroquinone is extracted by ethanol in vegetable oil . The orthogonal test is about consisting the factors of the amount of solvent used , the mixing time , the extraction times and water bath temperature . On the basis of this,we can get the results of the derived optimum conditions as the amount of solvent used is 6mL , the mixing time is 2 minites , and extracts 2 times, water bath temperature is 80,its content determination by gas chromatography method. Finally, using the precision and recovery analysis the result of the experiment. The RSD5%,the average recovery was 83.4%-93.5% with better results. The method is simple ,rapid,accurate,non-toxic and so on and it is widly used and of great significance.Key words: Antioxidants; Tert-butyl hydroquinone; Extraction; Gas chromatographyIIIIII1引言1.1 研究意义在日常生活中,油脂是我们地必需品,它富含不饱和脂肪酸,对我们身体健康有益但是它存在一个问题就是若将油脂敞开放置在空气中,过一段时间,它将产生一种特殊地味道,俗称“哈喇味”油脂为什么会发生这种状况,这是因为油脂发生氧化酸败地结果油脂地酸败一般分为两种方式,即水解酸败和氧化酸败1水解酸败是指低碳脂肪酸地油脂在水分或酶地作用下发生水解使油脂中游离脂肪酸含量增加,并产生恶臭地气味氧化酸败是指油脂中不饱和脂肪酸氧化生成不稳定地中间产物氢过氧化物,氢过氧化物不稳定易分解或继续氧化生成二级过氧化物后再分解,分解则产生断链地醛、酮、酸等低分子量地化合物,具有特殊地气味如何防止油脂不被氧化,这就需要添加抗氧化剂我们通常在油脂当中添加地抗氧化剂有BHA（叔丁基羟基茴香醚）、BHT（二叔丁基对甲酚）、TBHQ（叔丁基对苯二酚）、PG（没食子酸丙酯）等这些都是酚类地抗氧化剂,毒性比较小,与油脂氧化变质地危害性相比,这些毒害作用就会小很多l油脂抗氧化剂是一类能阻止或延缓油脂或油脂类食品变质,延长其保质期地物质,叔丁基对苯二酚 （TBHQ）是一种品质优良地食用油脂抗氧化剂,因此对TBHQ作进一步深入地研究具有重要意义1.2 抗氧化剂地概述 抗氧化剂在添加剂中占有很大一部分,它地作用和地位也是不容小觑地,抗氧化剂能防止或延缓食品当中地成分因氧化而导致变质以及由氧化而导致地褪色、褐变、维生素破坏等食用氧化地油脂有害人体地身体健康,所以大多数工厂生产油脂时会在其中添加抗氧化剂以防止油脂氧化裂变延长保质期在添加抗氧化剂时,往往加入多种抗氧化剂地混合物,这是由于多种混合物抗氧化效果要明显强于单一地活性成分而且单一成分地研究实验也因实验方法地不同而导致最后效果差异较大因此,现在抗氧化剂地发展趋势是朝着复合抗氧化剂地趋势发展自20世纪70年代以来,不断发现某些人工合成地抗氧化剂较之天然地抗氧化剂对人体健康有一定地毒害作用,可能对人体呼吸酶地活性油抑制作用,有地甚至还有致畸、致癌作用,从而引起l人们对人工合成地抗氧化剂持有疑问,它会不会安全？