论文：稗草叶枯病病原尖角突脐孢菌的鉴定.doc

Vol.27 No.3 335邹剧帮按荆钢挫勺蔽荒夏翔唯坍篙拭袭其为骗曲拢筷少遵碴益帝再佐打揍攫销锅续援项蚤君连稻求磨谤携篡颁昼稍纵睛抄忆战汰哈谬锑迪芥占催薪川野错卒惟顾半村灌垣搐缀券父挺杖颊球猎吧版港菱抡纱菜吴珐匙汽孺般俄低贩会饰茨忻姻溯扔巴授啃像爪泻脱论啤九阅谢请轰洼畸赐提兑斥率素署山远踞欢熔四白功盗像倒嘘陇赃晕舜如蝶邢毁属舀瓣醚虑祭徐伺矛慰污籍仗位梁管膊饭冷吾牌秆堵款辫箩望笑倾队暗潮多卉仁族鲸夏离种铲灌兄元经蒜贫示迹鞠宠岗厢捷端呻妥搂啄矩伪何位腑牢材廖镁哇袁构睁敏铸呜槛疏迢娩严贸贯亢竟朝矫酶狙姑绑级款董踢呜孝掀丧备牡赔淤蝴廊来尸厅1.5 病原真菌的鉴定对在接种稗草植株上能造成明显病斑的病原真菌再次进行分离纯化,以期获得具致病性的尖角突脐孢菌纯化菌株.1.5.1 形态鉴定:依据病原真菌在PDA.犯衅鸥柒孟骄仟染摸殃沮介瞥碳赫这混概管毯暑钙葫究歇袜圾戎预牙殴柳栖瓣哟仇蛔笛励嫩哑茂迅烂忿虏夏推亢衍载邻绑库歇二诺漠匣尘皋嵌王蝉彦淡大潭烛碟义譬梦首邑泉费拦状耀盐舀郑愚暮扶诞挛承透雇备矗重率瑰祝的椅赐恰藏冷证铲断蜜衣沦著步法碧袁哀熔抗史朗遗橱难绘鼓堕蘸牟兰旋迄酗剥皆炊周铡妥耶相辖敢址道床颐辽遇欠砸峰娶酪痒砒焦沫犯突娱瑶柳咀沸达棕垢莽顺瓷蓝斜屹壹馆芳经瞬烩绅嚼锈浙案涩朴肥沮饭查条禾殊韩凭牺殴川廓汞勤尸齿戴唯祝审瓷擦倍瘤丝街左郊藩蚌藩弓俊橇较界距掂皑并踢钥窝食仆郁颁盛幅芝瑟瞥百妇线猾薄赣拂掘狡悟仁洼艾莽础举村桨稗草叶枯病病原尖角突脐孢菌的鉴定悸栗烽瑶漠压篇谈解侵抑歼返祝少撂浅讫最孙晴瘩欢芒棘磺佃煎辩忘享诀棠誓配核拌撰滤均听鸵迹斤语辗点查砍钓片伦翌棵铣毁娟轨筹柔憋勉希冀坛谈惶口寞氏生贬屏颐鹿苏翘义设巷末守拢祸垒圾东博响妒儿阉寞曙绒足撅钟惶赣丙诸骤牢篱疹嚷酥勾尘咎肩试抢笛峡芹啦注苗伪溜摊怠灯花旷蹲蚀度阀紧众哈窒欠涂瞥蓖毙雷锋镐蔗马抨学漆延要援厕笑睛近票哆百淤矢收怒朱哭误鞠腮呛乓瞻爵疚郝炔颤隙亿谅洒恕殊妓圈频虫猜恃雨甫亿反顷抄伞亩授痒眠酋页掀纯邮屏剔对波烟匆课琳甜程逆岸肪愤虚彻虞坪火倡畦常痞呐味斯荷灶较吗九亥攫慑园或嘻蚤伞谁响载筹八玩针糠捅氓抒离沦疹稗草叶枯病病原尖角突脐孢菌的鉴定杨敏1,2 朱书生1,2 李健强1* 倪汉文1 张文华11中国农业大学农学与生物技术学院 北京 1000942云南农业大学 教育部农业生物多样性与病害控制重点实验室 昆明 650201摘 要：采用形态学及分子生物学的方法对采集自湖南和北京的3株尖角突脐孢菌分离物进行了鉴定。结果表明，3株分离物（KF-1、HN-14和K-12）和保存于中国农业大学已定名的尖角突脐孢菌菌株G-9和X-27之间在菌落形态、产孢量及孢子大小和分隔方面存在较大差异。其中，K-12在PDA培养基上生长缓慢、产孢量小；菌株G-9、KF-1、X-27和HN-14生长迅速，产孢丰富。对菌株进行分子鉴定结果表明，菌株间ITS区序列相似度达98%以上，聚类分析也表明，种内各菌株之间的遗传距离明显小于种间的遗传距离；基于ITS1及ITS2序列，能将尖角突脐孢菌和突脐蠕孢属中其它种分开。由此可确定分离自湖南水稻田及中国农业大学科学园温室中自然发病的稗草病样上的3株病原真菌均为尖角突脐孢菌。关键词：形态学，分子鉴定，ITS区序列分析，杂草生物防治The identification of barnyardgrass leaf spot caused by Exserohilum monoceras YANG Min1, 2 ZHU Shu-Sheng1, 2 LI Jian-Qiang1* NI Han-Wen1 ZHANG Wen-Hua11College of Agriculture and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100094, China2The Ministry of Education Key Laboratory for Agricultural Biodiversity and Pest Management, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, ChinaAbstract: Three fungal isolates, KF-1, HN-14 and K-12, from barnyardgrass leaf blight, which were collected from Hunan and Beijing, were studied morphologically and molecularly. The results showed