高效液相色谱法分析黄秋葵多糖的单糖组成.doc

高效液相色谱法分析黄秋葵多糖的单糖组成裘雅渔1 李巧玲1 程和勇2(1浙江大学化学系，浙江 杭州310027；2 杭州师范大学材料系，浙江 杭州 310058)摘要：采用高效液相 (HPLC-RID)色谱法，建立了7种常见单糖的分离模式，并成功地用于黄秋葵多糖的单糖组成分析，具有良好的重复性。结果表明，黄秋葵多糖由木糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、半乳糖及阿拉伯糖7种单糖组成，其摩尔比为0.57：1.00：0.53：3.50：1.75：1.25：1.70，该HPLC-RID方法是简单、快速、灵敏、方便的分析技术，可用于黄秋葵多糖的质量控制。关键词：黄秋葵多糖，单糖组成，高效液相色谱文章分类号：O65。Analysis of Monosaccharide Composition in Okra Polysaccharides by High Performance Liquid ChromatographyQIU Ya-yu1，LI Qiao-ling1，CHENG He-yong2(1 Department of Chemistry，Zhejiang University , Hangzhou ,310027 China;2 Department of Materials，Hangzhou Normal University , Hangzhou ,310058 China)Abstract :The high performance liquid chromatographic(HPLC) method ofwas developed to separate the traditional seven monosaccharides and detect the monosaccharide composition of Okre polysaccharides with good reproducibilityIn this study，it was found that sulfuric acid and trifluoroacetic acid possessed the same ability for hydrolyzing Okra polysaccharides and the component monosaccharides were completely released from the polysacchaides until hydrolyzing for 8 hand the whole drying processes of the acid hydrolysates could be omitted The results of HPLC analysis showed that Okra polysaccharides consisted of xylose, mannose，rhamnose，glucose，fructose，galactose and arabonose with the molar ratio of 0.57：1.00：0.53：3.50：1.75： 1.25：1.70The HPLC method is simple， rapid， sensitive， convenient and can be applied to th e quality control of Okra polysaccharidesKeywords: Okra polysaccharides，monosaccharide composition， high perform ance liquid chromatography1 引言黄秋葵多糖是从黄秋葵嫩荚果中提取的水溶性成分，药理学研究表明, 嫩荚果中含有特殊香气和风味的粘滑汁液，这种粘滑汁液是由水溶性纤维果胶、半乳聚糖和阿拉伯树胶等组成，具有神奇的功能，这种粘滑汁液即是粘蛋白1,具有保护肠胃、肝脏和皮肤粘膜作用2。并有治疗胃炎、胃溃疡等疾病的效果3；这种粘液蛋白还能刺激中枢神经，加速血液循环及促进新陈代谢和全身血管活化4，可防治因血管供血不足造成的心脏病、中风、骨质疏松及老年痴呆等疾病5。而多糖的单糖组成测定是控制多糖质量标准和提供多糖基本信息的最重要环节69。因单糖存在互变异构体、差向异构体、结构相似等特征1012，而且往往同一待测样品，如多糖、寡糖、糖肽、糖蛋白等，可能含有许多类型的单糖13,14。