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武汉理工大学毕业设计（论文）银杏外种皮有机酸类化合物提取分离与鉴定学院（系）： 理 学 院 专业班级： 应用化学 1002 班 学生姓名： 指导教师： 教授 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保障、使用学位论文的规定，同意学校保留并向有关学位论文管理部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权省级优秀学士论文评选机构将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密囗，在 年解密后适用本授权书2、不保密囗 。（请在以上相应方框内打“”）作者签名： 年 月 日导师签名： 年 月 日摘要银杏酸是银杏中除银杏内酷和银杏黄酮之外的另一类活性成分。银杏酸类可看作水杨酸分子在苯环C6位上连有较长侧链取代基的系列化合物,该长链分烷基链和烯基链,由13-17个碳原子组成，主要存在于银杏外种皮中,我国银杏资源丰富,银杏外种皮通常被作为废弃物,造成了资源的巨大浪费。本论文针对银杏外种皮中银杏酸的提取、纯化、分离及其定性定量分析展开研究,主要研究内容和结论如下:1、首次探讨石油醚提取银杏酸的最佳条件，主要影响因素有四个：提取时间、提取温度、提取次数和溶剂的用量。采用正交试验和单因素相结合的方法，确定了石油醚提取的最佳条件为：采用1:15的料液比，在70下回流提取2次，每次1.5h。2、在总银杏酸纯化的过程中，研究了不同极性的洗脱剂的洗脱效果，洗脱液采用紫外全波长扫描法和液相色谱相相结合的方法进行确定。最后得出最佳纯化洗脱剂为：石油醚：乙醚：乙酸=90:10:1。3、本文采用了TLC、紫外扫描、HPLC、IR对银杏酸进行定性和定量分析，采用硅胶板，探讨不同比例展开剂对银杏酸展开的效果，对展开剂的选择有一个初步的判断。采用紫外扫描，对银杏酸做了定性分析，并且确定了定量分析的检测波长为310 nm。HPLC分析条件：C18（2004.6 mm）,柱温30，流动相为甲醇0.01 mol/L的磷酸溶液（90:10），流速1.2 mL/min，检测波长310 nm。粗提物的纯度为52.7%，纯化后的产物的纯度为97.5%,并计算了每一种银杏酸的相对含量。通过对产物的红外表征，初步确定了部分官能团的存在。关键词：银杏酸, 提取, 纯化, 分析AbstractGinkgoli cacids are a kind of active component in Ginkgo bilobal besides ginkgolides and ginkgoflavone.Ginkgolic acids are 6-alkyl salicylic acids with saturated or up to triple unsaturated n-C13 to n-C17-alkyl residues,which constitute the major component of the lipid fraction in the sarcotesta of Ginkgo bilobal is abundance and it is always wasted In this paper,the separation purification and quantitative,qualitative determination of ginkgolic acids in the sarcotesta of ginkgo bilobal were studied ,the main conclusions as follow:Firstly we investigate the optimum conditions of petroleum ether to extract ginkgo acid, in which there are four main factors: extraction time, extraction temperature, extraction times and solvent usage. Orthogonal and single factor experiment are combined to determine the optimal conditions for the extraction of petroleum ether: The solid-liquid ratio is 1:15 , refluxing 2 times and 1.5h for a time at 70 .In the process of purification of total ginkgo acid , the effect of