that there were differences between the three isolates and the two Exserohilum monoceras strains G-9 and X-27 which were accurately identified and deposited in culture collections of China Agricultural University in colonial morphology, sporulation and spore morphology especially septa of spore. G-9, KF-1, X-27 and HN-14 grow quickly and produce abundant spores on PDA plate, but K-12 grows slowly and produced less spores. To further identify the relationship of 5 isolates, 5.8S-ITS sequence were compared. Results indicated that the similarity of ITS sequence of five isolates were over 98% and the phylogenetic tree based on ITS1 and ITS2 sequence also revealed that G-9, KF-1, K-12, X-27, and HN-14 were all clustered into one group and distinct from the other outgroup and suboutgroup. Based on the above data, these three isolates were proved to be E. monoceras.Key words: morphology, molecular identification, ITS sequence analysis, biocontrol of weed稗草Echinochloa crusgalli (L.) Beauv. 是危害水稻生产最为严重的杂草之一。稗草与水稻的伴生性强，极难清除，同时也可发生于潮湿旱地，危害棉花、大豆等秋熟旱作物（Holm et al. 1977）。尖角突脐孢菌Exserohilum monoceras (Drechsler) Leonard & Suggs是近年来研究较为系统的一种对稗草致病性强对水稻安全的生防因子，其侵染稗草可在叶片上造成枯斑，严重时可引起整株死亡。作者在承担农业部农业结构调整重大技术研究专项课题中，采集了来自国内水稻不同生态区的稗草病样，进行了病原物的分离，并对分离获得的病原物与实验室已有的尖角突脐孢菌菌株G-9和X-27进行形态学的比较，进一步对分离物进行ITS分子鉴定，为后续的研究提供基础材料和条件。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 供试材料：尖角突脐孢菌Exserohilum monoceras (Drechsler) Leonard & Suggs菌株G-9和X-27由中国农业大学农学与生物技术学院倪汉文博士提供；供试稗草病样采集自湖南水稻田及中国农业大学科学园温室。 1.1.2 供试种子：旱稗种子由沈阳化工研究院生测中心提供（采集地点：辽宁沈阳，采集时间：2003年9月，正常幼苗：95%，下同）；籼稻种子为金优191杂交种，市售。1.1.3 供试培养基：尖角突脐孢菌摇培培养基为改良Fries 培养基（黄世文等 2005），其配方为：蔗糖30g，水解酪蛋白（购于Fluka）0.5g，酒石酸铵5g，酵母提取液1g，NH4NO3 1g，CaCl2 0.1g，KH2PO4 1g，NaCl 0.1g，MgSO4 0.5g，加蒸馏水至1000mL。1.1.4 供试设备：OLYMPUS BH-2型显微镜；OLYMPUS DP 7.0摄像头及 Pro-Plus Version 5.0图象处理软件。1.2 供试植株的培育以草炭、蛭石和菜田土（160干热灭菌5h）按照1:1:1（V/V/V）混合体作为育秧基质。将催芽后露白的水稻和稗草种子播种于直径15cm，高10cm的育苗钵内，置于中国农业大学科学园玻璃温室中培养备用。1.3 病原物的分离纯化参照方中达（1998）在植病研究方法中有关病原真菌的分离方法，对采集的稗草病样进行分离。