《现代免疫学技术》doc版.doc

第十四章 现代免疫学技术第一节 免疫微粒技术免疫微粒技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的固相微粒作为载体，包被上具有特异性亲和力的各种免疫活件物质(抗原或抗体)，使其致敏为免疫微粒，用于免疫学及其他生物学检测与分离的一项技术，作为载体的微粒通常是以某种高分子有机单体为原料，经过乳液聚合、悬浮聚合及辐照聚合等高分子聚合方法制备而成。由于制备材料及工艺不同，微粒的种类繁多，现已制成惰性微粒如聚苯乙烯胶乳微粒、活性微粒如羧化聚苯乙烯微粒、磁性微粒及标记微粒(用同位素、荧光素或酶标记)等四大类微粒，数量多达几十种。将制备好的微粒与抗原(或抗体)经物理吸附、化学偶联及生物素亲合亲桥联法等方法形成免疫微粒。广泛应用于各种可溶性大分子物质的检测、分离与纯化、细胞标记与识别等。近年来，微粒技术在核酸分子杂交、DNA与RNA的分离及PCR等研究领域亦显示出广阔的应用前景。一、 胶乳微粒免疫检测技术胶乳微粒免疫检测技术是在胶乳凝集定性试验基础上发展建立的种非放射性均相免疫测定法，可以对各种微量的抗原物质和小分子半抗原(加药物、团体激素等)进行精确的定量测定。根据特异性抗体致敏的胶乳微粒(一般为直径约1m的聚苯乙烯胶乳)，与待测标本中的相应抗原相遇时发生凝集反应，胶乳凝集程度与被测物的浓度呈函数关系，由此可测出标本中待测物的含量。测定方法主要有粒子计数法和浊度法两种。二、免疫磁性微粒分离与纯化技术磁性微粒(magnetic microspheres, MMS) 是80年代初，用高分子材料和金属离子为原料，聚合而成的一种以金属离子为核心，外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒。在液相中，受外加磁场的吸引作用，MMS可快速沉降而自行分离，无需进行离心沉淀。因此，将MMS应用于免疫检测，可使操作过程大为简化。经过特异性抗体包被制成免疫MMS，与检样中的抗原结合形成免疫MMS靶分子(或靶细胞)复合体，通过外加磁场的作用即可与其他成分分离开来。再以适当方式使复合体解离，在磁场吸引下除去游离的免疫MMS，即可获得纯化的靶分子或细胞。第二节 免疫组织化学技术 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。免疫组化技术近年来得到迅速发展。50年代还仅限于免疫荧光技术，50年代以后逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的免疫酶技术。免疫组织化学的全过程包括：抗原的提取与纯化；免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；将显色剂与抗体结合形成标记抗体；标本的制备；免疫细胞化学反应以及呈色反应；观察结果。一、免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术是采用荧光素标记的已知抗体(或抗原)作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原(或抗体)，形成的抗原抗体复合物带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原(或抗体)的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量，以达到对抗原物质定位、定性和定量测定的目的。图：免疫荧光技术二、免疫酶细胞化学技术抗体与靶抗原结合之后，形成的抗原抗体复合物在显微镜下是不可见的，如将抗体(或抗原)与某种显色剂偶联，抗原与抗体结合形成的复合物就由不可见而成为可见，从而可以确定组织中是否存在某种抗原(或抗体)。免疫酶技术就是用酶(如辣根过氧化物酶)标记已知抗体(或抗原)，然后与组织标本在一定条件下反应，如果组织中含有相应抗原(或抗体)，抗原抗体相互结合形成的复合物中所带酶分子遇到底物时，能催化底物水解、氧化或还原，产生显色反应，这样就可以识别出标本抗原(抗体)分布的位置和性质，通过图像分析并可达到定量的目的。免疫荧光技术虽已广泛应用于免疫学的研究与诊断，但是荧光抗体染色标本不能长期保存，对组织细胞的细微结构分辨不清，免疫酶技术则能克服上述不足，标记免疫酶技术的敏感性更优于免疫荧光法，对石蜡切片标本尤为适用，为免疫病理研究开辟了一条新途径。另外，酶显色产物具有较高的电子密度，经过适当处理还可以进行免疫电镜观察。图：免疫酶组织化学技术第三节 免疫电子显微镜技术免疫电镜技术(Immune electron microscopy，IEM)是将抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高度精确、灵敏的方法。特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、胶体金等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。首创此项技术的是Singer (1959)，他最先使用铁蛋白标记抗体的方法。