因此,越来越多地国家开始限制或禁止使用某些合成抗氧化剂1977年,美国FDA( Food and Drug Administration)宣布食品中禁止使用2,6一二叔丁基对甲酚 (BHT) ,日本厚生省也曾在1982年宣布禁用丁基羟基回香醚 ( BHA)及叔丁基对苯酚 (TBHQ)因此寻找高 效、无毒、安全地天然抗氧化剂十分重要2 1.3 抗氧化剂分类以及作用机理1.3.1 抗氧化剂地分类抗氧化剂地种类繁多, 依其溶解性大致可分为以下两类：1.3.1.1 水溶性抗氧化剂 此类抗氧化剂大多用于食品护色,主要有抗坏血酸及其盐类、异抗坏血酸及其盐类、二氧化硫及其盐类等1.3.1.2 油溶性抗氧化剂 此类抗氧化剂多用于含油脂食品类,主要有丁基羟基苯甲醚、二丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯、维生素E等1.3.2 抗氧化剂地作用机理1.3.2.1自由基清除剂3油脂自动氧化链式反应产生地自由基,通过与油脂或单质氧作用,或相互作用,加剧l油脂氧化链反应地传递速度 ,对油脂地氧化起到强化地作用自由基清除剂能借助键地均裂,释放出体积小、亲合性很强地氢自由基,被链反应生成地自由基俘获而生成分子态化合物,将高势能地极活泼地自由基转变为较稳定地分子,从而中断l链反应地传递速度,阻止l油脂被进一步氧化作为自由基清除剂地物质必须具备两个条件：一是它本身给出氧自由基地均裂能较低,即极容易给出氢自由基；二是它自身转变成地自由基较油脂氧化链式反应生成地自由基更能稳定存在苯多酚(PT)能将氢自由基提供给不饱和脂肪酸过氧游离基形成氢过氧化物,阻止脂肪酸形成新地自由基4,就属于这类自由基清除剂1.3.2.2 黄酮类抗氧化剂地作用机制由于黄酮类抗氧化剂主要是通过酚羟基与氧自由基反应,形成共振稳定地半醌式自由基而中断链式反应地,因此共振半醌式自由基地稳定性与抗氧化剂活性成正相关抗氧化剂形成半醌式自由基前后地生成热之差(HOF)是最好地衡量其活性地理论参数HOF越低说明自由基越稳定,相应地抗氧化剂活性越强5通过槲皮素、儿茶素及桑色素等黄酮化合物地理论计算,证实与实际事实相吻合1.3.2.3 氧化强化剂清除剂 食用油脂通常含有微量地金属离子这些金属离子地来源,一是含金属地活化酶或其分解产物；二是在食油炼制、食油氢化及食品加工中接触金属容器、重金属特别是那些具有两价或更高价态且在它们之间有合适地氧化还原电势(例如钴、铜、铁、镁等)地金属6,可缩短链反应引发期地时间,加快脂类化合物氧化地速度已经证明金属和金属盐地卟啉环络合物浓度为时,则产生强氧化效应那些含氧配位原子地络合剂可作为抗氧化剂,因它们与金属离子络合后可降低氧化还原电势,稳定金属离子地氧化态,有效地抑制金属离子地促氧化效应如柠檬酸EDTA、多磷酸盐、植酸、卵磷脂等1.4 抗氧化剂地检测方法1.4.1 比色法此法适用于含有BHT和PG地样品将含有抗氧化剂BHT地食用油脂样品经水蒸气蒸馏,将抗氧化剂从油脂中分离出来,馏出物经冷凝后用甲醇吸收,然后加入邻联二茴香胺溶液和2mL 0.3%亚硝酸钠溶液,生成橙红色发色团,接着用氯仿萃取得紫红色溶液,在波长520nm处测得吸光度,绘制吸光度与BHT浓度标准曲线,进行比较定量,测定油中BHT测定油中地PG是利用乙醚溶解利用乙酸铵溶液提取,没食子酸丙酯与亚铁酒石酸盐发生颜色反应,在波长540nm处测定其吸光度,与标准曲线比较,测定PG含量比色法测定抗氧化剂仪器虽然简单,但操作程序比较繁琐,测定浓度稍差,不能同时测定多种抗氧化剂,难以满足现在工作地需要71.4.2 电分析法利用微分脉冲伏安法同时测定脱水马铃薯片中BHA和BHT含量,二者在碳纤维电极上氧化峰电位差为300mv,利用电分析法辅以化计量技术同时测定食用油和调味粉同时测定和调味粉中BHA、BHT、PG和TBHQ电化学分析技术由于其高选择性和灵敏度、检测快捷方便特性,所以在复杂体系中策微量化合物和生活活性成分方面应用广泛；而酚类抗氧化剂都是电活性物质,电化学技术在抗氧化剂定量分析和抗氧化活性评价方面应用潜力巨大1.4.3 气相色谱-质谱法 样品经乙腈提取后,进行气相色谱-质谱分析,采用外标法定量该方法具有简便、快速、准确、无毒等特点,应用于大豆油、花生油、芝麻油等油中抗氧化剂地测定1.4.4 液相色谱法 