红花在急性血瘀大鼠体内的药代动力学研究.doc

编号 09030265-修改稿 回答修改意见：回答修改意见： 1.红花为中药活血化瘀药中的活血调经药之一，本草记载为乃行血之要药，故以活血为 其主要功效，本文所用血瘀模型是否能代表其证，有待商榷； 答：中医血瘀证的血液流变性特点为血液的浓、黏、凝、聚，本文所用的血瘀模型是属 于中医肝郁气滞和寒凝所致的血瘀模型，是血瘀证的一种辩证类型，能代表血瘀证 的部分属性，红花为传统的活血化瘀药，能够改善血液流变学的浓、黏、凝、聚状 态，因此我们认为红花可以用于此种血瘀证模型。 2.药品与试剂中HSYA 药品与 HSYA 有什么不同？是否用于给予大鼠？ 答：HSYA 指的是对照品，用于含量测定；HSYA 药品指实验药品，用于血瘀大鼠和正常大 鼠，观察药效和药代动力学特征。 3.表 1 中 n6 似有误； 答:n6 应为 n5，属于笔下之误，已在论文中改过，请谅解。 4.图 1 最好重新排列；图 2 图注不宜盖住药时曲线； 答：图 1 进行了重新排列且加了英文标题；图 2 已进行重新处理，文中已改过。 5.2.2 药代动力学线性分析中随给药剂量的增加似乎缺少数据，因本文仅采用了一种给 药剂量，最好补充有关数据或者提供有关文献； 答：原论文中2.2 药代动力学线性分析一项属于上次笔误，因本课题实验尚未结束， 暂无多剂量药代动力学的线性分析结果，请编辑谅解。经我们对论文再次修该将原 2.结 果项，现改为 2. 药代动力学结果,已在论文中修改过。 6.讨论 3.2 中P0.01用什么统计方法进行分析的，前面缺少交代，请补充。 答：P0.01 是 t 检验统计得出的，为了研究两组药代之间有无差异，已将统计方法补 充到 2.药代动力学结果一项中，且在将统计结果补充在表 3 中。 7.请补充检索并引用本刊和药物流行病学杂志近两年文献 1-2 条，这类文献具有参考和 引用价值，在两刊网站 和 及中国期刊网均可方便地查阅 到。 答：在贵刊两本重要期刊上暂时不能检索到有关红花或其它中药在大鼠血浆中的药代动 力学相关论文，故未能引用，如牵强引用，可能会有损贵刊形象，请编辑务必谅解。 羟基红花黄色素 A 在血瘀和正常大鼠体内的药代动力学研究 乔逸,杨志福，奚苗苗，田云,贾艳艳,杨静,陈敏纯，文爱东* 第四军医大学西京医院药剂科，陕西 西安 710032; Study on pharmacokinetics of hydrosafflor yellow A in blood stasis and normal rats QIAO Yi,Yang Zhi-fu, Xi Miao-miao,Tian Yun, Jia Yan-yan, Yang Jing,Chen Min-chun,Wen Ai-dong* Department of Pharmacy,Xingjing Hospital,Fourth Military Medical University Xian 710033,China； 摘要摘要 目的：目的：研究羟基红花黄色素 A(hydrosafflor yellow A,HSYA)在血瘀和正常大 鼠体内的药代动力学特征。方法：方法：HPLCUV 法测定血瘀与正常大鼠血浆 HSYA 的血药浓 度，应用 DAS 2.0 求得药代动力学参数。结果：结果：血瘀大鼠和正常大鼠在体内过程符合二 室模型，血瘀大鼠药代动力学参数：Cmax分别为（8.361.09）mg/L；Tmax分别为 （1.190.55）h；AUC0-6分别为(23.162.88)mg/Lh；t1/2分别为（1.000.30） h。正常大鼠药代动力学参数：Cmax分别为（4.610.19）mg/L；Tmax分别为 （0.750.00）h；AUC0-6分别为(8.680.93)mg/Lh；t1/2分别为（0.980.15） h。结论：结论：HSYA 在急性血瘀大鼠体内吸收和代谢均明显慢于正常机体内，说明中医的证 可以改变药物的代谢过程。 关键词关键词 羟基红花黄色素 A；高效液相色谱-紫外法；血瘀大鼠；药代动力学 ABSTRACT OBJECTIVE：To study the pharmacokinetics character of hydrosafflor yellow A(HSYA) in blood stasis rats and normal rats.METHODS: The concentrations of HSYA in blood stasis rats and normal rats plasma were analyzed by HPLC-UV method.The pharmacokinetic parameters were calculated by the software DAS 2.0.RESULTS: The concentration-time data of HSYA in blood stasis 基金项目基金项目 国家自然科学基金资助项目(30672662) 作者简介作者简介乔逸，药师，硕士研究生，研究方向为中药临床与药效物质础。