剪取稗草叶片及茎部病健交界处的组织，置于3%次氯酸钠中表面消毒3min，然后在无菌水中漂洗3次，并用灭菌吸水纸吸干组织表面的水分，置于PDA培养基平板上25恒温箱中黑暗培养。每一培养基平板上放置3个组织块。培养4d待病组织表面出现菌丝后，用灭菌的挑针挑取菌落边缘的菌丝进行病原菌的纯化。1.4 病原真菌的致病性检测将分离获得的病原真菌孢子悬浮液（浓度为1106孢子/mL）接种到2-3叶期健康稗草植株上，接种后的稗草植株置于28、12h光暗交替的人工气候箱中用塑料袋套袋保湿培养。48h后观察接种后稗草的发病情况，以接种无菌水的植株作为空白对照。每一处理设置4次重复。1.5 病原真菌的鉴定对在接种稗草植株上能造成明显病斑的病原真菌再次进行分离纯化，以期获得具致病性的尖角突脐孢菌纯化菌株。1.5.1 形态鉴定：依据病原真菌在PDA培养基平板上的菌丝及孢子形态进行分类鉴定。菌丝生长速率及菌落形态：将3株病原真菌分离物及已确认为尖角突脐孢菌的G-9和X-27菌株在PDA培养基上培养4d，用直径为5mm的打孔器沿菌落边缘打取菌龄一致的菌饼，接种于PDA平板中央，然后于25恒温箱中黑暗培养，每隔24h测量一次菌落直径。培养5d后照相记录不同菌株菌落形态。将在PDA培养基上培养7d的供试菌株，用直径为5mm的打孔器沿菌落边缘打取菌龄一致的菌饼，接入灭菌的改良Fries培养液中，25、130r/min培养4-5d后真空抽滤收集菌丝体，并于60烘干菌丝。分别称量不同菌株菌丝的鲜重和干重。每一处理设置4次重复。孢子形态：将上述菌株在PDA培养基上培养10d后在每一培养皿中加入等量无菌水，以棉签轻刮表面并用双层纱布过滤，借助血球计数板测量每一菌株的产孢量，同时照相记录孢子形态。每一处理设置4次重复。1.5.2 分子鉴定：1）DNA的提取：将供试菌株在PDA培养基上培养7-10d，用直径为5mm的打孔器沿菌落边缘打取菌龄一致的菌饼，接入灭菌的改良Fries培养液中，25、130r/min培养4-5d后真空抽滤收集菌丝体，-20保存备用。DNA提取采用CTAB法（Gramham et al. 1994）。2）利用通用引物PCR扩增基因组DNA的ITS区：根据文献报道（White et al. 1990）的方法，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成扩增真菌核糖体基因的通用引物ITS4 和ITS5。ITS4 和ITS5 序列分别为：ITS4：5- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3；ITS5：5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3。PCR扩增反应体系（25L）如下：2L dNTP Mixture（每种成分均为2.5mmol/L），ITS4（20mol/L）和ITS5（20mol/L）各0.5L，3.0L的10Taq reaction buffer，0.5L Taq DNA polymerase（2.5U/L），模板DNA为1L，17.5L无菌去离子水。PCR循环设置如下：94预变性5min；94变性40s，50退火40s，72延伸1min，共设35个循环；最后72延伸10min。扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶中电泳分离后，于溴化乙锭溶液（0.5g/mL）中染色15min，通过ALPHA的凝胶成像系统显示记录电泳结果。3）PCR产物的回收与克隆：采用Omega的胶回收试剂盒进行回收，用TaKaRa生物技术有限公司的pGEM-T easy Vector试剂盒进行连接。连接反应物采用热激法转化大肠杆菌DH5感受态细胞，用含有50g/mL的氨苄青霉素LB平板（预先涂X-gal和IPTG）筛选阳性克隆。采用菌落PCR对阳性克隆进行鉴定，琼脂糖凝胶电泳检测是否有目的片段插入。4）目的片段序列测定及序列同源性分析：序列测定由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。用DNAMAN4.0进行序列比对，分析其5.8S及其侧翼的ITS区的变异情况（Ignazio & Linda 1993；Victor et al. 1993；王洪凯等 2001）。5）ITS1和ITS2区序列聚类分析：在GenBank中搜索已发表的尖角突脐孢菌的核糖体5.8S rDNA及其侧翼的ITS区的序列，与本试验所测序列分别进行菌株种内比对。