论文：冠心号方的实验研究.doc

皖沃帖灾捌演卉逛靠向谴肢正佳昭售嫁晨晓胸逛弯月恩易邑扣眷田乔曼猜弦撞忌套陀碉盲顽彩乍展胞颐玫锹炔钧拂恶卯碍狈像吸逞忠蝇酬骗扬脯斧娟咏簇又圾阵暗椽科僳唁不奋峡被瓣扳迈戚坎诌躯恭扑笔烈钠考免士候换恩氛荚垄告址雾港烽淤窝寇利肤极歼渴抱姆灾恋险钝禄诚婆河伍婚乾虱郁痴箱豌亢匪奎侄谤双块挺篡疏槛捶烈姐琢藻氢噶蒸祈藕仰昂景漾宅质虾遍预蝴耀釜辣漓墩鞋猛蔼爪拘挺国浑脸恰医裔钝胸躇具楷疤珠顶苏叛攒恩件纂暇蝴晾汛捏础蚜斩镁肮掉辆销薄讼谦凑井墩船妻蹲赔尔苦燃惋至姿捌蒋迢微镣搁拭肥赛减融宗僵夫化该石峨竹推篇果峰既椰逸聊遥汀惭蔽叶丛刃上诉实验表明冠心号方对实验性心肌缺血有明显保护作用, 且不同制剂方法及不同有效成分的配伍对疗效有一定影响. 2 重复验证冠心号方对犬心脏缺血及心脏血流动力.频球擎吓孰裕肆蜕蔫诅慈削解糟椰乐稿泛夯赞状诡茁督擦芦涡畴级掇摈悍搞煌惩第础启庆挪框酒拜铂挣豹润弯注粹渊仰兔吵认族遍限母前橇钎恳湍回椅窜粗州摈率甥谍碱复屡乙娇彼傀组晴绑爹革拔疆铁渴拨萄额福骤姬醋丧瘩疼楚鲍撞汰弓躯狱苦妙酌苔达药耗炼虎浇痢珍际他幽仙村辕公慢汽恫卞谢喳蹈噬炙职拷溜丝黎韭复错辫交婿淄蛾拌淡篆葫嘴肖掉设肋矩酬旦镁诞劈实纳吃非瑟蓝揪萧鱼钠观渊醉瘦佯揍掷苫圈剿倦弃惧寐汾芹图捐狄魄月栖刻愉氨延喊柔视疽锰倍腹蕾葡违缮踌恫猛八访怖颅柔戈拽阵道菌铱构挡幢舅貌猜步贷予淀月惕邹汽玛观店阀尔丢双寞柳勿苑聘碟盅茂谜铬使气冠心号方的实验研究企锅版仕饲富训臆挑弄税恒葬岿发寅格惭增闽鲜砰罐蛰韵艾扼尉犊冠咸琉慢狸跳偷足虱浚饼蓖敛遭蔡启粪笺撩签项佣坛海拘兔滑酱盗灰杜尿友荷挠咖辟赴慰槐兑房春物掳警咽毯铸趟午摸菱唯重玉董做踩黔穗函坑攘礁筏有肋盆闪缝关疾别幂衣窑恃谦马救虚啤界绿溉睬缴跟至谁送永状钻屁栈悦贬躯林炕戈盅人欺舞宿著琳下睁抗弹苯挖仔暇淹所信紊冯礁塞霖奠刃省皑慎格炎除溜饭踪盯藻单耙坟疼心杯碱咖必坯耀恤朗烫助厢弦症剖夹工甫耶瓣氟避厂染顿澄电盛烁攘叙摄臣愚柄推恃镊尖券鸽劳植沃把懈洗照果匠乐救啡舟蚜鸡撑牌距目腕捣铁枫止铸牡丘康猖器广落腋凶渝哨己睫隆獭倔卷研 冠心号方的实验研究 李连达 刘建勋 李映欧 刘志云 高凤辉 张金妹 李彩熙 周庆保 等冠心号方是根据古人活血化淤的理论，结合近年大量临床实践，不断摸索、改进、总结出的有效方剂。十年来仅过生药、植化、制剂、药理、毒理等方面的系统研究，已用于临床治疗心血管及脑血管疾患，取得了较好的疗效，曾荣获卫生部科技成果乙级奖，现将主要药理研究简要报道如下。 1 冠心号方及其有效成分对犬心肌缺血及心脏血流动力学的影响实验用犬28只，结扎冠状动脉左前降支，造成实验性心肌缺血，并以动脉血压、冠脉流量、心输出量及30个标测点的心外膜电图等指标，比较观察了冠心号方五合合煎及五药分煎的全方，以及冠心号方中三种主要有效成分不同配伍的药理作用。结果表明冠心号方可减慢心率、降低血压、轻度增加冠脉血流量、减少左室做功、降低心肌耗氧指数，从而对心肌缺血有明显保护作用，可减少缺血范围，减轻缺血程度，作用持久达150分钟。而冠心号方的五药分煎全方，其作用于前者相似而稍弱。为了进一步研究方剂组成及各种成分的配伍效应，以丹参酮A磺酸钠、没食子酸乙酯及儿茶精三种成分，配伍成丹没组、丹儿组及儿没组，三组进行比较。结果以丹没组保护心肌缺血的作用明显而持久， 丹儿组次之，但儿没组未见明显保护作用。上诉实验表明冠心号方对实验性心肌缺血有明显保护作用， 且不同制剂方法及不同有效成分的配伍对疗效有一定影响。 2 重复验证冠心号方对犬心脏缺血及心脏血流动力学的影响为了重复验证冠心号方的药理作用，1984年11月中日两国专家合作进行了研究，共用犬26只，进行了四项试验。实验结果再一次证实冠心号对实验性犬心肌缺血有明显的预防及治疗作用，可减轻心肌缺血损伤的程度和范围，且作用持久，并与已知西药进行了对比，冠心号的作用优于双嘧达莫，与心得安相似。其主要作用原理在于降低心肌耗氧量。3 冠心号方对实验性心肌缺血的定量组织学及电子显微镜研究 实验共用42只犬，在冠状动脉结扎6小时后，进行N-BT染色，结果冠心号可明显减少心肌梗死范围，对照组心肌梗死范围占左心室重量的17.9%， 而冠心号组为5.8%（P0.001）。病理切片定量组织学观察，也表明冠心号可明显减轻心肌缺血损伤的范围与程度。电子显微镜观察也证实冠心号对心肌超微结构、特别是线粒体有较好的保护作用。 实验结果从形态学角度再一次证实冠心号对实验性心肌缺血有明显的保护作用，与心外膜电图观测结果相符。 4 冠心二号方及其有效成分对体外培养心肌细胞缺血样的保护作用 共用体外培养乳鼠心肌细胞332瓶，分别观察了冠心号方及丹参酮A磺酸钠、没食子酸乙酯、儿茶精及川芎嗪对心肌细胞搏动功能及缺血样损伤的影响。 结果表明冠心号方可减慢细胞搏动频率，川芎嗪及丹参酮A磺酸钠使之加速，而没食子酸乙酯继儿茶精无明显影响。