梅毒实验室检测课件

HIV、HBV和梅毒的实验室检测,培训目标,课程结束时，受训者应能够： 理解实验室检测在诊断和监测HIV和HBV、梅毒感染的重要作用 了解诊断和监测HIV和HBV、梅毒感染的不同检测方法 解释检测结果 描述孕产妇及配偶/伴侣的检测流程 描述暴露婴儿/儿童的检测流程,2,妇幼机构 确证实验室1个 0.87% 筛查实验室52个 45.6% 检测点8个 7%,江西省妇幼保健机共114个，省级1个，市级12个，县级101个） 全省,一、HIV、梅毒和HBV的 实验室检测,简介,4,综合产前检查服务+ 检测,孕产妇参加产前检查服务,检测前信息,HBV 检测,梅毒检测,HIV 检测,全血细胞计数和其它检测,取血样,5,HIV和HBV筛查检测,筛查检测 用于诊断产检、临产及分娩的孕产妇是否感染HIV和HBV HIV抗体检测 乙肝表面抗原（HBsAg）检测 筛查检测应 具有较高的灵敏度和特异度 操作简单、容易获得、便宜 尽可能在“当日”获得结果,6,iPMTCT筛查检测 何时使用何种检测？,7,二、HIV试验和检测,8,全国艾滋病检测技术规范（2014 年修订版）中的变化 2009年版,2014年版,2014年版,补充试验（核酸）,补充试验包括抗体补充试验和核酸补充试验等。建议首选抗体补充试验，如蛋白免疫印迹试验（WB，原确证试验）、条带/线性免疫试验（RIBA/LIA）。,HIV检测：抗体检测,一个人感染了HIV病毒后，体内将产生特异性抗体对抗HIV病毒* 。 HIV抗体通常在感染后4 6周出现，但也有时也会在感染后3个月才出现。 从感染HIV病毒到出现特异的HIV抗体的一段时期称为“窗口期”。,标准的HIV诊断检测* *是识别HIV抗体。,注意： *与其他大多数疾病不同，HIV抗体没有保护性作用。 * 所有HIV检测工具应经过SFDA审批，并在有效期内使用。,14,感染HIV后各种标志物消长变化,孕产妇艾滋病检测方法包括抗体筛查试验和补充试验。 抗体筛查试验包括快速检测（RT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、化学发光免疫试验（CLIA）、明胶颗粒凝集试验（PA）等。 补充试验包括抗体补充试验和核酸补充试验等。建议首选抗体补充试验，如蛋白免疫印迹试验（WB，原确证试验）、条带/线性免疫试验（RIBA/LIA）。,HIV抗体检测类型,17,HIV检测：病毒核酸检测,这些检测 检测HIV感染者血液或血浆中的病毒 必须由经过专门培训的实验室人员操作 实验室需有资质，并配备专门设备 昂贵，不是针对所有人进行的常规检测方法 PCR（多聚酶连反应法）检测 HIV DNA-PCR定性检测血液中是否含有病毒，用于诊断18月龄内婴儿是否感染HIV HIV RNA-PCR定量检测病毒载量，即血浆中的病毒数量，用于监测对抗病毒治疗的反应。,18,HIV EIA / ELISA（酶联免疫试验）试剂,HIV筛查检测结果的含义,HIV筛查检测结果“阴性(-)”： 受检者没有感染HIV 或者 受检者已经感染了HIV，但处于窗口期：3个月后再次进行检测 HIV筛查检测结果“阳性(+)”： 病人可能已经感染HIV 但应再次重复检测,21,HIV确认试验结果的含义,如果筛查检测结果阳性，两次重复检测中1次或2次检测结果为阳性，需要进行确认试验 免疫印迹法（WB）确认试验结果： 阳性 病人确认感染HIV 阴性 受检者没有感染HIV 不确定 结果为“不确定” 