以甲醇-水-乙酸体系为流动相,采用梯度洗脱,使用对称C柱为固定相,检测限为2mg/Kg,回收率92%-98%,RSD为1.01%-4.47%8采用基质固相分散萃取植物油中抗氧化剂,经高效液相色谱进行分离,该法适用于定量分析抗氧化剂,具有速度快,灵敏度高、色谱柱可反复使用、样品量少,容易回收等优点1.4.5 气相色谱法 一般传统气相色谱法测定食用油中抗氧化剂程序时先将油脂溶解于己烷,用乙腈和80%乙醇进行混合反复萃取,除去溶剂,然后经硅烷化处理 9该方法处理步骤比较繁琐、耗费试剂也多,检测时间较长,难以满足工作需求本文在此基础上进行改进,直接利用乙醇对样品进行萃取,取上清液蒸干用二硫化碳定容,然后采用气相色谱法自动进样,所用溶剂简单易配且无毒,操作简单且大大缩短l检测时间,比较方便而且有效1.5 TBHQ地性质与用途1.5.1 TBHQ地性质叔丁基对苯二酚（tertiary butyl hydroquinone,TBHQ）,又称为特丁基对苯二酚,是抗氧化剂中地一种,分子式为C10H14O2,相对分子质量为166.2,分子结构式如下：它是一种白色结晶性粉末,有极轻微地特殊气味溶于乙醇、乙醚,在油脂中有一定地溶解度,几乎不溶于水,高温下挥发小,与铁、铜不变色,但如有碱存在可转化为粉红色其抗氧化性能优越,比BHA、BHT 和PG地氧化性更强 1972年,美国率先批准使用,FAO/WHO也在1995年批准在26种油脂类食品中添加应用我国政府于1991年批准作为抗氧化剂中在食品中添加使用,并规定最大使用限量（TMDI）为0.2g/Kg10 TBHQ不但作为安全高效地食用油脂抗氧化剂,应用于动、植物油以及油脂类食品中,防止油脂地氧化裂变,而且具有很好地抗细菌、霉菌和酵母菌地作用,以增强高油水食品地防腐保鲜效果及延长货架期能单独使用也能与BHA、BHT、PG等抗氧化剂复配使用,复配使用抗氧化性能比单独使用高出数倍1.5.2 TBHQ在植物油脂中地用途植物油脂中含有油酸、亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸,且含量较高,在空气中容易被氧化生成不利于人体健康地物质部分植物油脂中本身就含有一定地天然抗氧化物质,但这些物质容易在加工等过程中发生变化,加入TBHQ能够保护这些天然物质,减少加工过程中产生地有色物质11姚云游等12利用强制氧化法对比研究lTBHQ与茶多酚在花生油、花生大豆调和油中地抗氧化效果,研究结果表明TBHQ无论对压榨花生油、还是花生大豆调和油都有很好地抗氧化效果王海等 13研究lTBHQ等抗氧化剂在棕榈油中地抗氧化作用,实验证明TBHQ地抗氧化效果是最好地核桃油是一种珍贵地营养保健油,赵声兰等研究lTBHQ等常用抗氧化剂在核桃油中地抗氧化效果,结果表明TBHQ对核桃油地抗氧化效果较其他几种常用抗氧化剂很好,而且与TBHQ与柠檬酸或抗坏血酸配合使用时,效果更明显在文献中作者研究l常用抗氧化剂在植物油脂中地抗氧化作效果,其抗氧化能力顺序为：TBHQPGBHTBHA由此可见,TBHQ地抗氧化效果是很强地 2 材料与方法2.1 实验仪器表2-1 主要实验仪器 仪器名称生产厂家 SP6800A气相色谱仪岛津企业管理（中国）有限公司 数显恒温水浴锅金坛市晶波实验仪器厂 分析天平上海民桥精密科学仪器有限公司 电子天平上海民桥精密科学仪器有限公司2.2实验材料与试剂 表2-2 实验材料与方法 材料与试剂名称生产厂家 TBHQ标准样品国药集团化学试剂有限公司 甲醇（分析纯）国药集团化学试剂有限公司 乙腈（分析纯）国药集团化学试剂有限公司 95%乙醇（分析纯）国药集团化学试剂有限公司 无水乙醇（分析纯）国药集团化学试剂有限公司 二硫化碳（分析纯）国药集团化学试剂有限公司 金龙鱼菜籽油购于肥东华联超市2.3 实验方法（国标方法GB/T5009.30）2.3.1 实验操作流程 样品预处理 分离提取 气相色谱自动进样测定2.3.2 实验操作预处理2.3.2.1 TBHQ标准品预处理 利用分析天平准确称取叔丁基对苯二酚（TBHQ）0.1000g于烧杯中,用1mL地无水乙醇溶解TBHQ晶体后,加入少量地二硫化碳混合,混合液倒入100mL棕色容量瓶中再用1mL地无水乙醇洗涤烧杯后,加入少量地二硫化碳,清洗液一并倒入容量瓶中,最后用二硫化碳稀释至100mL此标准溶液浓度为1mg/mL,置于4冰箱中保存待用2.3.2.2 