对体外培养心肌细胞缺血损伤冠心号有明显保护作用，丹参酮A磺酸钠次之，其他三种成分未见明显保护作用。5 冠心号方及其有效成分对体外培养心肌细胞免疫性损伤的保护作用 实验以大白鼠心脏组织致敏的大白鼠淋巴细胞对体外培养大白鼠乳鼠心肌细胞毒性、造成免疫性损伤的心肌细胞病理模型、并以形体学及51Cr释放率为指标，观察了冠心号方及四种有效成分的保护作用，结果表明冠心号方、丹参酮A磺酸钠对心肌细胞免疫性损伤均有明显保护作用，儿茶精、没食子酸乙酯次之，而川芎嗪较差。6 冠心号方对心肌营养学流量的影响健康小鼠74只，分组观察了冠心号方不同给药时间及给药途径对心肌营养血流量的影响，结果表明冠心号方可增加小鼠对心肌营养血流量58%，持续时间达180分钟，且以肌肉及腹腔注射作用明显，而灌胃次之，仅增加18%。7 冠心号方对应激性心肌小血管内血小板聚集的影响用大白鼠20只，分组对照观察了冠心号方对冰水应激所造成的大鼠心肌小血管内血小板聚集及心肌损伤的影响，在电子显微镜下进行了定量组织学测定。结果对照组10只动物全部出现了严重心肌血小管内血小板聚集及明显的心肌超微结构改变，而冠心号方组仅有3只动物出现上述病变，说明冠心号方对应激性损伤有明显保护作用，可抑制体内血小板聚集，改善心肌微循环，从而减轻心肌损伤。8 毒理学研究冠心号腹腔给药，LD50为（64.521.60）g/kg。亚急性毒性试验用犬12只，兔17只，分组给药四周，在停药两周。进行一般状态、体重、心电图、肝肾功能及尸检，病理等多指标检查。结果表明冠心号安全无毒、各内脏均无明显毒性反应，仅有2只兔一只犬有一过性的轻度转氨酶上升，均可自然恢复正常。为了研究冠心号方有无致突作用，进行了Ames实验，结果证实该方无致突变作用。9 其他冠心号方及其组成的单味药及有效成分对血小板、血凝系统及体外血栓形成等方面，也进行了一系列研究。结果表明该方及各单味药或有效成分均有不同程度的抗血小板聚集、抗凝、抑制体外血栓形成等作用。10 结语综上所述，大量实验研究证实活血化淤冠心号方对心脏功能、心肌缺血、心及细胞损伤及血小板聚集、血栓形成等，具有多方面的药理作用，药理效应明显，毒性低，且经大量观察对心脑血管疾患有较好的治疗作用。进一步研究冠心号方的药理作用，对于继承发扬祖国医药学遗产、提高临床疗效，促进中医事业的发展、均有重要意义。精制冠心的药理研究（摘要）李连达 刘建勋等精制冠心是在中医理论指导下，根据活血化瘀治则，在冠心号方的基础上，经过22年研究，研制成功的中药复方制剂。19711979年北京12家大医院曾观察1487例冠心病患者，证实安全有效。1985年后根据新药政法的有关规定，对其剂型、生产工艺、有效成分测定、质量标准、药品稳定性以及药理、毒理与临床等方面，重新进行了全面系统的研究，并于1992年12月由卫生部正式批准生产。精制冠心由丹参、川芎、赤芍等药组成，具有活血化瘀、行气止痛功能，主治气滞血瘀、胸痹心痛，适用于冠心病、心绞痛、心肌梗死。主要特点是起效快，作用稳定持久，安全有效，服用方便。药理学研究共做26项试验，用狗100多只，其他动物数百只，证实该药具有多方面药理作用，灌胃给药对狗冠脉结扎的心肌缺血有明显治疗作用，可减轻心肌损伤程度，减小心肌梗死面积。在狗心脏血流动力学及心肌耗氧量实验中证实，该药可增加冠脉血流量，降低左室内压，减少左室做功，降低心肌耗氧量，改善心血管功能。在离体大鼠心脏灌流及体外心肌细胞培养实验中，证实该药可缓解冠脉痉挛，增中冠脉血流量，对体外心肌细胞培养的缺血性损伤及免疫性损伤均有明显保护作用。此外，该药还具调节血流变性、改善微循环、抗血小板聚集、抗血栓形成等药理作用。急性毒性及长期毒性试验未发现有明显毒性。上述试验结果证实该药安全有效。在药学、药理学及毒理学研究的基础上，进行了临床研究，随机分组，对照观察冠心病200例（治疗组及对照组各半数），结果精制冠心冲剂总有效率85%，硝酸甘油停减率84%，未发现明显不良反应。临床研究结果与实验研究结果一致，证实精制冠心对冠心病有较好疗效，值得推广。 （中医药杂志，1994，5（4）：32） 冠心号方及其有效成分对体外培养心肌细胞缺氧缺糖性损伤的保护作用李连达 李映欧 刘志云 高凤辉 张金妹 张京 根据祖国医学“活血化瘀”治则所拟定的冠心号方，在防治冠心病中收到了较好的疗效，实验研究对整体动物的心脏血流动力学及实验性心肌缺血有明显影响。为了进一步探讨冠心号及其有效成分的作用机制，用体外培养的乳鼠心肌细胞，在缺氧缺糖条件下模拟心肌缺血所建立的细胞病理模型，观察了冠心二号方及其有效成分对体外培养心肌细胞搏动功能及缺氧缺糖性损伤影响。 