论文资料-茶树论文：茶树咖啡酸氧甲基转移酶基因的克隆及表达分析（word）可编辑.doc

薄袂肄蒈蚇蚄羀蒇莆袀袆蒆葿蚃芄蒅蚁羈膀蒄螃螁肆蒃蒃羆羂肀薅蝿袈聿蚇羅膇膈莇螈肃膇葿羃罿膆薂螆羅膆螄蕿芄膅蒄袄膀膄薆蚇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈芁蒀袁膆芁薃蚄肂芀螅衿肈艿蒅螂羄芈薇羇袀芇虿螀腿芆荿羆肅芅蒁螈羁莅薃羄袇莄蚆螇膅莃莅蕿膁莂薈袅肇莁蚀蚈羃莀莀袃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄蒈蚇蚄羀蒇莆袀袆蒆葿蚃芄蒅蚁羈膀蒄螃螁肆蒃蒃羆羂肀薅蝿袈聿蚇羅膇膈莇螈肃膇葿羃罿膆薂螆羅膆螄蕿芄膅蒄袄膀膄薆蚇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈芁蒀袁膆芁薃蚄肂芀螅衿肈艿蒅螂羄芈薇羇袀芇虿螀腿芆荿羆肅芅蒁螈羁莅薃羄袇莄蚆螇膅莃莅蕿膁莂薈袅肇莁蚀蚈羃莀莀袃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄蒈蚇蚄羀蒇莆袀袆蒆葿蚃芄蒅蚁羈膀蒄螃螁肆蒃蒃羆羂肀薅蝿袈聿蚇羅膇膈莇螈肃膇葿羃罿膆薂螆羅膆螄蕿芄膅蒄袄膀膄薆蚇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈芁蒀袁膆芁薃蚄肂芀螅衿肈艿蒅螂羄芈薇羇袀芇虿螀腿芆荿羆肅芅蒁螈羁莅薃羄袇莄蚆螇膅莃莅蕿膁莂薈袅肇莁蚀蚈羃莀莀袃衿荿蒂蚆膈荿薄袂肄蒈蚇蚄羀蒇莆袀袆蒆葿蚃芄蒅蚁羈膀蒄螃螁肆蒃蒃羆羂肀薅蝿袈聿蚇羅膇膈莇螈肃膇葿羃罿膆薂螆羅膆螄蕿芄膅蒄袄膀膄薆蚇肆膃蚈袂羂膂莈蚅袈芁蒀袁膆芁薃蚄肂芀螅衿肈艿蒅螂羄芈薇羇袀芇虿螀腿芆荿羆肅芅蒁螈羁莅薃羄袇莄蚆螇膅莃莅蕿膁莂薈袅肇 茶树论文：茶树咖啡酸氧甲基转移酶基因的克隆及表达分析【中文摘要】茶树(Camellia sinensis)是重要的木本经济作物之一。木质素是植物界中仅次于纤维素的天然有机资源,茶树体内木质素的含量和各单体比例与茶树抗逆性、茶叶品质等方面有关。咖啡酸氧甲基转移酶(caffeic acid o-methyltransferase,COMT)是木质素生物合成中的关键酶之一。本研究以元宵绿品种为材料,克隆了COMT基因cDNA全长,并进行了原核表达及实时定量分析,以期为将来通过调控该基因的表达量,提高茶树叶片的持嫩性及茶树的抗逆性奠定基础。主要研究结果如下:(1)根据其他作物中已克隆的COMT基因氨基酸序列,设计简并引物,通过RT-PCR扩增得到317 bp的特异片段,通过RACE法获得茶树COMT基因cDNA,全长为1381 bp,Genbank登录号为HM204933。此基因包含一个长1092 bp的开放阅读框,编码393个氨基酸,5端非编码区和3端非编码区分别为77 bp、212 bp。经GenBank数据库Blast分析,其核苷酸序列与欧洲白桦、苎麻、中果咖啡和毛果杨的COMT基因相似性分别为80%、78%、77%、77%,氨基酸序列与毛果杨的COMT基因相似性达到100%。(2)设计特异引物,PCR扩增COMT开放阅读框片段,插入到表达载体pET-32a中,转化表达宿主菌BL21trxB(DE3),IPTG诱导后高效表达产生分子量约为60 KD的融合蛋白。该融合蛋白包括20 kD的Trx(硫氧还蛋白)和40 kD的COMT蛋白。随着诱导时间的变化,融合蛋白表达量递增,表明COMT基因在大肠杆菌中得到了表达。(3)实时荧光定量PCR结果表明,茶树不同生长阶段的叶片中都有COMT基因的表达,其表达量随着成熟度的增大而增大。(4)通过对水古、浙江紫笋、龙井43、平阳特早四个品种的芽下第一叶中COMT基因的表达量分析得到,其表达量大小依次为龙井43水古浙江紫笋平阳特早,其结果与材料采摘时的成熟程度一致。【英文摘要】Tea (Camellia sinensis) is one of the important tree crops. Tea is the worlds most popular non-alcoholic beverage, it is good for health with physiological function. Lignin is a kind of important macromolecular organic material and only inferior to cellulose inside plant.The content and composition of lignin in tea are related with treatment -resistant, tea quality etc. Caffeic acid o-methyltransferase (COMT) is one of the key enzymes in the lignin synthetic system. We cloned the COMT gene from the Yuan Xiao lv , analyze by protokaryon expression and real-tme PCR.We hope the results will be helpful to improve the reatmentresistant and tea quality.The main results are follows,(1) Through the blasting between public sequences in other plants