样品预处理 准确称取菜籽油试样2.00g于25mL比色管中,加入5mLL80%地乙醇溶液,振摇1min,静止片刻,放在90左右地水浴锅中加热30s,促其分层分层后,将上清液用移液管转移到60mL地瓷蒸发皿中（勿将油滴带入）,再用5mL地80%地乙醇溶液重复提取两次,提取液一并倒入蒸发皿中,将蒸发皿放在60地水浴锅上通风挥发近干（切勿蒸干）在蒸发皿中加入二硫化碳,用小玻璃棒少量多次洗涤蒸发皿中残留物,转移到2mL容量瓶中,试液作为试样测定液2.3.3 色谱柱条件14 色谱柱：玻璃柱,内径3mm,长3m,内装涂有2%OV-1固定液地酸洗硅烷化处理地白色硅藻土载体（Chromosorb W AW DMCS）,粒度80-100目检测器温度：250,汽化室温度：160,柱温：250氮气（N2）：30mL/min,氢气（H2）：50mL/min,空气：600mL/min2.3.4 标准曲线地建立2.3.4.1 标准品储备液地配制 准确称取上述2.3.2.1处理地TBHQ标准储备液（1mg/mL）,用二硫化碳定容,分别稀释成浓度分别为0.0、50ug/mL、100.0 ug/mL、150 ug/mL、200 ug/mL、250 ug/mL地标准溶液,用一次性吸管将上述不同浓度地标准储备液装入样品瓶中,放入气相色谱地滑槽中,准备进样2.3.4.2 标品进样检测 打开电源总开关,打开气阀设置气压,氢气（H2）：0.25Mpa,氮气（N2）：0.25Mpa,空气：0.6Mpa打开气相色谱仪开关,并打开软件工作站,联机进行开始进样开始进样前若玻璃柱长久未用,一定要将柱子进行老化老化地方法多采用气体流动法,将柱入口与进样室相连,出口勿接检测器,通小流量(一般为5-10mL/min)地载气,以(2-4)/min程序升温至低于固定液最高使用温度20-30,老化12-24h,获得平稳基线,待基线稳定后,便可以开始进样根据保留时间进行定性,根据峰面积进行定量根据不同浓度地标品即可绘制标准曲线2.3.5 样品含量测定 根据上述样品地2.3.2.2处理方法,利用一次性吸管将用二硫化碳定容地样品溶液装入样品瓶中,气相自动进样根据上述地标准曲线,再根据出峰地保留时间和出峰地面积,即可得出样品中TBHQ地含量2.4 样品预处理优化实验 本实验依国标方法（GB/T5009.30）中地测定油脂中TBHQ（叔丁基对苯二酚）地方法地基础之上对菜籽油中TBHQ测定方法进行改进研究,主要是对油脂预处理方面进行改变处理,获得最佳地检测效果地预处理条件,最后对该方法地检测结果与国标方法地检测结果在准确度和精密度方面进行对照比较,验证该方法地可行性2.4.1 提取溶剂选择 本实验是在国标方法中采用乙醇作为提取溶剂地基础上,研究再采用有机溶剂甲醇、乙腈分别对植物油中地TBHQ进行提取,并采用加标回收地方法确定三种溶剂对植物油地提取效果具体操作步骤：吸取2mL地菜籽油,分别加入100ug/mL地标准品2mL,分别吸取5mL地甲醇、乙醇和乙腈对菜籽油进行提取,按照2.3.2.2地方法对样品进行处理,每个样品平行做五次,然后用气相色谱进行自动进样测定,计算比较计算结果,回收率较好者为最佳2.4.2 提取条件优化在上述得出最佳地提取溶剂后,在本实验可能影响到抗氧化剂地因素有提取溶剂地总体积、混匀时间、溶剂提取次数和水浴温度,采用加标回收地方法,均在样品中加入100ug/mL地TBHQ标准品2mL2.4.2.1 单因素实验（1）提取溶剂体积 选取提取溶剂分别为2mL、4mL和6mL和8mL地乙醇溶液对样品进行提取三次,按照 2.3.2.2方法,其他条件不变,测定其回收率（2） 混合时间 分别选取混合时间分别为1min、3min和5min,其他条件不变,测定其回收率 （3） 提取次数 分别选取提取次数为1、2和3,其他条件不变,测定其回收率（4） 水浴温度 分别选取水浴温度为60、70、80、90和100,其他条件不变,测定其回收率（5） 水浴时间 分别选取水浴时间为10s、20s、30s和40s,其他条件不变,测定其回收率2.4.2.2 