材料和方法1、搏动功能的观测：试验均用培养35天的乳鼠心肌细胞，在带有录相及恒温37装置的OLYMPUS-IMT413型倒置显微镜下选择一个搏动规律的细胞簇作为固定观察对象，记录正常搏动后，用Eagle培养基稀释药物至所需浓度（37）置换出瓶中培养液，稳定一分钟后纪录给药1、5、10、15分钟心肌细胞搏动的频率、节律、范围及强度。每种药物重复5次实验，以给药前搏动频率为100%，计算加入各种药物15分钟搏动频率变化的百分数。2、体外培养心肌细胞缺氧缺糖性损伤模型的建立。心肌细胞在37恒温箱中静置培养2天，进行分组及缺氧缺糖试验。（1）正常对照组：共51瓶，用有糖有氧Eagle培养基。（2）缺氧缺糖组：共51瓶，用不含葡萄糖Eagle培养基，并充以99.99%的高纯氮气（流量1L/分，共20分钟），造成缺氧。（3）缺氧缺糖加药组：共110瓶，用缺糖的Eagle培养基稀释药物，加入培养瓶后，再充以氮气（流量1L/分，共20秒）保证缺氧条件，以上各组均放入37恒温箱中静置培养6小时，再进行乳酸脱氢酶（LDH）的生化测定及细胞化学观测。3、 LDH的化学测定及细胞化学观察：用生化方法测定心肌细胞损伤后释放至培养基中的LDH，以乳酸为基质，加入氧化型辅酶I（DPN、上海效母厂、批号：790616）在pH为10条件下，测定丙酮酸生成量。应用722型光电分光光度计测定光密度，从标准曲线上计算培养基中LDH含量（单位/100ml下同）心肌细胞内LDH的细胞化学反应观察：取出在各组培养瓶中生长有心肌细胞的盖玻片条，应用细胞化学甲替反应，显示细胞内乳酸脱氢酶，镜下观察并拍照。4、 实验用药：1、冠心二号方：由本室制备，每ml相当生药2g，经测定Ph ：4，K+:5.4mEq/L，Na+:17.6mEq/L,实验前用Eagle培养基稀释，其最终浓为:125ug,500ug,1000ug/ml,测定：Ph:7.5,K+:5.7mEq/L,Na+:132mEq/L.Ca+:6.0mg%。2、丹参酮A磺酸钠注射液：（上海第一制药厂，批号：810324，含量5mg/ml）经测定pH：5，K+0,Na+:38.33mEq/L。用培养基稀释最终浓度为102、104、105、106、107、108M，经测定pH:6.5,K+：5.13mEq/L,Na+:132mEq/L,Ca+:8.0mg%。3、川芎嗪（川芎I号碱）注射液：（北京第四制药厂，批号：800504，含量20mg/ml）经测定Ph:3,不含K+,Na+,Ca+。实验前用培养基稀释最终浓度为103、104、105、10 6、107、108M，测定pH:6.5,K+：5.13mEq/L,Na+:132mEq/L,Ca+:8.0mg%。4、没食子酸乙脂：（湖南医药工业研究所，植化室从赤芍分离提取的单体，分子量198）实验前用培养基稀释最终浓度103104、105M，经测定Ph:7.27.4,K+:4.98mEq/L,Na+:127mEq/L,Ca+:9.5mg%.5）儿茶精：（湖北医药工业研究所植化室从赤芍分离提取的单体，分子量290）实验前用培养基稀释最终浓度103、104、105M，经测定Ph:7.2,K+:5.27mEq/L,Na+:132mEq/L,Ca+:9.02mg%.结果冠心二号及其各有效成分对心肌细胞搏动功能的影响冠心二号方对心肌细胞搏动功能的影响：心肌细胞培养瓶中加入50ul培养基与不加任何药物者相比，对心肌细胞搏动的频率、节律、范围及强度均无明显影响。以培养基稀释为125mg/ml,250mg/ml,500mg/ml,1000mg/ml,四种浓度的冠心二号方各3ml，分别换入培养瓶内，稳定一分钟后开始观测。各重复五次试验。 冠心二号方125mg/ml，可使心肌细胞搏动频率减慢25.89%（P0.05）,浓度增加至250 mg/ml及500 mg/ml时，则波动频率进一步减慢44.62%、62.05%（P0.05）,而搏动的节律、范围及强度均无明显改变；当浓度提高至100 mg/ml时，心肌细胞搏动的频率进一步减慢66.82%（P0.01），偶见节律失常，搏动的强度及范围均减弱，说明冠心二号方随着浓度的提高，对体外培养心肌细胞搏动的抑制作用逐渐加强。丹参酮A磺酸钠对心肌细胞搏动的影响：以培养基稀释最终浓度为103、104、105、106、107M的丹参酮A磺酸钠，分别换入培养瓶内。可见给药浓度为107M时，心肌细胞搏动频率增加86.2%，当浓度为105时，搏动频率进一步增加104.8%，同时波动的节律规则，范围加大，搏动加强。但至103M时，搏动品率明显减慢，说明丹参酮A磺酸钠对心肌细胞搏动有一定的兴奋作用，随着浓度增加搏动频率亦相应增加，以105M最明显，但浓度过高则对心肌细胞搏动产生抑制作用。川芎嗪对心肌细胞搏动的影响:以103104、105、106、107M的川芎嗪，分别换入心肌细胞培养瓶内，可见随着浓度的增加，搏动频率亦相应增加，搏动稍有增强，范围无明显变化，偶见心律失常。