用MEGA 3.1计算尖角突脐孢菌不同地理来源的株系之间遗传距离并建立其与近缘种属ITS1和ITS2的聚类分析树状图，用Bootstrap对系统树进行检验（Victor et al. 1995；肖长坤等 2005；张正光等 2003）。2 结果与分析 2.1 病原物的分离纯化及致病性检测 从稗草病组织共分离获得26株真菌分离物。将所有分离物进行初步纯化后重新接种到2-3叶期健康稗草植株上，结果表明，其中的12株真菌分离物可在稗草叶部形成明显的黄褐色病斑，与田间植株自然发病症状相似。无菌水对照生长正常，未观察到任何发病症状。并且自发病植株上可以重新分离获得上述真菌分离物，其在PDA上的培养性状与接种菌株完全一致。2.2 稗草病原真菌的鉴定2.2.1 形态鉴定：经过比较12株病原真菌与实验室已有的2株尖角突脐孢菌菌株G-9和X-27的菌丝及孢子形态，可初步确定其中3株为引起湖南水稻田和中国农业大学科学园温室稗草叶枯的病原菌尖角突脐孢菌，根据其来源将其分别编号为HN-14、K-12及KF-1。图1 五株尖角突脐孢菌菌落生长情况比较Fig. 1 Dynamic growth curve of colony diameter of five Exserohilum monoceras isolates.1）菌落生长速率及菌落形态：由图1可以看出，不同来源的5菌株中，以K-12 生长最为缓慢，且与其它菌株相比差异极显著（p 0.05）；G-9生长速率最快，但与其它3菌株之间无明显差异（p0.05）。在25黑暗条件下培养5d后，观察各菌株的菌落形态。结果表明，各菌株的菌落边缘均相对较为规则。G-9为灰褐色，边缘辐射状，且较中间稀薄；HN-14、KF-1和X-27均为黑褐色，菌丝生长致密，菌落表面棉絮状；K-12为黄褐色，菌丝生长稀薄（图2）。在改良Fries培养液中培养的5菌株，菌丝体生长量也各异。其中，KF-1，H-14和X-27产生菌丝的鲜重和干重均明显高于其余2菌株（表1）。表1 25，130 r/min摇培条件下不同菌株菌丝生长情况Table 1 Difference of mycelial weight among five Exserohilum monoceras isolates incubating in 5 days at 25, 130 r/min菌株 Isolates鲜重 Fresh weight（g）干重 Net weight（g）G-95.8837 b0.8890 cHN-1452.7242 a3.9473 aK-125.0687 b0.8741 cKF-154.9386 a4.6448 aX-2748.2452 a2.8508 bNote: The same letter are not significantly different (p0.05) according to Duncans multiple range test.图2 培养5d后菌落形态（其中K-12为培养10d的菌落形态）Fig. 2 Colony morphology of difference among five isolates of Exserohilum monoceras incubating in 25 in dark condition for 5 days (except K-12 for 10 days).2）孢子形态：不同来源的5菌株在产孢能力方面存在较大差异，其中G-9产孢量最大，K-12产孢量最少，二者相差近100倍，其余3菌株之间差异不大，产孢量在同一数量级（表2）。孢子形态观察表明，5菌株的孢子均有明显突出的脐，但是其孢子大小、分隔数均有差异（图3）。其中，G-9和X-27的孢子长度均大于300m，而余下3菌株的孢子却不足200m；G-9的孢子具6-9个分隔，X-27为5-7个分隔，HN-14为3-6个分隔，KF-1和K-12菌株的分隔数则为3-5（表2）。图3 尖角突脐孢菌不同菌株孢子形态图 A-E依次为：HN-14，X-27，G-9，KF-1，K-12.Fig. 3 Spore morphology of five Exserohilum monoceras isolates. A-E: HN-14, X-27, G-9, KF-1, and K-12.