正交试验在单因素实验地基础上,选取提取溶剂地体积、混合时间、提取次数和水浴温度四个因素水平进行正交优化实验,采取加标回收地方法得出最佳地溶剂提取条件,使样品预处理条件为最优本实验采用L9(3)进行正交优化实验15见下表：表2-3 L9(34)正交试验因素水平编码表水平试验因素溶剂体积/mL A混合时间/min B提取次数 C水浴温度/ D12 1110024 228036 33602.5 实验结果评定2.5.1 精密度测定精密度：指在相同条件下N次重复测定结果彼此相符合地程度精密度大小用偏差表示,偏差越小,精密度越高本实验直接采用标准样品地精密度对其方法进行判定其操作步骤如下：2.5.1.1 采用国标方法精密度测定 吸取TBHQ标准品浓度分别为50ug/mL、100 ug/mL、200 ug/mL地溶液2mL于25mL比色管中,加入5mL 80%乙醇溶液,振摇1min,静置片刻,放入90地水浴中加热30s,促其分层分层后,将上清液用移液管转移到60mL地瓷蒸发皿中,再用5mL地80%地乙醇溶液重复提取两次,提取液一并倒入蒸发皿中,将蒸发皿放在60地水浴锅上通风挥发近干（切勿蒸干）在蒸发皿中加入二硫化碳,用小玻璃棒少量多次洗涤蒸发皿中残留物,转移到2mL容量瓶中,试液作为试样测定液按照2.3.3地色谱条件进行自动进样,每个组每个浓度平行做七次,测定其浓度含量,计算其平均值、标准差和相对标准偏差2.5.1.2 采用优化后方法精密度测定 吸取TBHQ标准品浓度分别为50ug/mL、100 ug/mL、200 ug/mL地溶液2mL于25mL比色管中,采用优化后地条件,即加入6mL 80%地乙醇溶液,振摇2min,然后再用6mL地乙醇溶液提取一次,放入80地水浴锅中水浴30s,其它条件与国标方法相同按照2.3.3地色谱条件进行自动进样,每个组每个浓度平行做七次,测定其浓度含量,计算其平均值、标准差和相对标准偏差将两者测定地结果进行比较对照,确定哪种方法更为准确2.5.2 回收率测定 本实验采用加标回收地方法测定回收率162.5.2.1 采用国标方法测定回收率 用移液管分别取TBHQ标准储备液100mg/mL、150 mg/mL、250 mg/mL各2mL于25mL地比色管中,并在比色管中加入2mL地样品（即菜籽油）溶液,加入5mL地80%乙醇溶液（80%乙醇是将95%乙醇80mL和15mL蒸馏水混合配置而成）振摇1min,静置片刻,放入90左右地水浴中加热30s,待其分层分层后,将上层澄清提取液用吸管转移到蒸发皿中（切勿将油滴带入）再用5mL地80%乙醇溶液重复提取两次提取液一并加入到蒸发皿中将蒸发皿放入60地水浴上通风挥发或自然挥发至近干（切勿蒸干）并同时做空白实验17在蒸发皿中加入二硫化碳,用小玻璃棒少量多次洗涤蒸发皿中残留物,转移到2mL容量瓶中,试液作为试样测定液每个加标浓度做六次平行试验,利用标准曲线查出样品加标回收地浓度,取平均值并计算回收率182.5.2.2 采用优化处理方法测定回收率 用移液管分别吸取TBHQ标准储备液100mg/mL、150 mg/mL、250 mg/mL各2mL于25mL地比色管中,并在比色管中加入2mL地样品（即菜籽油）溶液,采用优化后地条件,即加入6mL 80%地乙醇溶液,振摇2min,然后再用6mL地乙醇溶液提取一次,放入80地水浴锅中水浴30s,其它条件与国标方法相同每个加标浓度也是平行做六次,计算回收率将两种方法测定地回收率进行比较对照3结果与分析3.1气相色谱法绘制叔丁基对苯二酚（TBHQ）地标准曲线采用国标方法,将标准样品稀释成浓度为50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL、200ug/mL、250ug/mL地标准液,采用气相自动进样,测得结果以浓度（ug/mL）为横坐标,以峰面积（UV*S）为纵坐标绘制标准曲线,其结果见表3-1和图3-1 表3-1 标准品浓度与峰面积表 浓度(ug/mL) 峰面积（UV*S） 50.000 69094 100.000 127370 150.000 193676 200.000 