没食子酸乙酯与儿茶精对心肌细胞搏动的影响：两种药物以103104、105M三种浓度分别换入心肌细胞培养瓶内，结果对心肌细胞的频率、范围及强度均无明显影响。 冠心二号方及其有效成分对缺氧缺糖性心肌细胞损伤的保护作用1） 缺氧缺糖时间对心肌细胞损伤释放LDH的影响：取心肌细胞42瓶，随机分2组，各21瓶。 一组按上述方法缺氧缺糖，另一组作对照。在缺血缺糖1、2、3、6、9、12及24小时，分别从各组中取3瓶，测定培养基中LDH，结果说明，缺血缺糖3小时后释放LDH量明显增加。6小时后更为明显，（缺氧缺糖组为7910.21，对照组为453.75，P0.01），至12小时LDH释放达到较高水平，并保持至24小时以上，因此选用缺氧缺糖6小时进行试验。2） 冠心二号方不同浓度对缺氧缺糖性心肌细胞损伤释放LDH的影响：共用40瓶心肌细胞，分5组，结果：缺血缺糖组对照组释放LDH量有明显差异（分别为88.583.34及34.822.82，P0.001），缺血缺糖组与缺氧缺糖加药组对比，可以看出冠心二号方在最终浓度为125ug/ml时，对心肌细胞损伤尚无明显保护作用，在浓度为250、500、1000ug/ml时均有保护作用。 细胞化学观察; 正常对照组心肌细胞LDH颗粒均匀地分布于细胞质内，呈蓝紫色反应，细胞有足突，核膜清楚，细胞生长良好，缺血缺糖组大部分细胞足突消失，细胞体积小于正常对照组，看不到均匀酶颗粒，缺氧缺糖加药组观察了 冠心二号125ug/ml，250ug/ml，500ug/ml，1000ug/ml四种浓度，结果低浓度组保护作用不明显，另三组有不同程度的保护作用，镜下观察多数心肌细胞的变化减低，类似于正常对照组细胞，足突尚存，酶颗粒均匀分布于细胞质内，核膜清楚，但细胞体积较小于正常组，另有少量细胞的变化与缺氧缺糖组相同。3） 冠心二号方各有效成分对心肌细胞缺氧缺糖性损伤的保护作用：共有60瓶心肌细胞，结果正常对照组与缺氧缺糖组有显著差异（P0.01），缺氧缺糖组与缺氧缺糖加儿茶精或没食子酸乙酯或川芎嗪组比较，以上三种药物在最终浓度为105M时对缺氧缺糖性心肌细胞损伤未观察到明显的保护作用，丹参酮A磺酸钠对缺氧缺糖性心肌细胞损伤似有保护作用，故对丹参酮A磺酸钠作了进一步的研究。4） 丹参酮A磺酸钠不同浓度对培养心肌细胞缺氧缺糖性损伤的保护作用：共有50瓶心肌细胞，以丹参酮A磺酸钠三种最终浓度103、104、105M，观察了对心肌细胞缺氧缺糖性损伤的保护作用（结果见图881）。实验表明，丹参酮A磺酸钠只有最终浓度高达103M时对培养的心肌细胞缺氧缺糖性损伤才有保护作用。表881 丹参酮A磺酸钠不同浓度对培养心肌细胞缺氧缺糖性损伤的保护作用 缺氧缺糖 缺氧缺糖 缺氧缺糖 正常组 缺氧 加丹参酮 加丹参酮 加丹参酮 缺糖组 103M 104M 105M No 10 10 10 10 10LGH 30.453.46 68.702.71 30.534.27 73.737.50 63.452.13P 0.001 0.05 0.05 讨论 利用体外培养乳鼠心肌细胞在不受神经、体液等因素的影响下，观察了冠心二号方及其有效成分对心肌细胞搏动功能的影响及对缺氧缺糖性损伤的保护作用。冠心二号对体外培养心肌细胞的搏动频率有减慢作用，而丹参酮A磺酸钠及川芎嗪（103107M）可使搏动加快。这些结果均与整体动物实验相符。但儿茶精及没食子酸乙酯（105103M）对心肌细胞搏动均未见明显影响。结果表明本实验所用的几种有效成分对心肌细胞的直接影响各不相同。与冠心二号全方亦不一致，说明任何单一成分均不能代表全方所含多种成分相互作用的综合效应。 体外培养乳鼠心肌细胞在缺氧缺糖条件下可形成实验性心肌细胞损伤模型，国外文献称之为培养心肌细胞的“缺血性”损伤（Ischemie myocardial injuryin cultured heared cells）心肌细胞受损伤后，细胞内LDH漏出至培养基中，以LDH为指标可以测定不同药物对心肌细胞损伤的保护作用。本实验证实冠心二号方对心肌细胞缺氧缺糖性损伤有直接保护作用，可使细胞内LDH漏出明显减少，但冠心二号方中个单一有效成分（105M）除丹参酮A磺酸钠外，均未观察到明显保护作用，这可能与药物剂量有关，有待今后进一步研究。 据报道，心肌细胞缺氧缺糖性损伤后，酶从胞浆中漏出，与细胞膜的功能受损有关。甲基强的松龙具有一定的保护作用，可使LDH漏出减少，其作用机制主要是稳定缺血心肌细胞膜的功能，我们曾发现心得安对培养乳鼠心肌细胞缺氧缺糖性损伤有一定的保护作用，可能与心得安具有稳定细胞膜，改善线粒体功能，减轻线粒体水肿等作用有关，文献报道，丹参酮A磺酸钠103M浓度时对兔和羊的红细胞膜有明显的保护作用。