different polarity elution eluent are studied, eluent are measured by full wavelength scanning method using ultraviolet and liquid chromatography with a combination at the same time. Finally, we find the optimum ratio for purified eluent ,that is petroleum ether: diethyl ether: acetic acid = 90:10:1In this novel, the TLC, UV scanning,HPLC, IR are adopted for Ginkgo acid qualitative and quantitative analysis , we also use silica gel plate to explore how different proportions of eluent influence the unfolding effects of ginkgo acid, as a result we have a preliminary judgment for the choice of the eluent. Using UV scanning for a qualitative analysis to the ginkgo acid , and simultaneously by a quantitative analysis we determine the detection wavelength is 310nm. And we decide the HPLC analysis conditions , that is , C18 (200 4.6mm), the column temperature 30 , mobile phase methanol-0.01mol/L of phosphoric acid solution (90:10), flow rate 1.2ml/min, detection wavelength 310nm. Finally , we get some samples in which the purity of the crude extract is 52.7% and the purity of the purified product is 97.5%, and we also calculate the relative content of each Ginkgo acid. By infrared characterization of the product, some functional groups are identified initially.Keywords：ginkgolic acid, extract, purification, analysisIII目录摘要IAbstractII第1章 引言11.1银杏11.2 银杏外种皮11.2.1 烃基酚和酚酸类21.2.2 黄酮类21.2.3 萜内酯类31.2.4 糖类31.2.5 其它化合物41.3 银杏酸类化合物41.3.1 银杏酸的理化性质41.3.3 银杏酸的毒性及用途51.4国内外研究现状71.4.1 银杏酸的提取方法71.4.2 银杏酸的纯化方法91.4.3 银杏酸单体的制备12第2章 银杏外种皮有机酸的提取与纯化132.1 实验仪器与材料132.3.1石油醚提取总银杏酸的条件探讨162.4 硅胶柱层析法纯化银杏酸182.5本章小结22第3章 银杏酸的定性和定量分析233.1 银杏酸的薄层色谱法分析233.2 银杏酸的高效液相色谱分析233.2.1图谱分析243.2.2产物纯度的计算及含量测定253.3 银杏酸的紫外分析263.4银杏酸的红外分析27第四章结论与展望304.1 结论304.2 展望30参考文献32致谢34武汉理工大学毕业设计（论文）第1章 引言1.1银杏银杏是古老的孑遗植物，是第四纪冰川期之后独存于东亚中国、日本、韩国和朝鲜的经济树种。今天，银杏所创造的经济效益、生态效益和社会效益已被世人所瞩目。国内外对银杏种仁、叶片的开发利用研究和生产已相当普遍，并取得多项成果，在人们的医疗、保健中发挥了很大作用；然而，人们对银杏外种皮的研究仅仅是刚刚起步，开发利用几乎还是空白。根据笔者多年的调查研究1可知，银杏外种皮占整个种子重量的75%左右，我国每年约有2.4 t万银杏外种皮作为废物丢弃，既污染了环境，又造成极大的资源浪费。如果除去外种皮中60%的水分，可得干燥外种皮9600 t，比银杏种核的年产量还高。因此，深入开展银杏外种皮的研究和开发利用，不但可做到废物利用，变废为宝，而且还可防止环境污染，充分利用资源，从而获得较大的经济效益和社会效益。 