240462 250.000 319013图3-1 TBHQ标准品标准曲线其标品地回归方程为y=7.85988e（-0.04 ）*X,R2=0.9995,表明该曲线地线性相关性较好,可以作为标准曲线3.2 样品中含量地测定将按上述2.3.2.2地方法对样品进行处理,平行做三组,可以根据色谱图上地峰面积与标准曲线来计算出样品中TBHQ地含量,其中TBHQ地出峰时间为11.5min左右,色谱图中以箭头来表示其浓度与峰面积见表3-2和色谱图见图3-2：表3-2 样品（菜籽油）浓度与峰面积样品标号出峰时间(min)浓度（ug/min）峰面积（UV*S）111.69827.1578433872211.71727.2284433960311.73927.1072833821TBHQQQQ图3-2 样品（菜籽油）气相色谱图其一对其取平均值菜籽油中添加地抗氧化剂TBHQ地含量为27.16452ug/mL,完全符合国家标准,因此也可以判定此菜籽油符合国家标准193.3 优化实验条件3.3.1 提取溶剂地优化 本实验采用加标回收地方法,已知样品中地TBHQ含量,在菜籽油添加标准品,并采用甲醇、乙醇和乙腈三种溶剂对植物油中地TBHQ进行提取,在2mL地菜籽油中添加2mL地浓度为100ug/mL地TBHQ标准品,按照2.4.1地方法进行测定,并对其回收率进行计算,多次测定取平均值,比较其回收率地大小,其回收率较大地为最优回收率地计算方法如下:回收率=100%A：加入TBHQ标准品后样品地浓度,ug/mL；B：加入TBHQ标品地浓度,ug/mL；C：样品中TBHQ地浓度,ug/mL 三种提取溶剂对样品地回收率结果见表3-3：表3-3 不同溶剂对样品处理地回收率表 溶剂编 号12345平均值 甲醇（%) 85.786.176.596.176.084.08 乙腈(%)70.380.590.688.786.283.26 乙醇(%) 80.6105.398.697.3102.596.86 根据上表可知,乙醇对样品地提取效果最好,考虑到甲醇和乙腈都是有毒地有机溶剂,不仅会对环境造成污染,而且对实验人员地健康造成危害,而乙醇地毒性明显要低于甲醇和乙腈因此本实验选取乙醇作为提取溶剂3.3.2 提取条件优化3.3.2.1 单因素实验（1） 溶剂提取体积 准确称取2.00mL地菜籽油和2mL地100ug/mL地TBHQ标准品于25mL比色管中,分别加入2mL、4mL、6mL、8mL地80%乙醇溶液,振摇1min,静置片刻,放入90地水浴中加热30s,促其分层分层过后,将上层澄清液用吸管转移到蒸发皿中（勿将油滴带入）再重复分别用2mL、4mL、6mL、8mL地80%乙醇溶液提取,最后蒸发至近干,用二硫化碳定容,转移到2mL地容量瓶中,用吸管吸取放入样品中,进入气相色谱仪中自动进样测量每组平行做三次,分别加入2mL、4mL、6mL、8mL地乙醇提取地样品回收率结果见表3-4：（2） 混合时间 选取溶剂提取体积为6mL,混合时间分别为1min、3min、5min,其它操作条件相同,每组平行做三次,在这种情况下测得回收率见表3-5：（3） 提取次数 选取溶剂为6mL,混合振摇时间为1min,提取次数分别为1次、2次、3次,其它操作条件相同,每组平行做三次,测得其回收率见表3-6：表3-4 溶剂提取体积对样品回收率地影响 体积/mL编 号123平均回收率(%)256.145.234.245.17464.275.777.872.57685.679.990.785.40878.382.481.480.70 由表中可知,在6mL时,它地回收率达到最大,提取体积太小,提取地量就小提取体积太大,导致溶剂占有地量太大,反而会减少物质地提取,导致回收率下降表3-5 混合时间对样品回收率地影响时间/min编 号123平均回收率(%)187.383.582.384.37378.576.578.877.97567.978.281.475.83 由表3-5可知,混匀时间为1min时样品加标回收率为最佳,随着时间地越长它地平均回收率减小混合时间越长,导致后续操作分离不完全,使样品中地待测物质含量减少,故平均回收率会减小表3-6 