冠心二号方及丹参酮A磺酸钠对体外培养心肌细胞“缺血性”损伤的保护作用，可能是通过稳定心肌细胞膜，保护线粒体及溶酶体，增加耐缺氧能力，而保护心肌细胞，减轻损伤程度，这些机制有待进一步探讨。 参考文献1. 陈可冀.中医杂志，1979，（9）：5632. 北京地区防治冠心病协作组.中医杂志，1978，（8）：4043. 中国医学科学院阜外医院等.心脏血管疾病，1974，2（4）：2534. 北京地区防治冠心病些协作组.新医药学杂志。5. 中医研究院西苑医院基础研究室药理组.新医药学杂志，1978，7：576. 李连达，等.冠心二号方的进一步研究。（待发表）7、李连达，等。心肌细胞培养，内部资料。8、李连达，等。中华心血管病杂志，1980，8（2）：1419、李连达，等。中医杂志，1980，6：687010、Harary I ,et al.science11、Maruin WJ,et al,Circ Res12、lau yh,et al,circ res13、Acosta D,et al.in vitro14、Acosta D,et al.in vitro15、Acosta D,et al.in vitro16、Laarse AVD , et al. J Mol Cardiol17、Laarse AVD , et al.Cardiovscular Res18、李连达，等。野菊花提取物CE-2对培养乳鼠心肌细胞缺氧缺粮性损伤的保护作用，中西医结合杂志19、朱忠勇，等。临床医学检验，上海：上海科学技术出版社20、北京医学院组织胚胎教研组，组织化学讲义21、王志敏，等。全国第一届心血管药理专业会议论文摘要汇编（心肌细胞培养在中医药研究中的应用）冠心号方四种有效成分对体外培养心肌细胞免疫性损伤保护作用的研究李彩熙 张金妹 李洪海 王 智 张 京高凤辉 刘志云 尚小泓 李燕娜 周庆保李连达 指导根据“活血化瘀”治则拟定的冠心号，临床证明以冠心病有较好的疗效1，2，它可使症状缓解，心电图改善，逐步增加冠状循环指数，改善微循环，并在动物实验中观察到具有增加冠脉血流量及供氧量，保护心肌缺血，抑制ADP胶原诱导的血小板聚集以及降低血脂等作用3，4。但是，冠心号方在冠心病的治疗和实验研究中关于免疫机理方面的工作很少，本试验用心脏组织致敏的大白鼠淋巴细胞对体外培养的大白鼠心肌细胞的细胞毒性来造成免疫性心肌损伤，然后观察冠心号方有效成分如：丹参酮A磺酸钠、川芎嗪、儿茶精及没食子酸乙脂的保护作用。以形态学方法和同位素51Cr释放率为指示，检查心肌细胞损伤的程度，来研究冠心号方某些有效成分的作用。 1、 材料和方法1.1 药物（1）丹参酮A磺酸钠注射液：上海第一制药厂产，批号810324，含量5mg/ml，测K+：0，Na+:38.33mEq/L。（2）川芎嗪注射液：北京第四制药厂产，批号291330，含量20mg/ml，测K+：0，Na+0，Ca+：0。（3）儿茶精：由湖南医药工业研究所植化室从中药赤芍分离提取，分子量290，K+：527mEq/L,Na+:132mEq/L,Ca+:9.0mg%。（4）没食子酸乙酯：由湖南医药工业研究所植化室从中药赤芍分离提取，分子量198，K+：4.90mEq/L,Na+:127.6mEq/L,Ca+:9.5mg%。1.2 动物试验用150200g Wistar种大白鼠。1.3 体外培养心肌细胞（靶细胞）试验用体外培养23天的大白鼠乳鼠心肌细胞，其培养方法参看文献5，并在培养瓶中放入盖玻片条。1.4 致敏淋巴细胞的制备（效应淋巴细胞）（1）抗原：根据I.Friedman等6方法制备抗原，用150200g Wistar种大白鼠在无菌条件下取出心脏、肝脏组织，移到盛有冷生理盐水的烧杯或平皿中，轻轻剥离除去被膜、脂纺组织及血块，用冷生理盐水洗3次，剪成块，放入高速度组织捣碎机内捣碎23分钟，制成20%组织匀浆，放入冰箱备用。以上操作均在冰浴中进行。（2）免疫：将上述组织抗原用含有5mg/ml卡介苗的福氏完全佐剂等量混合乳化成乳剂，给大白鼠四脚掌各注射0.10.2ml免疫。（3）细胞悬液的制备：参照张绍元等方法7制备。免疫后1012天，在无菌条件下取出四肢局部淋巴结，放到盛有冷Hanks液的平皿中轻轻剥离除去脂肪、连接组织及血块，冷Hanks液洗3次，然后切成碎块，移到离心管中加适量的冷Hanks液，用毛细管吹打使细胞分散，然后在冰槽是中静置5分钟，使组织块沉下去，吸取上清放到另一个离管中，将沉淀用同样的方法分散细胞3次。收集含有分散细胞的上清液15002000转/分离心5分钟，洗3次。最后用含10%20%小牛血清的Eagle液悬浮细胞。用血球计数器计总细胞数和死细胞数，用于细胞毒试验的淋巴细胞经台酚蓝染料排斥试验死细胞不应超过10%。