受检者必须在4周后再次采血，重复前述所有步骤进行检测,22,抗体检测中的问题 初筛实验中的假阳性 血液恶性病变 自身免疫性疾病 多发性胆汁型肝硬化 酒精性肝炎 疫苗接种（流感，乙肝） 多发性骨髓瘤 肾移植或慢性肾衰竭 疟疾或丝虫病 其他,抗体检测中的问题,初筛实验中的假阴性 窗口期 免疫移植 换血输血 恶性肿瘤 免疫功能丧失（B细胞功能缺损） 其他（试剂或操作原因,中国预防艾滋病、梅毒和乙肝母婴传播HIV检测流程,在产前检查服务中开展整合的检测咨询所采用的HIV检测流程,25,产时HIV抗体检测流程,中国预防艾滋病、梅毒和乙肝母婴传播HIV检测流程,*有关确认试验详见幻灯片14,26,三、儿童HIV 检测,27,HIV暴露婴儿和儿童的HIV抗体检测,不是所有HIV感染母亲所生儿童都会感染HIV，但是如果对12-18个月以内的婴儿进行HIV抗体检测，所有HIV感染母亲所生婴儿都将是HIV检测结果阳性。 -即使婴儿并没有感染HIV -由于母体自身抗体可通过胎盘进入胎儿体内。,母体传入的抗体可在婴儿体内持续18个月，所以12-18月龄以内的婴儿不能应用抗体检测方法进行诊断。,28,未感染婴儿HIV-1抗体S/CO比值动态曲线,婴儿感染早期诊断（EID） HIV病毒检测（DNA-PCR）,HIV病毒检测（DNA-PCR） 检测细胞内的HIV病毒， 能够检测低至1 10 拷贝前病毒DNA，以及 可在HIV暴露婴儿出生后6周内诊断HIV感染 用于HIV暴露婴儿HIV感染早期诊断（EID）,30,应用DNA-PCR方法进行 婴儿感染早期诊断（EID）（1）,如果可以开展HIV DNA-PCR检测，应用干血斑（DBS）在婴儿6周龄时进行PCR检测。 如果PCR检测结果阳性 尽快再次采血再次进行DNA-PCR检测 如果第二次PCR检测结果阳性，婴儿确定感染HIV 如果PCR检测结果阴性 婴儿出生后3个月再次进行PCR检测,31,应用DNA-PCR方法进行 婴儿感染早期诊断（EID）（2）,出生后3个月再次进行HIV DNA-PCR检测 如果PCR检测结果阳性 尽快再次采血再次进行DNA-PCR检测 如果第二次PCR检测结果阳性，婴儿确定感染HIV 如果PCR检测结果阴性 婴儿视为未感染HIV 考虑在婴儿满12月龄时进行HIV抗体检测（如有必要，在18月龄时再次进行检测）,检测结果阴性的婴儿接受母乳喂养，必须在停止母乳喂养后6周再次进行PCR检测，以确保婴儿没有在母乳喂养期间感染HIV。,32,婴儿HIV感染早期诊断流程,33,HIV暴露婴儿/儿童的HIV抗体检测,所有HIV感染母亲所生儿童，在出生后6周或3个月未接受EID检测者，应进行HIV抗体检测。检测时间： 满12月龄 和 满18月龄（必要时，见HIV抗体检测流程） 出生后3个月EID检测结果为阴性的儿童也应接受HIV抗体检测,满18月龄HIV抗体检测阳性，可确认儿童HIV感染。,34,HIV暴露儿童HIV抗体检测流程,35,四、收集、制备干血斑（DBS）,操作练习,36,什么是干血斑（DBS）？,干血斑是 直接用滤纸收集一滴全血进行干燥 用于血样本的长时间储存 DBS是用HIV DNA-PCR方法进行婴儿HIV感染早期诊断检测的最佳采血方法 HIV DNA和HIV抗体可稳定地保存在干血斑中 转运方便：无需冷藏,37,如何采集干血斑血样本（1）,时刻遵循“普遍防护原则”采集足跟血 选择合适的采血部位，皮肤消毒（图片中阴影部位） 必要时保暖足跟 使用一次性消毒采血针 足跟置于心脏水平位或之下 不要“挤”足跟,38,样本类型 末梢血制备DBS,抗凝静脉血制备DBS,如何采集干血斑血样本（2）,1. 