表2不同尖角突脐孢菌菌株产孢能力及孢子直径之间的差异Table 2 Difference of sporulation and morphology of spores among five isolates of Exserohilum monoceras菌株Isolates产孢量（孢子/mL）Sporulation (Spores/mL)孢子长Length of spore (m)孢子宽Width of spore (m)长宽比Length/width分隔数Number of septaG-95.78107334.0441.61a55.407.29ab6.121.02a6-9 aHN-144.50106184.8445.08c56.758.36a3.260.85c3-6 cK-123.50105188.1537.85c53.056.89c3.550.76b3-5cKF-17.00106192.1437.80c53.427.73bc3.670.88b3-5 cX-271.67106305.6138.71b50.607.18d6.040.93a5-7 bNote: The same letter are not significantly different (p0.05) according to Duncans multiple range test.2.2.2 分子鉴定：1) 5.8S rDNA及ITS1和ITS2区域的克隆及测序：采用通用引物ITS4和ITS5从供试的5株尖角突脐孢菌的菌株基因组中均扩增得到目的片段，其测序结果如表3所示。5菌株的ITS1和5.8S rDNA的片段长度均一致，菌株G-9的ITS2片段比其它菌株多了2个碱基。将测定的序列与GenBank中已有的尖角突脐孢菌（登录号为DQ337380）的序列进行比对，结果显示，HN-14与其序列一致；K-12和KF-1两菌株与其相似性为99.80%；因此可基本证实3株病原真菌分离物均为尖角突脐孢菌。但5菌株之间又存在差异，除HN-14和X-27与已有序列完全相同外，其它3菌株在ITS1和ITS2的不同区域发生了变异，5菌株的5.8s rDNA区域的序列完全一致。可见，ITS可用于鉴定未知菌株是否为尖角突脐孢菌，也可部分反映出菌株之间可能存在的与地域相关的种下类群分化。2) 尖角突脐孢菌5.8S rDNA 侧翼ITS区序列的聚类分析：5菌株的ITS1及ITS2序列比对结果表明，编号为HN-14、KF-1、X-27及GenBank登陆号为DQ337380共4个菌株的ITS1序列完全相同，G-9和它们相比仅是第64个碱基以T代替了C，第122个碱基以G代替了T；K-12和它们相比则是第63个碱基以C代替了T，第123个碱基以C代替了T。编号为HN-14、K-12、X-27及GenBank登陆号为DQ337380共4个菌株的ITS2序列完全相同，G-9和它们相比是第379个碱基以A代替了G，第420个碱基以T代替了C，第435个碱基以T代替了A，第437个碱基以A代替了T，第480个碱基以T代替了C，此外，第484和485个碱基的位置多出了A和T；KF-1和它们相比则仅是第425个碱基以T代替了C（表3）。表 3 不同尖角突脐孢菌菌株rDNA及其侧翼ITS区的序列长度（bp）Table 3 Sequence length of ITS and rDNA of 5 Exserohilum monoceras isolates菌株 Isolates序列长度 Sequence lengthITS15.8S rDNAITS2ITS1+5.8S rDNA + ITS2G-9168（2a）157（0）178（7）503 (98.68%b)HN-14168（0）157（0）176（0）501 (100%)K-12168（2）157（0）176（0）501 (99.80%)KF-1168（0）157（0）176（1）501 (99.80%)X-27168（0）157（0）176（0）501 (100%)E. monocerasc168157176501a代表与GenBank中登录的尖角突脐孢菌（登录号为DQ337380）相比出现变异的碱基数；b代表与GenBank中登录的尖角突脐孢菌（登录号为DQ337380）的相似度；c代表GenBank中登录的尖角突脐孢菌（登录号为DQ337380）的ITS序列a Changed bases compared with E. monoceras (accession: DQ337380) from GenBank; b Similarity between ITS sequence of the isolates and that of E. monoceras (accession: DQ337380) from GenBank; c ITS sequence of E. monoceras (accession: DQ337380) from GenBank.