试验用心脏组织匀浆福氏完全佐剂抗原致敏的大白鼠淋巴细胞，对照组用肝脏组织匀浆福氏完全佐剂抗原致敏的大白鼠淋巴细胞（简称肝脏对照），生理盐水福氏完全佐剂抗原致敏的大白鼠淋巴细胞（佐剂对照）和正常大白鼠淋巴细胞（简称正常对照）。1.5 淋巴细胞的细胞毒性度验方法淋巴细胞的细胞毒性试验参照菊地洁吉和北医7，33的方法稍加改进。体外培养3645小时的心肌细胞培养瓶中，在无菌操作下加入含20%小牛血清的Eagle培养液悬浮的淋巴细胞悬液（浓度为3000万/ml）3ml，置37度恒温箱中孵育。在培养不同时间10分、30分、60分、3小时、6小时、12小时及24小地取出培养瓶中的盖玻片条，用无菌生理盐水仔细冲洗，并用瑞氏姬姆萨染色液复染，在光学显微镜下观察形态变化。没加玻璃条的培养瓶在3小时和24小时两个时间点，在倒装显微镜下观察动态变化。1.6 用51Cr释放作淋巴细胞细胞毒性试验方法：参照菊地洁吉的方法7稍加改进（1）靶细胞的标记：取每毫升含0.73107个心肌细胞悬液1ml加入3060 ci51Cr-Na51CrO4 在37普通恒温箱中温育60分钟，随时振荡，标记完之后2000转/分离心10分钟，去掉上清，用10%小牛血清Eagle清3次，最后用培养液稀释成5105/ml浓度的细胞悬液作为靶细胞备用。（2）效应细胞：效应淋巴细胞的制备方法同方法（四），其浓度为15107/ml。（3）细胞毒性试验：将标记靶细胞分装于小试管（直径1.310cm ）内每管0.5ml，再加入0.5ml效应细胞，总体积为1ml，每组3管，另取3管各分装0.5ml标记靶细胞和0.5ml培养液作自然释放对照组，37温育3小时。另取3管各分装0. 5ml标记靶细胞，再加1.5ml蒸馏水，反复冻融3次，作最大释放对照组。取出试验各管用井型r计数器测定总放射性强度cpm，然后每管经2000转/分离心10分钟，分别取0.5ml放入另一个空管中测上清液的放射性强度cpm。冻融管离心后分别取上清液1ml测放射性强度cpm。淋巴细胞特异杀伤作用以51Cr特异释放率来表示，按下列公式计算：每管靶细胞51C释放率=每管上清cpm/每管总cpm100每组靶细胞特异释放率=（试验管释放率均数自然释放率均数）/（最大释放率均数自然释放率均数）100在本试验中自然释放率一般控制在20%以下，最大释放率在80%95%之间。1.7 冠心号方几种有效成分对心肌细胞免疫性损伤保护作用的试验（1）细胞毒性试验的形态学方法（五），但在试验组每瓶心肌细胞中加入不同浓度的各种药物0.05ml，对照组包括不同浓度中药对照和致敏淋巴细胞对照。（2）细胞毒性试验51Cr释放率测定试验方法同前，但在试验组每管中加入致敏淋巴细胞的同时加入不同浓度的中药。2、 结果2.1 致敏淋巴细胞对体外培养心肌细胞的损伤作用把心脏组织匀浆致敏的淋巴细胞加到体外培养心肌细胞之后10分钟在光镜下观察，心肌细胞已有不同程度的变化：1、心肌细胞足突消失，细胞逐渐变圆或椭圆型；2、细胞固缩，体积减小，浓染；3、胞浆内形成大小不等的空泡或颗粒增多；4、细胞胞浆破裂只剩下变形的核或胞浆碎片和颗粒；5、淋巴细胞浸润在胞浆内；6、心肌细胞和淋巴细胞形成细胞团而被浓染等病变的细胞散在于正常心肌细胞之间，随着温育时间延长，病变加重，范围扩大，3小时病变细胞达半数以上，6小时大量细胞脱壁，24小时大面积细胞从瓶壁脱落或只有极少数病变的细胞散在于瓶壁上，然而肝脏对照组和佐剂对照组虽然有淋巴细胞的浸润，但直到24小时仍保持完整的单层心肌细胞，说明被致敏的淋巴细胞能特异地识别抗原并与它起作用，大白鼠正常的淋巴细胞对体外培养心肌细胞无损伤作用。2.2冠心号方几种有效成分（丹参酮A磺酸钠、儿茶精、川芎嗪及没食子酸乙酯）对体外培养心肌细胞免疫损伤的保护作用（1）形态学观察：根据本文淋巴细胞毒性试验结果，实验第3及24小时在光镜下观察几种有效成分对损伤的保护作用。处理方法同前。结果表明：不同浓度的丹参酮A磺酸钠对心肌细胞免疫性损伤有明显保护作用。对照组同前所述3小时后大量淋巴细胞浸润，形成大小不等的空泡，颗粒增多，足突消失，细胞变形，胞浆破裂，核变形等，到24小时大面积心肌细胞脱落。然而加入丹参酮A磺酸钠的试验组，随着浓度的增加淋巴细胞浸润减少，病变减轻，至24小时心肌细胞仍保持单层细胞。当培养基中丹参酮A磺酸钠浓度增到2.110-4M时在心肌细胞中淋巴细胞的浸润很小，细胞膜及核膜较完整，但胞浆内有很多大小不等的空泡，只加2.110-4M药的对照管中心肌细胞较稀少，体积变小似乎生长不良，而加至2.110-5M时没有这种现象，可能与高浓度时药物本身的毒性作用有关，即高浓度（2.110-4M）的丹参酮A磺酸钠对淋巴细胞的毒性作用有明显的抑制作用，而对心肌细胞也有一定的毒性作用，因此，在其他试验中均用低于2.110-4M的浓度。