用消毒纱布擦掉第一滴血 2. 收集此后滴出的大滴血液 3. 快速、轻柔地用滤纸片的一面接触血滴 4. 让血液滴到采血圈中 重复步骤1-4，直到整个采血圈全部充满血液。在卡片上标注患者的编号。每个儿童用一张新纸片。收集2-4个血斑。 不要： 用滤纸片按压出血部位 不要多次在同一个采血圈中涂抹血滴 在滤纸片两面均滴入血滴,40,如何采集干血斑血样本（3）,采血圈充满后： 避免碰触或涂抹血滴 水平放置滤纸片，室温下自然晾干血样本（至少4小时） 避免阳光直射，不要加热 不要将多张滤纸片叠放在一起，避免血滴接触其他表面 一旦血样本完全干燥： 放入可封闭的塑料袋中 加入干燥剂和湿度指示卡 干燥、阴凉保存干血斑滤纸片包装袋，直到转送到相关实验室,41,五、HIV感染的实验室监测,42,HIV感染的实验室监测,实验室监测主要用于： 决定开始抗病毒治疗还是预防性应用抗病毒药物 是否有抗病毒治疗指征？ 效果监测 抗病毒治疗有效吗？ 毒性监测 抗病毒药物是否引起了其他问题？,43,CD4+ T淋巴细胞是HIV病毒攻击的靶细胞 CD4+ T淋巴细胞检测用于： 决定开始抗病毒治疗还是预防性应用抗病毒药物 为判断抗病毒治疗成功或失败提供定量依据 对调整抗病毒治疗方案提供指导 孕期每3个月及产后4 6周应进行CD4+ T淋巴细胞检测（急性感染时可适当推迟检测，因为在急性感染期，CD4+ T淋巴细胞通常会下降）,CD4+ T淋巴细胞检测,44,CD4+ T细胞绝对数的临床意义 评价免疫功能减退的程度和AIDS进程 指导治疗策略的制订 确定预防机会感染的最佳时机 监控抗逆转录病毒（ARV）治疗、细胞因子治疗和保护治疗性疫苗的疗效,艾滋病诊疗指南,CD4+T淋巴细胞计数350个细胞ul时，建议定期复查，暂不予治疗； CD4+T淋巴细胞计数在200350个细胞ul时，需考虑患者CD4+T淋巴细胞计数和病毒载量(如有条件检测)的变化以及患者的经济条件和依从性等综合因素后再考虑是否开始治疗。 CD4+T淋巴细胞200个细胞ul时，应给予抗卡氏肺孢子虫肺炎的预防性治疗。,病毒载量测量血浆中的病毒数量 病毒载量检测可用于： 是抗病毒治疗失败早期、最可靠的标记物，抗病毒治疗失败的原因，如： 依从性差 耐药 监测对抗病毒治疗的反应 诊断HIV感染后和孕晚期各进行一次病毒载量检测,病毒载量（RNA-PCR）检测,48,在HIV/AIDS中进行病毒载量检测的意义 一、早期诊断和辅助诊断 二、病程监控、预测疾病进程 三、开始进行抗病毒治疗的指针 四、评价药物的疗效（无效、耐药） 1、检测的频度应在基线后每3-4月进行1次 2、新药应在2-4周进行。病毒载量下降50%(0.3log10)才有意义 3、治疗理想的反应：第4周病毒载量下降1.5-2log10, 12-16周小于500cp/ml, 16-24周小于50cp/ml,HIV感染孕产妇常规实验室监测（1）,51,HIV感染孕产妇常规实验室监测（2）,52,六、HBV感染的检测,53,妊娠期HBV感染筛查,所有孕产妇均应在孕期尽早接受HBsAg检测筛查是否感染HBV 如果分娩前尚未有检测结果，应在分娩前尽快进行检测 如果HBsAg检测阳性，有条件可考虑进行其他HBV标记物检测。