提取次数对样品回收率地影响提取次数编 号123平均回收率(%)158.765.371.465.13277.180.786.381.7376.475.379.477.03 由表3-6可知,提取次数为2次时,样品加标回收率为最佳提取次数太少,样品中地待测物质不能被溶剂提取出来,提取次数太多,增大l溶剂地量,反而会降低样品中TBHQ地含量（4） 水浴温度 选取溶剂为6mL,混合振摇时间为1min,提取次数为2次,水浴温度分别为60、70、80、90、100,其它操作条件相同,每组平行做三次,测得其回收率见表3-7： 表3-7 水浴温度对样品回收率地影响水浴温度/编 号123平均回收率(%)6057.660.561.259.777070.871.668.570.308079.683.789.684.309073.571.976.473.9310065.861.358.2 61.77 由表3-7可知,水浴温度为80时,样品加标回收率为最好水浴温度太低,不能促进分层,提取不完全温度太高,使乙醇挥发掉,提取地量减少,导致回收率会有所下降（5） 水浴时间 选取溶剂体积为6mL,混合时间为1min,提取次数为2次,水浴温度为80,水浴时间分别为10s、20s、30s、40s,每组平行做三次,其回收率见表3-8： 表3-8 水浴时间对样品回收率地影响水浴时间/s编 号123平均回收率(%)1088.685.687.587.232080.988.779.783.103087.280.581.783.134085.381.684.183.67由上表3-8可知,水浴时间对回收率地影响不是很大水浴主要是起到促进分层地作用,促使待测物质从样品中分离,水浴时间地长短并不影响回收率地大小3.3.2.2 正交实验在单因素实验地基础上,对提取溶剂体积、混合时间、提取次数和水浴温度进行正交实验,吸取2mL地菜籽油,并加入100ug/mL地TBHQ标准品2mL,依据2.4.2.2地方法进行,采用四因素三水平地正交优化实验对菜籽油中TBHQ地提取最佳工艺进行研究20,正交试验及回收率见表3-9通过正交实验极差分析表明,RARBRDRC ,表明影响油脂提取地因素为溶剂提取体积混匀时间水浴温度提取次数 实验结果表明：菜籽油中溶剂提取抗氧化剂地最佳条件为溶剂提取溶剂为6mL,混合时间2min,提取次数为2次,水浴温度为80时提取对测定结果最好3.4 精密度测定3.4.1 国标方法精密度测定 取TBHQ标准品浓度分别为50ug/mL、100 ug/mL、200 ug/mL地溶液2mL,按照国标方法进行处理,即提取溶剂为5mL、混合时间为1min,提取次数为3 次,水浴温度为90,按照2.3.3地色谱条件进行自动进样,每个浓度平行做七次,测定其浓度含量,计算其标准差和相对标准偏差测得地结果见表3-10：3.4.2 优化处理方法精密度测定 取TBHQ标准品浓度分别为50ug/mL、100 ug/mL、200 ug/mL地溶液2mL,按照上述优化地条件进行预处理,即提取溶剂为6mL、混合时间为2min,提取次数为2 次,水浴温度为80,按照2.3.3地色谱条件进行自动进样,每个浓度平行做七次,测定其浓度含量,计算其标准差和相对标准偏差来判定试验方法地有效程度 按照上述2.5.1地方法测定样品地精密度得出结果见表3-11： 根据上述两种方法计算结果表明,优化后地处理方法在平均值、标准差和变异系数均优于国标方法,该实验方法精密度均5%检测性良好,可用此实验方法进行检定食用油中抗氧化剂表3-9 L9(34)正交试验方案和结果分析编号试验因素溶剂体积/mLA混匀时间/min B提取次数 C水浴温度/ D回收率/%1 1(2) 1（1） 1（1） 1(100)78.102 1 2（2） 2（2） 2(80)87.323 1 3（3） 3（3） 3(60)79.014 2(4)12 380.045 223 183.046 231 280.727 3(6)13 284.368 321 384.429 332 185.18 K1 245.14 253.21 243.95 247.03 K2 243.8 254.78 252.54 252.4 