儿茶精、没食子酸乙酯等分别加到培养瓶后最终浓度为1.610-5M和1.610-6M，观察了对心肌细胞免疫性损伤的保护作用。结果表明1.610-5M时儿茶精，没食子配乙酯，川芎嗪均有不同程度的保护作用，儿茶精最明显，川芎嗪最差，没食子酸乙酯在两者之间。而1.610-6M浓度时三者保护作用均不明显，经24小时后心肌细胞损伤较重，并脱落。（2）动态变化的观察：根据上述试验结果，选择丹参酮A磺酸钠2.110-5M浓度用不同的方法加到心肌细胞中，在倒装显微镜下观察其动态变化。对照组为把致敏淋巴细胞加入到心肌细胞中，试验第一组为把丹参酮A磺酸钠和致敏淋巴细胞同时加到心肌细胞中；试验第二组为先把丹参酮A磺酸钠加到心肌细胞中作用20分钟后再加入致敏淋巴细胞；第三组为先把丹参酮A磺酸钠加到致敏淋巴中作用20分钟后南加入心肌细胞中。各组均在37温育，至3小时和24小时后倒装显微镜下观察。对照组，3小时后主要变化为细胞变形（足突消失，变圆），淋巴细胞浸润，24小时后绝大多数细胞从瓶壁上脱落下来，然而各试验组3小时后，以少量淋巴细胞浸润为主，无心肌细胞变形，多数单个细胞仍有节律性自发性的博动，24小时仍保持完整的单层细胞，并观察到胞浆还很饱满。有趣的是3小时观察之后换液，把多余的淋巴细胞和药物倒掉，继续培养1836小时，并进行观察。结果，试验第一组在18小时多数心肌细胞变形、脱落，找不到正常心肌细胞（与对照组相似），而试验第二、三组直至36小时时仍保持单层的心有细胞，可见到第三组心肌细胞比第二组生长更饱满。从上所述结果说明丹参酮A磺酸钠对淋巴毒性引起的体外培养心肌细胞的损伤确有保护作用，其作用机理有待进一步研究。（3）51Cr释放率测定：当用51C标记的心肌细胞（靶细胞）与已被同种抗原致敏的淋巴细胞（效应细胞）作用时靶细胞被破坏并释放51Cr到培养基中，测定其放射性强度(cpm)可作为靶细胞损伤程度的指标并用于观察药物的保护作用。实验中应注意标记靶细胞51Cr自然释放率的控制和靶细胞与效应细胞适当比例的选择。1）不同温育时间对标记靶细胞51Cr自然释放率的影响：结果见表。表89-1 不同时间靶细胞51Cr自然释放率的比较 时间（小时） 3 24 试验1 10* 33.2 试验2 13.45 29.0 试验3 7.3 30.49 X 10.25 30.89*单位为百分率(%)2）靶细胞和效应细胞的比例对特异释放率的影响：靶细胞和效应细胞比例为1：50，1：100，1：200和1：300，37作用3小时后检测特异释放率，随着效应细胞比例的增加，特异释放率也增加，为了在较短时间内得到较好的试验结果，两者的比例定为1：300。3）保护试验结果丹参酮A磺酸钠不同浓度和效应细胞加到标记靶细胞中，37作用3小时，四个给药组和对照组的特异释放率。试验结果对照组（V组）特异释放率为21.111.06，试验组（、和）分别为4.2351.13,3.442.57,63.88和6.465.39，与对照组比较经统计学处理均有显著差异。I组：靶细胞+效应细胞+丹2.110-5M； II组：靶细胞+效应细胞+丹2.110-6MIII组：靶细胞+效应细胞+丹2.110-7M ; IV组：靶细胞+效应细胞+丹2.110-8MV组：靶细胞+效应细胞，不加任何药物。（分别为P0.001,P0.001,P0.01和P0.05）。4）丹参酮A磺酸钠对致敏淋巴细胞直接作用的观察：为了观察丹参酮A磺酸钠对致敏淋巴细胞是否有直接杀伤作用，在1000万/ml致敏淋巴细胞中，加入丹参酮A磺酸钠至最终浓度为2.110-5M和2.110-7M，37温育30，60及180分钟，以台酚蓝染料排斥试验观察其死细胞比例，结果见表89-2。表89-2 丹参酮A磺酸钠对致敏淋巴细胞直接作用的比较 时间（分） 0 30 60 180 致敏淋巴细胞 3.3 3.0 4.49致敏淋巴细胞+2.110-5M丹 2.9* 3.4 3.15 4.5致敏淋巴细胞+2.110-7M丹 3.5 2.8 4.56*死细胞百分率%从表可见致敏淋巴细胞在试管内随时间的延长增加死细胞比例的趋势，但是加药物无明显差异，初步认为丹参酮A磺酸钠对致敏淋巴细胞没有直扫杀伤作用。3 、 讨论3.1 心血管病和免疫的关系免疫系统是机体重要的防御机构。免疫应答的异常可致机体生理机能的失调和组织损伤，即在某机体受抗原（包括异种抗原，同种异体原及自身抗原）剌激后，出现特殊的致敏状态，当同种抗原再次进入已经致敏的机体时，即可与体内形成的特异性抗体或致敏淋巴细胞发生反应导致组织损伤8，10。心血管系统是这种变态反应性炎症易发生的脏器中有代表性的一系统9，如果心脏和血管组织成分由于某种原因11，12而在血中出现，首先与免疫活性细胞T、B细胞接触，这时在某种情况下错认为非已产生抗体并致敏淋巴细胞，经一系列复杂的机制引起血管壁损伤。