所以，单糖分析有其自身的特点，必须具有高效的分离技术，方可实现系列单糖的有效分离。本研究采用高效液相渗透色谱方法，用示差折光检测器和磺化的聚苯乙烯二乙烯基苯阳离子交换树脂（Pb2+）柱（交联度为6%），建立适于黄秋葵多糖单糖组成测定的HPLC新方法，达到灵敏、快速、准确、方便和可在线大批量分析的目标。2 实验部分2.1 仪器和试剂WATERS 2690液相色谱仪(美国WATERS 公司)；PRE-PACKED COLUMN RT POLYSPHER CH PB 分析糖柱(德国MERCK公司)；旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)；EZDRY冷冻干燥机(美国Filter公司)。三氟乙酸(TFA，Merck公司)；甲醇(色谱纯，天津市科密欧化学试剂)；乙腈(TEDIA公司)；葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、半乳糖(Ga1)、鼠李糖(Rha)、木糖 (Xy1)、果糖（FRU），丙三醇（Gly）均购自Sigma公司。其它试剂均为分析纯。黄秋葵多糖由本教研室制备2.2 黄秋葵多糖水解精确称取黄秋葵多糖样品20.0 mg于安瓿中，分别加入2 molL-1 TFA、2 molL-1 H2SO4以及其混酸溶液2.0 mL，充氮气封管，110油浴分别水解2、4、6、8和10 h。冷却至室温，反应混合物1000 rmin-1离心5 min，取上清液用0.3molL-1 NaOH溶液中和到约pH 7.0。2.3 HPLC分析方法采用WATERS 2690色谱系统,WATERS 2410 示差折光检测器，检测器温度40；柱温为40；流速0.6 mLmin-1；流动相：去离子水，进样体积50L 。2.4 分析原理与方法2.4.1 定量校正因子 以Gly(丙三醇)为内标，测定7种单糖的定量较正因子( fVs)。精密称取各标准单糖并配制成2 mmolL-1的母液，用时稀释为5个不同浓度的单糖溶液，并进行HPLC分析 (线性范围在110mmol之间)。2.4.2 相关系数与回归方程以单糖的浓度X ( WiWs)与峰面积Y(AiAs)作图，得回归方程与相关系数。求出各单糖的斜率 b，即定量较正因子f0 fVs=(WiWs )(AiAs)Ai ，As分别为Gly(丙三醇)和标准单糖的HPLC峰面积。2.4.3 摩尔比的计算以Gly(丙三醇)为内标，得到各单糖的峰面积与内标的峰面积比，乘以f/M ( M为单糖的分子量)，所得的值之比为摩尔比，即：RVs = fVs (AiAs)/M .3 结果与讨论3.1 单糖对照品的HPLC分离为实现黄秋葵多糖各组成单糖的高效分离，本实验对黄秋葵多糖可能包含的葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、半乳糖(Ga1)、鼠李糖(Rha)、木糖 (Xy1)、果糖（FRU）)等7种标准单糖及内标Gly(丙三醇)的高效液相色谱分离条件进行了优化。结果表明，在2.5mM 醋酸水溶液，5mM醋酸水溶液 和 去离子水三者之间选择，在去离子水当中的分辨率高，分离效率最好，平且样品容量大，因此去离子水为分离此7种单糖的较理想色谱分离条件。色谱峰的各峰保留时间依次为内标Gly(丙三醇),葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、半乳糖(Ga1)、鼠李糖(Rha)、果糖（FRU）以及木糖 (Xy1)如图3(a)所示。其中，内标Gly(丙三醇)与其它单糖有很好的分离，其作为内标是合适的。 图1 黄秋葵多糖水解样品经干燥过程(a)和无干燥过程(b)对单糖组成测定结果的影响Fig1 The chromatogram of okra polysaccharide hydrolysates with drying(a)and without drying process(b)3.2 多糖水解样品制备条件优化多糖水解样品的制备通常要经复杂的干燥过程，方可进行下一步的分析。本样品制备方法省略干燥过程，而将多糖水解液直接用NaOH中和(约中性)，这对于发展多糖的定性定量在线分析技术有重要的实际意义。该制备方法的特点是：(1)简化工艺、避免干燥损失。(2)该多糖水解样品制备过程对多糖的组成测定无影响。图1是黄秋葵多糖经TFA水解后，水解液经传统的干燥过程和未经干燥过程的HPLC图，图中未发现有明显吸收峰改变。