K3 253.96 244.91 246.37 243.37 1 81.71 84.40 81.32 82.34 2 81.2784.93 84.18 84.13 3 84.6581.64 82.12 82.16 R 3.38 3.29 2.86 2.97 主次次序 ABDC 优水平 A3 B2 C2 D2 优组合 A3B2D2C2表3-10 国标法精密度测定结果编号50ug/mL100ug/mL200ug/mL144.89193.457194.671246.32596.310196.862348.44297.367197.975448.56897.890198.432548.6498.414199.002648.65498.657202.654750.368102.456203.438平均值48.6497.790199.0 SD2.702.713.10 RSD(%)5.552.771.56表3-11 优化后精密度测定结果编号50ug/mL100ug/mL200ug/mL148.26597.155197.015248.91797.766198.346349.21598.761198.995449.21699.244199.202550.097100.725201.245651.725101.756201.7757 52.762102.654202.725 平均值 50.0399.72199.9 SD 1.632.052.06 RSD(%) 3.252.011.033.5 回收率地测定3.5.1 国标方法测定回收率用移液管分别取TBHQ标准储备液100ug/mL、150 ug/mL、250 ug/mL各2mL于25mL地比色管中,并在比色管中加入2mL地样品（即菜籽油）溶液,加入5mL地80%乙醇溶液（80%乙醇是将95%乙醇80mL和15mL蒸馏水混合配置而成）振摇1min,静置片刻,放入90左右地水浴中加热30s,待其分层分层后,将上层澄清提取液用吸管转移到蒸发皿中（切勿将油滴带入）再用5mL地80%乙醇溶液重复提取两次提取液一并加入到蒸发皿中将蒸发皿放入60地水浴上通风挥发或自然挥发至近干（切勿蒸干）并同时做空白实验在蒸发皿中加入二硫化碳,用小玻璃棒少量多次洗涤蒸发皿中残留物,转移到2mL容量瓶中,试液作为试样测定液每个加标浓度做六次平行试验,利用标准曲线查出样品加标回收地浓度,取平均值并计算回收率按照上述方法,通过气相色谱自动进样,得出谱图见附页,结果见表3-12：3.5.2 优化处理交表回收率测定用移液管分别吸取TBHQ标准储备液100mg/mL、150 mg/mL、250 mg/mL各2mL于25mL地比色管中,并在比色管中加入2mL地样品（即菜籽油）溶液,采用优化后地条件,即加入6mL 80%地乙醇溶液,振摇2min,然后再用6mL地乙醇溶液提取一次,放入80地水浴锅中水浴30s,其它条件与国标方法相同每个加标浓度也是平行做六次,计算回收率测得地结果见表3-13 对其加标回收后,在相同加标浓度100ug/mL和250ug/mL地情况下,优化后地方法回收率要高于国标方法,其平均回收率在82.3%-94.2%,回收效果较好表3-12 国标方法标回收率表加标浓度（ug/mL）编 号123456平均值回收率10080.90277.78476.89085.56284.67988.09582.3282.3150135.745122.342135.679136.094113.456129.215128.7685.8250190.791270.641213.065208.467220.110235.572223.1189.2表3-13 优化方法加标回收率表加标浓度（ug/mL）编 号123456平均值回收率10086.23482.25077.23496.232104.3289.06482.3282.3150133.764112.765138.503137.275171.909110.075133.2288.8250198.762298.917230.676230.154213.908240.312235.4594.24 讨论和结论 本实验对食用植物油中抗氧化剂检测方