注意，暴露婴儿的处置不受母亲其他HBV标记物检测结果的影响,54,乙肝标记物列表,55,HBV暴露婴儿的实验室检测,HBsAg阳性母亲所生婴儿，出生时应接受乙肝疫苗接种，并在完成全部3剂乙肝疫苗接种后的 6个月接受HBsAg和抗HBs抗体检测（即出生后12个月时） 结果解释： 如果HBsAg阳性并持续6个月，婴儿慢性感染 如果抗Hbs抗体阳性（100mIU/ml），婴儿有免疫保护 如果HBsAg阴性和抗HBs抗体 100mIU/ml，婴儿应再次接受3剂乙肝疫苗接种,56,七、妊娠期整合检测采血程序,57,妊娠期整合检测HIV、梅毒和HBV的 采血程序,检测前提供相关信息后，医务人员应： 获得孕产妇及配偶（如果配偶也同时接受检测）的口头同意 戴上乳胶手套，采血 摘掉手套 标记采血管（根据当地方案要求），填写化验单，登记患者编号和采血日期 用合适的容器将血样本转送到实验室进行检测 向孕产妇解释如何能够获得检测结果,58,八、要点,小结,59,要点-HIV,使用快速筛查试验诊断HIV感染。筛查检测结果阳性，进行确认试验以保证结果的准确性。 HIV感染抗病毒治疗应根据： CD4+ T淋巴细胞计数检测结果，反映HIV对免疫系统的影响 HIV病毒载量检测结果，反映血液中HIV病毒的数量 如果有条件，应用HIV-DNA PCR检测方法诊断婴儿是否HIV感染 儿童满12-18月龄，HIV抗体检测方可确认儿童是否感染,60,要点-HBV,通过筛查HBsAg诊断HBV感染 如有条件，筛查HBsAg结果阳性，可进一步检测其他HBV标记物，如乙肝二对半、乙肝三对 HBsAg阳性母亲所生婴儿，出生时接受乙肝疫苗接种，应在出生后12个月接受HBsAg和抗HBs抗体检测,61,婴儿艾滋病感染早期诊断工作方案,一、梅毒的实验室检测,简介,64,综合产前检查服务+ 检测,孕产妇参加产前检查服务,检测前信息,HBV 检测,梅毒检测,HIV 检测,全血细胞计数和其它检测,取血样,65,梅毒筛查检测,筛查检测 用于诊断产检、临产及分娩的孕产妇是否感染梅毒：梅毒血清学检测 筛查检测应 具有较高的灵敏度和特异度 操作简单、容易获得、便宜 尽可能在“当日”获得结果,66,iPMTCT筛查检测何时使用何种检测？,67,二、梅毒感染的检测,68,梅毒早期诊断的依据之一是病原学检测，即在组织或分泌物中检测到苍白螺旋体： 暗视野显微镜 镀银染色镜检,梅毒诊断检测（1）,69,血清学试验检测梅毒感染相关抗体 非梅毒螺旋体抗原血清学试验（检测非特异性抗体） RPR（快速血浆反应素环状卡片试验） TRUST（甲苯胺红不加热血清试验） VDRL（性病研究实验室试验） 梅毒螺旋体抗原血清学试验（检测特异性梅毒螺旋体抗体） TPPA（梅毒螺旋体颗粒凝集试验） ELISA（酶联免疫吸附试验） POC（快速检测、一站式检测）,梅毒诊断检测（2）,70,梅毒血清学试验基本实验室设备,71,非梅毒螺旋体抗原血清学试验（1）,梅毒螺旋体感染可产生非特异性抗体（非梅毒螺旋体抗体） 非梅毒螺旋体抗体 又称之为反应素，是抗心磷脂等抗原的抗体 随菌体和宿主细胞的类脂质抗原量升高 除梅毒外，其他医学情况会造成非梅毒螺旋体抗原血清学试验假阳性结果，包括结核、疟疾、妊娠和风湿关节炎、狼疮及硬皮病等自体免疫学疾病,72,非梅毒螺旋体抗原血清学试验（2）,抗体滴度通常与疾病活动度有关。 