从报道的文献2可以看出，我国银杏外种皮的开发研究仅仅是刚刚起步，深度和广度还远远不够。而在医药和生物农药的开发利用上更是空白。上世纪90年代中期，由于银杏叶提取物国际市场价格上涨，人们受经济利益的驱动，在我国掀起了银杏热，种植面积达12.3万hm2种植株数达12亿株，银杏叶年产量达1.1万t，银杏干青叶16元/kg，全国银杏黄酮甙提取厂达110余家（建一座中型厂需投资800-1100万元），银杏叶提取物年产量达90 t。但是银杏外种皮的研究和开发利用却发展不足，致使年产量达9600 t的银杏外种皮白白丢弃。目前，我国银杏产区正在酝酿开发银杏外种皮保健饮料、美容化妆品和生物农药。1.2 银杏外种皮银杏外种皮是银杏果仁的皮层,即种子硬壳外面的部分,俗称白果衣胞,只有在产地才能得到,在产地采收成熟的果实,用浸泡或捶打使其肉质外皮腐烂、脱下。在银杏产区,通常只取其仁,而将外种皮扔弃。外种皮具有致敏毒性,经常接触会引起漆毒样皮炎 。果农在剥离外种皮时,手上总要蜕掉一层皮;扔到河塘中,鱼虾亦被毒死。由此可见,银杏外种皮确实存在一种有较强生理活性的物质。经研究发现, 引起过敏的成分可能为银杏毒素( Ginkgotoxin) 等酸类成分。随着研究的深入,银杏外种皮中被发现的化学成分越来越多,目前主要有以下几类:1.2.1 烃基酚和酚酸类据报道,银杏外种皮中含有大量的烃基酚类化合物其中以白果酸( Ginkgolic acid，I) 含量最高,其次是白果酚( Ginkgol，II) 、白果二酚(Bilobol，III) 、氢化白果酸(Hydroginkgolic acid，V) 和氢化白果亚酸(Hydroginkgolinic acid，VI) ,也含有少量的IV、VII、VIII、IX 等成分。图1.1银杏酚酸的结构31.2.2 黄酮类黄酮类物质是银杏叶中主要药效成分，也是治疗心脑血管疾病主要活性成分。黄酮类物质占银杏叶提取物5.9%4，银杏叶提取物中黄酮类约有40余种，按化学结构可分为三类：即单黄酮类32种，双黄酮类6种，儿茶素类4种5。其中单黄酮类苷元主要为异鼠李黄素（isorhamnetin）、山奈黄素（kaempferol）和槲皮素（quercein）3 种，银杏所含的黄酮苷主要是这3 种苷元的单、双和三糖苷及香豆素酰基糖苷化合物，糖元多为葡萄糖和鼠李糖，其中带有香豆酰基的黄酮苷活性较强，被认为是总黄酮中真正有活性的物质，但含量较低，而芦丁含量相对较高。有文献报道双黄酮类（如白果素、银杏双黄酮、异银杏双黄酮、穗花衫双黄酮等）没有生物活性，银杏叶提取物中已将其除去6。儿茶素类四种分别为儿茶素、表没食子儿茶素、没食子酸儿茶素和表儿茶素。图1.2银杏黄酮的分子结构式71.2.3 萜内酯类银杏萜内酯类分为银杏内酯（Gingolides）与白果内酯（Bilbozllide），银杏内酯属二萜内酯，具3 个- 内酯环和1个叔丁基团，据其官能团差异可分为银杏内酯A、B、C、J、M 5 种，主要存在于叶片和根内。白果内酯（BB）结构与银杏内酯类似，属倍半萜内酯。图1.3银杏内酯的结构81.2.4 糖类银杏提取物中包含单糖类和多糖类物质，其中单糖类共有4种，多糖类有银杏叶多糖-A(LGBP-A)和银杏叶多糖-B（LGBP-B）2 种。1.2.5 其它化合物银杏外种皮中还含有白果醇(Ginnol)，棕榈酮(Palmitone)，三十烷酸( Triacontanoic acid)，儿茶酚(Pyrocatechol)，原儿茶酸(Protocatechuic acid)，白果宁( Ginkgonine)等。同时还含有氨基酸、鞣质和糖类等成分。1.3 银杏酸类化合物银杏酸类化合物，可看作是水杨酸分子在苯环C6位上连有较长侧链的系列化合物，该长链分烷基链和烯基链,一般长链由13一17个碳原子组成,银杏酸是这类化合物的总称，常见的银杏酸的分子结构如下:图1.4银杏酸的结构图9仰榴青10用RP-HPLC法测得银杏外种皮中银杏酸的含量为5.46%，用LC-ESI-MS鉴定出5种银杏酸成分 （C130，C150-氢化白果酸，C151-白果酸，C171和C172），各成分相对含量分别为20.7%、3.3%、51.6%、21.1%、3.3%，其中C15：1含量最高，其次是C13：0和C17：1，这3种银杏酸占了总银杏酸的90%以上。可见，银杏外种皮中银杏酸含量较高。王志强11等采用SC-CO2-HPLC测得银杏外种皮萃取液中银杏酸含量为35.95%，其中C130，C150，C151，C171和C172含量分别为7.67%、1.70%、18.88%、6.50%、1.21%。1.3.1 银杏酸的理化性质银杏酸为无色油状或粉末状物质。该类型化合物主要溶于非极性溶剂，溶解性质接近于脂肪酸，难溶于低级醇类，不溶于水，可溶于碱水溶液12。