Tel8205，E- mail: 通讯作者通讯作者文爱东，主任药师，硕士研究生导师，Tel/FaxE-mail: rats and normal rats was shown to fit a double-compartment open model.The main pharmacokinetic parameters were as follows in blood stasis rats: Cmax were（8.361.09）mgh/ L, Tmax were (1.190.55)h, AUC0-6 were (23.162.88) h, t1/2were（1.000.30）mg/ L. The main pharmacokinetic parameters were as follows in normal rats: Cmax were（4.610.19）mgh/ L, Tmax were (0.750.00)h, AUC0-6 were (8.680.93) h, t1/2were（0.980.15）mg/ L. CONCLUSION : The absorption and metabolism of safflor yellow was evidently later in acute rat model of blood stasis syndrome than normal rats, which was show that the pharmacokinetical character of safflor yellow could be changed by syndrome. KEY WORDS:hydroxysafflor yellow A;HPLC-UV; blood stasis rats;pharmacokinetics 红花系菊科植物红花（Carthamus tinctorrius L）的干燥花，为活血化瘀代表药,用于治 疗冠心病、脑栓等心脑血管疾病1。目前认为 HSYA(hydrosafflor yellow A,HSYA)是红花主要 有效成分，具有抗氧化、抗凝、改善心脑血管供血不足及抗血小板激活因子的作用2-4。 “证治 药动学”假说的提出，使中医的辨证与药代动力学通过血药浓度实现有机的结合。许多学者对 中药在对证机体进行药代动力学的研究5-6。本课题组也曾报道红花黄色素在血瘀证大鼠体内静 脉给药后的药代动力学特征进行考察7。本文旨在研究 HSYA 在对证机体-血瘀证大鼠和正常大 鼠体内的药代动力学特征；为应用药效差示血清色谱法8研究红花的药效物质基础寻找有力证 据。 1.1. 材料与方法材料与方法 1.11.1 仪器仪器 Shimadzu 10A 系列高效液相色谱仪（日本岛津公司）,含系统控制器，二元泵，可 变波长紫外检测器，LC-Solution 色谱数据工作站。 1.21.2 药品与药品与试剂试剂 HSYA 标准品（纯度 98.0%，山东绿叶制药有限公司） ；HSYA 药品（购自山 西省太原市星银药物研究所） ；内标核黄素对照品（纯度 98.7%，中国药品生物制品检定所，批 号：100369-200502） ；甲醇、乙腈（Fisher 公司）为色谱纯试剂；磷酸二氢钾、磷酸、高氯酸为 分析纯试剂；所有试验用水均为双蒸水。 1.31.3 实验实验动物及造模方法动物及造模方法 健康 SD 雄性大鼠，体重为 28020g，由第四军医大学实验动物 中心提供，合格证号 SCXK(军)2007-007。血瘀大鼠造模方法：大鼠按文献9方法进行制作，每 只皮下注射 2 次盐酸肾上腺索 0.7 mL/kg/次，间隔 4 h，中间进行 1 次寒冷刺激，将大鼠在冰水 浴中浸泡 5 min。 1.41.4 给药方案及采学方法给药方案及采学方法 雄性大鼠 144 只，随机分为 2 组，正常组 72 只，血瘀模型组 72 只，每组设 9 各采血点,每点 8 只大鼠。按 Li Y10文献中 HSYA 100 mg/kg 剂量给予空腹大鼠 灌胃。给药前禁食 12 h，给药前和给药后血瘀和正常组大鼠采时间均为：0 ,0.25 ,0.5 ,0.75 ,1 ,2 ,3 ,4 ,6 h；腹主动脉取血 2.0 ml,用肝素钠抗凝，5000 r/min 离心 10 min 分离血浆，于-20保 存待测定。 1.51.5 色谱条件色谱条件 Shim-pack VP-ODS C18 (150 mm4.6 mm, 5m)，预柱(10 mm4.6 mm, 5 m); 流动相 A：乙腈, 流动相 B：0.02mol/L 磷酸二氢钾溶液 (磷酸调节 pH 至 3.5） ；梯度洗脱: 流动相 B 0 min，90；16 min，78；平衡时间 5 min; 检测波长：403 nm；流速：0.8 mL/min；进样量：20 L。 1.61.6 样品处理样品处理 精密吸取 200 L 含药血浆，加入 40 L 内标液（20mg/L）和 40 L 50 甲 醇，涡旋 30 s，加入 120 L 6高氯酸，涡旋 2 min，于 12000 rpm 离心 10 min，精密取上清 液 50 L 进样分析。 