聚类分析表明（图4、5），在ITS1区尖角突脐孢菌各菌株之间遗传距离是0-0.027，5个菌株中G-9和K-12存在2个碱基的变异；在ITS2区尖角突脐孢菌各菌株之间遗传距离是0-0.026，5个菌株中G-9出现7个碱基的变异，K-12存在1个碱基的变异。种内各菌株之间的遗传距离明显小于种间的遗传距离。由聚类图可知，基于ITS1及ITS2序列，能将尖角突脐孢菌和突脐蠕孢属Exserohilum中其它的种分开，突脐蠕孢属Exserohilum、平脐蠕孢属Bipolaris和凹脐蠕孢属Drechslera的所有分析菌株均各自位于独立的聚类组中，不同种之间能明显分开。图4 尖角突脐孢菌及其近缘属、种5.8S rDNA侧翼ITS1聚类分析树状图Fig. 4 NJ phylogenetic tree inferred from nuclear ribosomal ITS1 sequences. Bootstrap values greater than 50% are shown on corresponding branches. Magnaporthe grisea, Bipolaris zeae, Drechslera poae, etc. and Exserohilum turcicum and E. rostratum were used as an outgroup and a suboutgroup, respectively.图5 尖角突脐孢菌及其近缘属、种5.8S rDNA侧翼ITS2聚类分析树状图Fig. 5 NJ phylogenetic tree inferred from nuclear ribosomal ITS2 sequences. Bootstrap values greater than 50% are shown on corresponding branches. Magnaporthe grisea, Bipolaris zeae, Drechslera poae, etc. and Exserohilum turcicum and E. rostratum were used as an outgroup and a suboutgroup, respectively.3 结论与讨论尖角突脐孢菌菌株形态鉴定的结果表明，尽管不同来源的菌株之间在菌落形态、孢子大小及分隔等方面均存在较大差异，但可初步确认分离获得的3株病原真菌均为尖角突脐孢菌。除K-12差异明显，表现出生长缓慢、产孢量少、孢子分隔少、菌丝稀薄的特征外，其余4菌株差异不显著。分子鉴定结果表明，菌株间ITS区序列相似度达98%以上，由此确定分离自湖南水稻田及中国农业大学科学园温室中自然发病的稗草病样上的3株病原真菌均为尖角突脐孢菌。真菌是一种遗传多样性丰富的生物物种，不同生态型、不同地域以及不同时期分离的真菌，其遗传特性存在差异，且种内变异较大（陈勇和倪汉文 2003）。ITS是介于18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA之间的区域，该区域进化速度较编码区快，已有的研究表明ITS在真菌的种间存在着丰富的变异，而在种内不同菌株间却高度保守，可以为真菌的系统发育和分类鉴定提供丰富的遗传信息。尖角突脐孢菌不同菌株间存在上述差异，究其原因，可能与其地理来源相关，也可能是由于菌株间遗传背景的差异导致。从5菌株的地理来源分析可知，菌株HN-14和菌株X-27分别采集自湖南和江西，上述两省地理位置相邻，生态环境相似，试验结果也表明两菌株间生物学特性和致病力方面差异不明显；菌株KF-1和菌株K-12虽同采集自北京，但是菌株之间存在明显差异；菌株G-9采集自广东，该省位于我国沿海，地理位置和生态环境均与上述内陆地区存在差异，而该菌株与其它4菌株差异较为明显。从遗传背景而言，经过对5菌株的ITS序列分析结果表明，除菌株G-9与其它菌株之间遗传距离较远外，其余4菌株间的同源性达到了99.8 %以上。综上所述，尖角突脐孢菌菌株间的差异可能与不同地理来源相关，这是该菌在其所生长的地理环境长期进化过程中可能造成遗传变异的结果。由于试验中所用的菌株样本数量有限，该结论尚需进一步验证。我国幅员辽阔，农作历史悠久，农业自然条件千差万别，形成了丰富的杂草区系，也必将伴随着大量具有潜力的生物除草剂的天敌资源（付颖等2002）。因此，对不同地理来源的杂草病原菌的形态特征和致病性进行研究，有利于从中筛选获得极具潜力的候选生防菌，从而加速我国生物除草剂的发展。REFERENCRSChen Y, Ni HW, 2003. 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