(3)对多糖的含量、单糖组成等定量分析更有意义，因此过程几乎无糖损失，多糖水解液可直接进行在线大批量分析监测。3.3 黄秋葵多糖样品的单糖组成分析3.3.1 多糖水解时间对分析结果的影响考察了TFA的不同水解时间对黄秋葵多糖的组成测定结果的影响，结果如图2所示。黄秋葵多糖随水解时间的延长，测定的单糖摩尔比率增加，而在110用2 mmolL-1 TFA水解8 h后，水解已完全。可见，黄秋葵多糖经TFA水解8 h为其合适的水解时间。图 2 黄秋葵多糖经TFA水解的时间对各组成单糖的测定影响Fig2 The effects of component monosaccharldes of Okra polysaccharides for different trifluoacetie acid (TFA) hydrolysis time3.3.2 不同酸水解对黄秋葵多糖的单糖组成测定的影响 选择用于水解多糖的合适种类的酸对准确测定单糖组成非常重要。本研究考察了常用的TFA、H2 SO 4及其混酸等不同酸水解方法对黄秋葵多糖的组成测定结果的影响(图3)。结果表明，TFA和H2 SO4对黄秋葵多糖的水解效果无明显影响，但TFA和H2 SO4混酸水解该多糖时，单糖测定结果有一定的变化，其原因尚不清楚。所以，本实验选用TFA水解8 h为黄秋葵多糖的合适水解时间。图3 黄秋葵多糖的不同酸水解样品的色谱图Fig3 HPLC separation of the diferently acid hydrolysates of Okra polysaceharidesa单糖标准品(monosaccharide standards)+丙三醇（GLY）；bTFA水解样品(trifluoroacetic acid hydmlysates)；cH2SO4水解样品(sulfuricacid hydrolysates)；dTFA和H2S04混酸水解样品(hydmlysates of trifluoroacetlc acid and sulfuric acid)。1 葡萄糖(Glc)； 2阿拉伯糖(Ara) ； 3甘露糖(Man) ；4半乳糖(Ga1)； 5鼠李糖(Rha)； 6果糖（FRU）；7木糖 (Xy1)3.3.3 黄秋葵多糖的单糖组成测定结果 由HPLC分析和摩尔比计算结果可知，黄秋葵多糖由木糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、半乳糖及阿拉伯糖7种单糖组成，其摩尔比为0.57：1.00：0.53： 3.50：1.75：1.25：1.70，单糖测定的精密度(RSD，n=3)均低于4.5 ，测定结果重复性良好。本研究通过凝胶渗透HPLC法，实现在普通实验室常用示差折光检测器和聚苯乙烯二乙烯基苯阳离子交换树脂（Pb2+）糖柱分离分析黄秋葵多糖的单糖组成，并可望推广用于其他多糖的单糖组成测定；同时，建立了黄秋葵多糖水解样品的制备优化工艺，避免了传统多糖水解产物的复杂干燥过程和进行繁琐的衍生化反应；此外，该技术的完善将在食品糖含量控制、大输液葡萄糖监测等领域有广阔的应用前景，并为发展黄秋葵多糖以及其它多糖的在线定性定量HPLC方法奠定基础。表1 黄秋葵多糖的组成测定结果Table 1 Analytical results of component monosaccharides of Okra polysaccharides峰 单糖 标准曲线 相关系数 相对峰面积 摩尔比率Peak Monosaccharides Stansard Curve r(n=5) Area(%) Ratio1 葡萄糖 y=0.5004x+0.1026 0.9972 26.4% 3.502 甘露糖 y=0.5061x+0.0811 0.9905 11.2% 1.003 半乳糖 y=0.5894x+0.0337 0.9979 11.7% 1.254 阿拉伯糖 y=0.4995x+0.1006 0.9954 16.3% 1.705 木糖 y=0.4169x+0.0087 0.9933 8.9% 0.576 果糖 y=0.4561x+0.0532 0.9991 17.9% 1.757 鼠李糖 y=0.5392x+0.0425 0.9989 7.6% 0.53参考文献（References）1Katsutoshi H，Keiichiro E and Koji H. 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