30多年来，经过许多学者的不断改进和发展，目前用于免疫电镜的示踪物，除铁蛋白外，主要有过氧化物配和胶体金；标记物除抗体外，发展为使用葡萄球菌A蛋白(SPA)、生物素和亲合素、凝集素等；检测方法也由标记抗体法改进为应用双功能抗体法、搭桥法及不标记抗体的过氧化物酶抗过氧化物酶(PAP)法等；免疫电镜技术也从最初的透射免疫电镜发展为扫描免疫电镜技术等。免疫电镜技术常用标记原理(一) 铁蛋白标记 铁蛋白是一种含铁23，分子量约750kDa，直径为1214nm的球形蛋白。其核心是由4个亚基组成的高电子密度氢氧化铁胶态分子团，外层由24个蛋白质亚单位组成近似球形的外壳。在电镜下，铁很容易和其他粒子相区别，显像清晰。可通过双功能交联剂可与抗体、SPA等共价结合；用于免疫电镜检测的优点是标记物呈颗粒状，分辨率高；但其缺点是Fe的分子量太大，难以透过细胞膜和组织，只适用于细胞表面抗原定位；而且Fe染色标本只适合电镜检查，不能用普通光学显微镜观察。因此，在近年来逐渐被免疫酶和胶体金取代。 (二) 酶标记Nakane和Plerce将酶标抗体用于免疫组化技术，以HRP标记抗体，通过H2O2DAB底物系统被酶分解的呈色反应，来显示抗原抗体反应部位。DAB分解产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，经过OsO4处理后变黑，具有高电子密度，十分适合于电镜观察。而且HRP的分子量(40kDa)比铁蛋白(750kDa)将近小20倍，酶标抗体较易透过经适当处理后的组织细胞膜，能用于定位细胞内抗原。但酶反应产物的分辨率不如颗粒性标记物(铁蛋白胶体金)高。(三) 胶体金标记1971年Faulk和Taylor首创胶体金标记免疫电镜技术。胶体金是氯金酸(HAuCl4)的水溶胶颗粒，如同铁蛋白一样具有高电子密度，在电镜比铁蛋白颗粒更致密，易于辨认，定位比酶反应物精确。胶体金容易和多种大分子物质、包括抗体、A蛋白、凝集素等结合。根据制备方法不同，可以得到直径在3150nm之间的各种大小的胶体金颗粒；分别使用不同直径的胶体金颗粒制备标记物，可以在同一标本片上显示两种或多种抗原物质，即所谓双标记或多标记。胶体金标记物还可代替铁蛋白作为扫描免疫电镜的标记物。因此，胶体金成为当前免疫电镜工作者最感兴趣的标记物。 (四)凝集素标记物 凝集素是一类从各种植物种子和动物组织中提取的糖蛋白或结合糖的蛋白。因其能凝集红细胞，故名凝集素，亦称外源凝集素。除红细胞外，还能凝集淋巴细胞、纤维细胞、精子等。常用的为植物凝集素通常以其提取的植物命名，如刀豆素A、麦胚凝集素、植物血激素、花生凝集素等，凝集素是其总称。目前已纯化并鉴定的植物凝集素有近100种。凝集素最大的特点是能识别糖蛋白和糖脂，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的糖基。一种凝集素具有只对某一种特异性糖基专一性结合的能力如刀豆素A与吡喃糖基甘露糖结合。因此，凝集亲可以作为研究细胞膜结构的探针。另一方面，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、酶、生物素、铁蛋白及胶体金等结合、而不影响其生物活性，可用于光镜或电镜水平的免疫细胞化学研究工作，在探索细胞分化、增生的生物学演变过程，显示肿瘤相关抗原物质，以及对肿瘤的诊断评价等方面均有一定的价值。第四节 流式细胞术流式细胞仪(Folw cytometer，FCM)能快速、精确地测量通过检测区液流中的各种粒子。这些粒子可以是细胞、大分子、乳胶滴或其他粒子。流式细胞术是对单细胞定量分析和分选的新技术。通常是应用一个激光和有关的光学检测系统来收集这些信号以供分析。其检测速度之快，统计学精度之高，是其他方法无法比拟的。它可以研究一个细胞从新生到死亡，从细胞膜到脑浆和核内物质及染色体，还可以探讨不同物质之间的关系。同时它还可以从一个细胞中测得多种参数(如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等)，进行多信息分析，为细胞生物学和生物医学研究提供强而有力的手段。从80年代以来，流式细胞仪已广泛地应用于基础和临床医学研究，并使之成为切实可行的有效研究方法。它在免疫学、肿瘤学、细胞遗传学、病理学、放射生物学等学科中已形成了独立的学科分支。FCM主要可定量分析细胞表面和细胞内抗原，以及对细胞分子水平的核酸含量的测量，这些参数的定量变化已被用于确定正常和异常细胞的分化和生长，预示各种病理状态下细胞的生物行为。 FCM是集现代电子物理技术、激光技术、电子计算机技术于一身的先进科学仪器，开创了荧光技术的又一个崭新的领域。近年来此项技术发展十分迅速，不断有更新换代产品出现，具有更高灵敏度、高分辨率、双激光、多参数分析的仪器不断问世，并在朝着经济实用、操作简便、小巧精制、自动化程度高的方向发展。流式细胞仪的细胞分析原理：待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后加入样品管中，在气体压力推动下进入流动室，流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被鞘液包绕形成细胞液柱。这种同轴流动的设计，使得样品流和鞘液流形成的流束始终保持着一种分层鞘流的状态。鞘液和样品流组成一个圆形的流束，一起自喷嘴的圆形宝石孔喷射出来，进入流动室，与水平方向的激光光束垂直相交，该区称为测量区。