治疗后（可能几个月）非梅毒螺旋体抗原血清学试验通常转变为不反应 如果用同一种实验，相同试验滴度4倍变化（如从1:16下降到1:4或从1:8上升到1:32）为临床显著变化 有些病人，抗体滴度可始终处于较低水平，有时可持续终生（血清固定） 注意：病人血清学监测应在同一个实验室使用同一种检测方法（RPR、TRUST）进行连续多次检测；RPR和TRUST方法均有效，但检测的滴度结果不能直接进行比较,73,非梅毒螺旋体抗原血清学试验的特点,非梅毒螺旋体抗原血清学试验： 快速、简便、便宜 敏感性和特异性较高 硬下疳后1-2周变为阳性 可用于 筛查样本 评估对治疗的反应 鉴别复燃还是再次感染,74,治疗后非梅毒螺旋体抗原血清学试验 抗体滴度变化的临床意义,一期梅毒和二期梅毒： 成功治疗，抗体滴度应 3个月后下降2倍 6个月后下降4倍 一期梅毒：1年后抗体滴度转阴 二期梅毒：2年后抗体滴度转阴 晚期梅毒： 治疗后抗体滴度缓慢下降 50%的病人2年后抗体滴度仍为阳性,75,确保非梅毒螺旋体抗原血清学试验 质量的关键点,按照标准操作程序（SOP）进行操作 推荐使用评价特性较好的试剂* 按照统一的标准报告结果 开展实验室室内质控（IQC）和参加室间能力验证（PT）,* 由中国疾病预防控制中心性病中心国家参比实验室提供,76,梅毒螺旋体抗原血清学试验,梅毒螺旋体抗原血清学试验 检测梅毒螺旋体抗原特异性抗体 可用于确认非梅毒螺旋体抗原血清学试验的阳性结果，排除其假阳性 阳性结果可持续存在，即使治疗后仍可为阳性。*,梅毒螺旋体抗原血清学试验与疾病的活动度无关，不能用于鉴别现症感染还是既往感染，也不能用于判断疗效,* 一期梅毒治疗病人中，15%-25%可在2-3年后转为血清学阴性,77,梅毒诊断方法学比较,妊娠期梅毒检测,所有孕产妇应进行梅毒筛查检测： 孕期尽早（如果可能，在孕早期时）以及 如果在分娩前/临产时没有筛查检测结果，在分娩时检测 筛查检测可应用以下任何一类方法： 非梅毒螺旋体抗原血清学试验（滴度）或 梅毒螺旋体抗原血清学试验 所有筛查检测结果阳性的孕产妇都应用另外一类检测方法进行复检确认是否为现症梅毒 所有产妇及所生婴儿出院前，产妇梅毒检测结果都应记录在病历中，以确保需要时给予治疗,79,孕产妇梅毒检测流程,阴性反应,阳性反应,阴性反应,阳性反应,80,HIV感染病人的梅毒血清学试验,一些HIV感染病人，其梅毒血清学试验结果不典型，包括 滴度超常高或超常低 滴度不断变动 如果临床表现提示早期梅毒，而血清学试验结果与此不一致，考虑 病灶活检 或 暗视野显微镜检查,注意：对于大多数HIV感染病人而言，梅毒血清学试验是诊断梅毒感染、随访观察疗效准确、可靠的检测方法,81,梅毒血清学检测结果的解释,*包括结核、疟疾、风湿性关节炎或妊娠。,82,三、暴露婴儿的梅毒检测,83,梅毒暴露婴儿先天梅毒检测,母体非梅毒螺旋体和梅毒螺旋体IgG抗体可通过胎盘，所以应谨慎地对婴儿梅毒血清学试验结果进行解释 婴儿需要接受预防性治疗还是规范的抗梅毒治疗应根据： 母亲确诊梅毒感染 母亲治疗情况 婴儿梅毒感染的临床表现、实验室或放射线检查结果 母亲及婴儿非梅毒螺旋体抗原血清学试验滴度水平的比较（尽可能在同一个实验室使用相同的试验方法）,84,先天梅毒的诊断标准,梅毒暴露婴儿具有以下条件之一： 任何先天梅毒临床表现 暗视野显微镜检梅毒螺旋体阳性（+） 梅毒螺旋体IgM抗体阳性* RPR/TRUST检测阳性，滴度比母亲分娩前最近一次滴度高4倍及以上 RPR/TRUST监测随访中，任何一次滴度不下降或反而上升 满18月龄后，梅毒螺旋体抗原血清学试验（TPPA、ELISA或梅毒快速检测）检测阳性,* IgM抗体反映近期感染，可帮