1.71.7 标准溶液配制标准溶液配制 精密称取 HSYA 对照品 12.5 mg 于 25 mL 量瓶中用 50甲醇溶解并稀释 至刻度，得浓度为 0.50 mg/mL 对照品储备液，精密量取对照品储备液适量，用 50甲醇依次 稀释配制成 200、80、40、20、10、4、2、0.8、0.4 mg/L 系列对照品溶液；精密称取核黄素对 照品 10 mg 于 100 mL 量瓶中，用 10 mL10冰醋酸溶液溶解，50甲醇稀释至刻度，得浓度 为 0.10 mg/mL 内标贮备液,精密量取内标贮备液 5 mL 置于 25 mL 量瓶中，用 50甲醇稀释至 刻度，摇匀，即得浓度为 20 mg/L 内标溶液，于冰箱-20保存备用。 1.81.8 方法学考察方法学考察 .1 方法特异性考察方法特异性考察 分别取空白血浆色谱图 A、空白血浆加 HSYA 和内标(IS)色谱图 B 及 大鼠给药后 1h 血浆样品加入内标的色谱图 C 进行比较，结果表明，HSYA 与内标和血浆中其 他内源性杂质峰分离良好，HSYA 峰保留时间约为 12.4 min，内标峰保留时间约为 15.5 min。 结果见图 1。 0.02.55.07.5 (A) 10.012.5min 0 IS 0.02.55.07.5 (C) 10.012.5min HSYA (A) 空白血浆 (B) 空白血浆+HSYA+IS (C) 给药 1h 后血浆 图图 1 1 大鼠血浆中大鼠血浆中 HSYAHSYA 的高效液相色谱图的高效液相色谱图 Figure 1.HPLC chromatogram of control HSYA in rat plasma A- blank human plasma; B- blank human plasma + HSYA + Internal Standard Solution ; C-the plasma sample from a rat at the time points of 1h. .2 标准曲线的建立标准曲线的建立 精密吸取 200 L 大鼠空白血浆，分别加入 40 L HSYA 系列对照品 溶液，除不加 50甲醇外，其余按“样品处理”项下依法操作，配制浓度为 0.04, 0.08, 0.2, 0.4, 1, 2, 4, 8 和 20 mg/L 的系列标准血浆样品，并按上述色谱条件进行分析。以浓度 C（mg/L）为 横坐标，HSYA 峰面积与内标峰面积比值 f 为纵坐标进行线性回归，得回归方程为 f = - 0.0052+0.586C，(r2=0.9993，n=9)，结果表明本法在 0.0420 mg/L 范围内具有良好的线性关 系，HSYA 在血浆中的最低定量下限为 0.04 mg/L。 .3 准确度与精密度试验准确度与精密度试验 取空白大鼠血浆，按 1.6 项方法操作，分别制成低、中、高 3 个浓度（0.04、2、20 mg/L）的质量监控样品，每个浓度样品各 5 份，依法测定。共分析 3 个 批次，并与标准曲线同批进行测定，以同批标准曲线计算样品浓度及批内、批间的 RSD，考察 方法的精密度与准确度，结果见表 1。 表表 1 HSYA 在大鼠血浆中日间、日内精密度和准确度在大鼠血浆中日间、日内精密度和准确度 Tab 1 Intra- and inter-run precision and accuracy for determination of HSYA in rats plasma (n=5) Intra-run precision and accuracy (n=5) Inter-run precision and accuracy (n=3) Spiked concentration of HSYA(mg/L) Measured (mgL-1) RSD (%) Accuracy (%) Measured (mgL-1) RSD (%) Accuracy (%) 0.040.0430.0024.65107.50.0410.0037.32102.5 2.022.130.062.82105.41.950.136.6796.5 0.02.55.07.5 (B) 10.012.5min HSYAIS 20.2120.350.351.72100.719.760.522.6397.8 .4 提取回收率提取回收率 配制低、中、高 3 个浓度（0.04、2、20 mg/L）的质量监控样品各 5 份， 通过比较空白生物样品中添加被测物并经样品处理后的检测信号与未经提取处理的相应浓度 的标准溶液的检测信号比较，计算提取回收率。低、中、高浓度的回收率分别为 94.2%1.7，97.3%4.1 和 89.7%4.5。 .5 稳定性考察稳定性考察 配制低、中、高 3 个浓度（0.04、2、20 mg/L）的质量监控样品各 5 份， 分别进行冻融、长期、室温稳定性及处理后样品稳定性考察。结果显示，处理后大鼠血浆样 品中的 HSYA 在室温放置 6 h 可保持稳定。大鼠血浆中 HSYA 在20 条件下保存 30 d、室温 下放置 24 h 及反复冻融 3 次都具有良好的稳定性。结果见表 2。 