利用样品流和鞘流的气压差的层流原理，使细胞依次排列成单行，每个细胞以均等的时间依次通过测量区，被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照时后发出荧光，同时产生散射光。细胞发出的荧光信号和散射光信号，同时被荧光光电倍增管接收，被积分放大反转换为电子信号输入电子信息接收器、通过计算机快速而精确地将所测数据计算出来，结合多参数分析，从而实现了细胞的定量分析。细胞的分选是通过流束形成含有细胞的带电液滴而实现的。在流动室的喷嘴上装备有一个超声振荡压晶体片，这个振荡装置使自喷嘴射出的液束破碎成成千万个小滴，流动的细胞就被分散在这些小水滴中。这时给流束一个电脉冲信号，使小水滴就全部带上电荷。当带有不同电荷的细胞液流经对带正、负几千伏恒定静电电场的偏转板时，带电的小水滴就根据自身所带的电荷性质产生偏转，落入各自的收集容器中，不带电荷的水滴就进入中间的废液容器中，从而实现了细胞的分选。第五节 免疫印迹技术Western blot 免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。将含有目标蛋白(抗原)的样品首先用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)或非变性电泳(NativePAGE)等分离后，通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。例如，将经SDSPAGE分离的蛋白质带转移到膜上后，膜用封闭液处理，然后与第一抗体反应，膜经漂洗后再与偶有辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)的第二抗体反应，加入生色底物反应之后，即可显示出目标蛋白的位置。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，其优点是方法简便、标本可长期保存、结果便于比较，故广泛应用于分子生物学等领域，成为免疫学、微生物学及其他生命科学常用的一种研究方法。 第六节 酶联免疫分析技术一、酶联免疫分析的基本原理和方法类型1971年瑞典学者Engva11, 荷兰学者Van Weerman等分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。其基本原理与RIA相同。先将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。ELISA可用于测定抗体，也可用于检测抗原。根据检测目的和操作步骤不向，有以下三种类型的常用方法。1. 间接法 此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。见下图：操作步骤：用已知抗原包被固相载体；加待检标本，经过温育(372h)，使相应抗体与固相抗原结合。洗涤，除去无关的物质；加酶标抗抗体再次温育(372h)与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体；加底物显色。终止反应后，目测定性或用酶标仪测光密度值定量测定。2 双抗体夹心法 此法常用于测定抗原。 将已知抗体吸附于固相载体加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。 见下图：操作步骤： 用已知特异性抗体包被固相载体； 加待检标本，经过温育使相应抗原与固相抗体结合；洗涤，除去无关的物质； 加酶标特异性抗体，与已结合在固相抗体上的抗原反应；洗涤，除去未结合的酶标抗体； 加底物显色。终止反应后，目测定性或用酶标仪测量光密度值进行定量测定。 此法适用于多价大分子抗原的检测，而不能用于测定半抗原等小分子物质。3 竟争法 此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。 以测定抗原为例将持异性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。见下图：操作步骤： 用已知特异性抗体包被固相载体； 测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原，经过温育，使二者与固相抗体竞争结合；对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合。分别洗涤，除去未结合的成分； 加底物显色。对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物显色反应较弱。分别测定两管的光密度(OD)值，根据对照管与测定管OD值之比计算标本中待测抗原含量。二、ELlSA方法的技术要点1 固相载体和免疫吸附剂的制备 ELISA法最常用的固相载体是聚苯乙烯，其对蛋白质有较强的物理吸附性能，不影响抗体和抗原的免疫活性；且价格低廉，并可制成各种形状的制品。与固相载体结合的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被(coating)，由于载体不同，包被的方法也不同。使用聚苯乙烯制品为载体一般多采用物理吸附法。除载体的理化性质外，受缓