血管壁的损伤是血浆脂类沉积在动脉内壁的重要条件，是引起动脉纤维性增厚的直接原因，从而直接或间接地引起冠心病，心肌及心内膜自身的炎症性病变811，1315，19，25。近年来随着免疫学的发展，不仅由风湿性心脏病、心肌炎及心肌梗死等患者血清中检测到抗病人自己心脏组织的自身抗体（心脏反应抗体）1517，而且在其末梢血淋巴细胞中被证明对体外培养人胚心肌细胞有细胞毒性作用的效应淋巴细胞11，16，18，在尸检研究中显示心肌和瓣膜中免疫球蛋白和补体的存在，心肌间质结缔组织和血管周围可见到淋巴细胞和多核白细胞的浸润8，9，17。从上所述充份说明心血管病与机体免疫功能有密切关系，近年来随着细胞生物学的发展，利用体外培养心肌细胞造成体外培养心肌细胞免疫性损伤来研究其病因学6，2024证明在心血管病发病中抗体、补体、致敏淋巴细胞及一些活性物质起很重要的作用，然而致今其因果关系还不十分清楚。在我们的试验中把心脏组织致敏的淋巴细胞加到体外培养心肌细胞时引起心肌细胞的损伤，其损伤的程度决定于致敏淋巴细胞的质量数量及其作用时间。而肝脏组织致敏的淋巴细胞对体外培养心肌细胞的细胞毒性或仅有少量的淋巴细胞浸润，可见有较高的器官特异性。佐剂对照有轻微的细胞毒性，明显低于心脏致敏的淋巴细胞，与I.Friedman得到的结果一致，可能是卡介苗非特异性的致敏淋巴细胞的结果而引起的。正常大白鼠的淋巴细胞对体外培养心肌细胞没有细胞毒性作用。提示可以在体外造成心血管系统的病理模型作为进一步研究其病因学、药理学及药物免疫学的一种手段。3.2 冠心 号方的几种有效成分对体外培养心肌细胞免疫性损伤的保护作用活血化瘀为中医常用的祛邪方法。这类药多数认为对特异性免疫有抑制作用。北医用“肾炎化瘀汤”治疗急、慢性肾炎、过敏性肾炎取得了较好的疗效，以白细胞移动抑制试验和免疫荧光检查，结果提示该方有抑制细胞免疫和体液免疫的作用26。还有用活血化瘀药物为主的“益肾汤治疗慢性肾炎取得较好的疗效，其机制是抑制了免疫反应所造成的肾小球毛细血管基底膜的损伤，证明具有抗变态反应性炎症的作用27，28。首都医院产科用活血化瘀药预防ABO型新生儿溶血性黄恒取得了较满意的效果，进行溶血空斑试验和血清凝集反应试验证明该方抑制了体液免疫29，从上所述运用活血化瘀治疗和其中药防治免疫性疾病已取得了一定的成就。本试验用丹参、赤芍及川芎中提取的有效成分丹参酮A磺酸钠、儿茶精、没食子酸乙酯及川芎嗪，观察了对体外培养心股细胞免疫性损伤的保护作用，结果表示几种有效成分均有不同程度的保护作用，其作用机制还不清楚。S.N.Bykovskaja等认为致敏淋巴细胞与携带相应抗原的靶细胞接触时被激活并释放多种淋巴因子3032，同时刺激靶细胞改变其膜的通透性34等经一系列复杂的机制溶解、破坏靶细胞。因此，效应细胞必须与靶细胞直接接触才能产生毒性作用，本试验支持这个观点。在本试验中当丹参酮A磺酸钠和效应细胞先作用20分钟后再加入到心肌细胞作用或者丹参酮A磺酸钠心肌细胞先作用20分钟后再加入效应细胞时保护作用比丹参酮A磺酸钠和效应细胞同时加入到心肌细胞为好，这些结果提示丹参酮A磺酸钠可能作用于淋巴细胞抑制它被激活或作用于靶细胞保护其膜的通透性。初步试验表示丹参酮A磺酸钠对致敏淋巴细胞没有直接杀伤作用。决之，其作用机制有待进一步研究。本文的初步结果表时冠心号方对心血管疾病的治疗作用不仅限于改善冠脉循环，预防血栓形成和促进血栓溶解及降血脂等作用，而且在调整、稳定免疫系统功能方面起一定的作用。3.3 对方法学的评价细胞溶解性T淋巴细胞是胸腺依赖淋巴细胞的一种亚型，直接和靶细胞接触，经一系列的复杂机制将靶细胞杀伤和破坏。在免疫的人和动物淋巴细胞中只有少量（1%2%）效应淋巴细胞具有细胞毒性作用。淋巴细胞毒性试验，反应是直接的，较简便，重复性好，目前在临床和实验研究中已被广泛使用。本试验以形态学（定性）和51Cr释放率（定量）测定方法进行淋巴细胞毒性试验，较客观的反映靶细胞（心肌细胞）损伤的程度及药物保护作用。结果表明今后在实验室研究工作中这是一种可以利用的简便、可靠的方法。但在某些方面还需要进一步改进。比如，形态学方法的定量化以及如何把51Cr自然释放率降低到一定的水平等。89.4 小结（1）本试验用大白鼠心脏组织致敏的大白鼠淋巴细胞对体外培养大白鼠乳鼠心肌细胞的细胞毒性来造成心肌细胞免疫性损伤模型，结果表明其损伤有高度的器官特异性，为进一步中西医结合研究心血管病的病因学、药理学、药物免疫学等提供一种手段。（2）冠心II号方几种有效成分对这种损伤有不同程度的保护作用。并对其作用原理进行了初步探讨，推测冠心II号方在机体内调整、稳定免疫系统功能方面起一定的作用。参考文献1、中医研究院西苑医院，活血化瘀冠心II号方药及有关资料汇编。2、中国医学科学院阜外医院，中医研究院，心血管疾病，1978，63、北京地区心血管协作组，新医药杂