表表 2 HSYA 在大鼠血浆中的短期、室温和冻融稳定性在大鼠血浆中的短期、室温和冻融稳定性 Tab 2. Short-term, post-preparative, and freeze-thaw stability of HSYA in rat plasma Mean of percentage remaining (%) Spiked concentration of HSYA(mg/L)20.212.020.04 Short-term ( 6h, room temperature, n=5 )97.50.599.31.898.41.3 Post-preparative stability(24h,room temperature, n=5) 103.52.595.62.998.62.6 Freeze and thaw stability (three cycles, - 20/room temperature, n=5) 107.43.1100.73.9105.13.7 2.2. 药代动力学药代动力学结果结果 血瘀和正常大鼠口服 HSYA，血药浓度-时间数据见图 2。血药浓度-时间曲线经 DAS 2.0 软件分析，该药在体内代谢过程符合二室模型，两组药代数据之间有无差异进行 t 检验统计。 Cmax 和 Tmax 以实测值计算 ，AUC 按梯形面积计算各药动学参数见表 3。t1/2无显著性差异。 正常大鼠与血瘀大鼠HSYA药代曲线图 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 00.511.522.533.544.555.566.5 时间(h) 浓度mg/L 正常大鼠HSYA药代 血瘀大鼠HSYA药代 图2 HSYA在血瘀大鼠和正常大鼠体内的平均血药浓度-时间曲线 Fig 2 Plasma concentration-time curve of HSYA in blood stasis rats and normal rats 表 3 HSYA 在血瘀大鼠和正常大鼠体内的药代动力学参数 ( S,n=8) x Tab 3Pharmacokinetic (PK) results of HSYA in blood stasis rats and normal rats plasma PK Parameters血瘀大鼠血瘀大鼠正常大鼠正常大鼠 t1/2 （h）0.860.240.69 0.28 t1/2（h）1.000.300.980.15 V1（L/kg） 4.592.65*14.991.96 CL（L/h/kg） 4.100.59*10.241.27 AUC0-6（mgh/ L） 23.162.88*8.680.93 AUC0-（mgh/ L） 24.733.34*9.881.20 K12（1/ h）0.320.390.51 0.60 K21（1/ h）0.76 Tmax（h）1.190.55*0.750.00 Cmax（mg/ L） 8.361.09*4.610.19 血瘀大鼠与正常大鼠比较 *p0.05，*p0.01 3 3讨论讨论 3.13.1 对于 HSYA 的血药浓度检测方法，国内外文献报道主要有甲醇、丙酮蛋白沉淀法、固 相萃取法10-11等，这些方法存在样品处理复杂，毒性大，成本高，分析时间长等不足。本实 验方法学中血浆样品预处理方法采用 6高氯酸沉淀蛋白，高速离心后取上清液进样分析， 提高了 HSYA 的提取回收率，并且结果稳定。本法操作简便快速，定量准确可靠，适用于 HSYA 的药动学研究。 3.23.2 HSYA 在血瘀大鼠体内的表观分布容积(V)和整体清除率（CL）均明显小于正常大鼠 （P0.01） ；与正常组大鼠相比，血瘀大鼠对 HSYA 的吸收半衰期（t1/2）也显著延长，此外， HSYA 给药后 4 h 在正常大鼠体内已测不到其含量，而血瘀大鼠该点的药物浓度能被测到，并 且可以维持到 6 h。说明 HSYA 在血瘀大鼠体内吸收和代谢均明显慢于正常大鼠体内。而且， HSYA 在血瘀大鼠体内的药时曲线下面积(AUC)、峰浓度（Cmax）较正常大鼠有很大增加 （P0.01） ，我们进一步研究发现 HSYA 对血瘀大鼠的血液流变学改善较正常大鼠明显。这说 明红花在血瘀大鼠体内的药效学和药动学意义均明显优于正常大鼠，这符合中医的辨证论治 基础下的用药治疗原则；明确了 HSYA 血瘀证大鼠体内的药动学特征，又进一步发展了“证 治药动学”理论，对于应用药效差示血清色谱法研究红花的药效物质基础奠定了有利基础； 而且红花在血瘀大鼠体内药代动力学研究可以为红花口服液及其复方制剂在临床合理应用提 供重要的参考价值。 参 考 文 献 1 朱海波，王振华，田京伟，等.羟基红花黄色素 A 对实验性脑缺学的保护作用J.药学学报,2005,42(10): 1144-1146. 2 藏宝霞，金 鸣，司 南，等.羟基红花黄色素 A 对血小板活化因子的拮抗作用J.药学学报,2002,37(9): 696-699. 3 Wei XB, Liu HQ, Sun X, et al. Hydroxysafflor yellow A p