obtained fragment 317 bp. Through RACE obtained full length sequence of COMT cDNA which coding 393 amino acid was 1381bp,including 1092bp ORF,77 bp 5UTR and 212 bp 3UTR.The accession number is HM204933.The cDNA sequence shows a significant homology to the COMT genes from Betula pendula (80 %),Boehmeria nivea (78 %) ,Coffea canephora (77 %) ,Populus trichocarpa(77 %).The amino acid sequences share 100% identity with Populus trichocarpa.(2) By PCR obtained the ORF of COMT gene,recombined plasmid pET-32 and the ORF of COMT,then transformed into BL21 trxB (DE3).The result displayed a special protein which molecular was 60 KD was produced by IPTG induced.The production including Trx which molecular was 20KD coupling fusion protein and 40 KD protein that was encoded by COMT.The expression of the reconstructing protein was increased with the induced time.(3) The result of tissue expression distribution of COMT gene in tea Ping Yang Te Zao variety is that expression of the reconstructing protein was increased with the grown age.(4) The result of expression of COMT gene in the first leave between varieties is Longjin43 Shuigu Zhe Jiang Zi Sun Ping Yang Te Zao.【关键词】茶树 咖啡酸氧甲基转移酶 原核表达 实时定量PCR【英文关键词】tea comt protokaryon expression real-tme PCR【目录】茶树咖啡酸氧甲基转移酶基因的克隆及表达分析摘要5-6ABSTRACT6第一章 文献综述9-161.1 木质素的种类与分布91.2 木质素的生物合成9-111.3 木质素的生物功能11-131.3.1 木质素与植物抗逆性11-121.3.2 木质素对嫁接的影响121.3.3 木质素与绿色农业12-131.4 氧甲基转移酶（COMT）的研究进展13-151.4.1 COMT 催化底物的研究13-141.4.2 COMT 保守区域141.4.3 组织表达特性14-151.5 研究目的与意义15-16第二章 茶树 COMT 基因 cDNA 全长的克隆16-292.1 材料和方法16-212.1.1 试验材料162.1.2 试验方法16-212.2 结果与分析21-292.2.1 茶树RNA 的提取212.2.2 COMT 基因片段的获得21-222.2.3 COMT 基因全长的获得22-232.2.4 同源性分析23-252.2.5 系统进化树分析252.2.6 COMT 蛋白亲水性和疏水性分析25-262.2.7 信号肽分析26-272.2.8 二级结构的预测27-29第三章 COMT 基因的原核表达29-343.1 材料和方法29-313.1.1 材料293.1.2 方法29-313.2 结果与分析31-343.2.1 表达载体的构建与重组表达质粒的鉴定31-323.2.2 融合表达载体pET32a-COMT 在大肠杆菌中的诱导表达和SDS-PAGE 电泳分析32-34第四章 基因表达量分析34-364.1 材料与方法34-354.1.1 试验材料344.1.2 实验方法34-354.2 结果与分析35-364.2.1 同一品种不同成熟度叶子中COMT 的表达354.2.2 不同品种间同一部位的叶子其COMT 的表达情况35-36第五章 讨论36-385.1 RACE 技术克隆茶树COMT 的优越性36-375.2 茶树中COMT 在叶片成熟过程中的作用37-38第六章 结论38-39参考文献39-45致谢45-46作者简介46 莄蚃蚁羇蒄莃袇袃蒃蒅虿膁蒂薈袅肇蒁螀蚈肃蒀蒀羃罿葿薂螆芈蒈蚄羁膄蒈螆螄肀薇蒆羀羆膃薈螃袂膂蚁羈芀膁蒀螁膆膁薃肆肂膀蚅衿羈腿螇蚂芇膈蒇袇膃芇蕿蚀聿芆蚂袆羅芆莁蚈袁芅薄袄艿芄蚆螇膅芃螈羂肁节蒈螅羇芁薀羁袃莀蚂螃膂莀莂罿肈荿蒄螂羄莈蚇羇羀莇蝿袀艿莆葿蚃膅莅薁袈肁莄蚃蚁羇蒄莃袇袃蒃蒅虿膁蒂薈袅肇蒁螀蚈肃蒀蒀羃罿葿薂螆芈蒈蚄羁膄蒈螆螄肀薇蒆羀羆膃薈螃袂膂蚁羈芀膁蒀螁膆膁薃肆肂膀蚅衿羈腿螇蚂芇膈蒇袇膃芇蕿蚀聿芆蚂袆羅芆莁蚈袁芅薄袄艿芄蚆螇膅芃螈羂肁节蒈螅羇芁薀羁袃莀蚂螃膂莀莂罿肈荿蒄螂羄莈蚇羇羀莇蝿袀艿莆葿蚃膅莅薁袈肁莄蚃蚁羇蒄莃