由银杏酸的结构式可以预测，其苯环上相连的羧基较易发生脱羧反应，日本专利13介绍了从卡秀果中分离漆树酸的方法，明确指出漆树酸在200 左右会脱羧，对热不稳定，所以不可以采用加热蒸馏法进行分离。另一日本文献则专门研究了漆树酸的脱羧反应，将其经热处理前后的红外谱图进行比较发现1650 cm-1处的碳基的伸缩振动峰会明显减小，而3350 cm-1,处的酚羟基伸缩振动峰却明显增大，由此证明了脱羧反应的存在。由于银杏酸的结构中的酚基和羧基存在，因此具有一定酸性，在某些分离方法中就是利用其酸性。例如Gellerman14就利用其酸性，经皂化反应将它们从原始萃取物中分离出来，以便进行下一步分离精制。而在另一些柱分离方法中，也利用了银杏酸和银杏酚酸性的差异，使用不同酸碱度的洗脱液将它们先后从柱上洗脱下来，例如Nagabhushana就通过调节洗脱液中醋酸和三乙胺的含量来达到分离银杏酚酸的目的。1.3.3 银杏酸的毒性及用途1.3.3.1 银杏酸的药理活性(1) 抗菌作用银杏酸类物质有较强杀菌或抑菌作用,对25种致病性真菌具有抑菌或杀菌作用,对枯草菌、大肠杆菌、酵母菌、金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、绿旅杆菌等均有抑制作用12。(2) 抗氧化作用许爱华等15研究发现银杏酴酸具有抗氧化和清除自由基的作用，用于日化用品中将具有保持皮肤弹性和增白的效果。(3) 抗肿瘤和抗病毒银杏酸性成分中的十七碳烯链水杨酸和银杏黄素均有强抑制EB ( Epstein-Barr)病毒和致癌启动因子的活性。酚酸性成分对小鼠肉瘤S180表现出显著的抗瘤活性16。（4）抗炎与抗过敏作用研究发现银杏酸具有与地塞米松类药物相类似的抗过敏性作用，能抑制小鼠被动性皮肤过敏反应(PCA)和大鼠颅骨骨膜肥大细胞颗粒释放，并能直接拮抗过敏介质引起的豚鼠回肠平滑肌的收缩反应，也能拮抗过敏介质如组胺等对豚鼠回肠的收缩，并且银杏酚酸结构中羧基结构完整性与抗过敏反应程度相关。许丽丽等研究表明银杏甲素能显著抑制二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀、角叉菜胶所致鼠足种胀以及乙酸所致小鼠腹腔毛细管通透性增高。与阳性对照组地塞米松相似，对炎症早期的毛细管渗透性增高，炎性渗出和水肺有很好的抑制作用17。（5）驱虫、杀虫作用白果外种皮中的酸性成分可替代农药防治蚜虫、蛴螬、菜青虫、红蜘蛛、桑蟥、稻螟及其它咀嚼口器的昆虫，可减少化学农药的污染18。利用银杏酸的药理活性可以开发以下产品：（1）医药产品由于银杏酸中具有很大药用价值，医药科研和生产部门应联起手来，在进一步深入研究的基础上，首先开发抗过敏、抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌、抗衰老的医药产品，然后再开发治疗疑难皮肤病如座疮、疥疮、湿癣、脚气、皮炎、烧伤和体表溃疡等医药产品。目前在人们追求回归自然、返朴归真，崇尚科学和热心健康投资的形势下，这些医药产品一定会有良好的市场前景。（2）生物农药利用生物农药防治植利用生物农药防治植物病虫害，是植物防病防虫的发展方向。在已有研究成果的基础上，利用廉价的银杏外种皮制造生物农药，积极开展植物病虫害防治，是获得绿色食品的重要保证。1.3.3.2银杏酸的毒性17(1)致过敏何静仁的研究表明银杏酸引起的过敏反应与细胞免疫及体液免疫状态有关，有文章报道GA(C13:0)能够被代谢成腰果酚(cardanol)，再进一步氧化成邻苯二酚(catechol)，从而引发过敏反应。(2)致突变有研究显示银杏酸和相关的烷基酚可引起精子染色体断裂导致胚胎突变。(3)肝损伤孙锴等的研究证实,银杏酸可呈剂量依赖性地抑制肝细胞线粒体的呼吸功能，并对氧化磷酸化有解偶联作用。.(4)胚胎毒性银杏酸在小鸡胚实验中显示出较强的胚胎毒性。含有16%银杏酸的银杏提取物，半数致死量为1.8 mg/只。(5)肾毒性Heckera等对GA潜在的细胞毒性相关研究显示，GA与人类角质形成细胞系HaCaT细胞共孵育18 h,调亡细胞的比例接近80%，并诱导乳酸脱氢酶(LDH)的释放，电子显微镜分析显示可抑制溶酶体酶的形成。(6)神经毒性Ahlemeyer等的研究证实了银杏酸的神经毒性作用，银杏酸浓度依赖性的诱导鸡胚胎体外培养的神经细胞死亡，表现为染色质浓缩,核缩和蛋白质合成抑制剖放线菌酮损伤的减少，显示出积极类型的细胞死亡。基于银杏酸的毒性考虑，银杏酸酸是银杏药物半成品质量标准中一个重要控制指标1997年德国卫生部要求银杏叶提取物中和制剂中其银杏酸的含量不得超过5 ppm。中国药典2010版一部标准规定：银杏叶提取物中总银杏酸不得超过10ppm19。1.4国内外研究现状1.4.1 银杏酸的提取方法目前，银杏酸常用的提取方法有从银杏外种皮中提取银杏酸的方法很多，常用的提取方法有水提法、有机溶剂提取法、水提一树脂法、超临界C02提取法、细胞组织培养合成提取法、树脂提取法、酶提取法等。（1）有机溶剂萃取有机溶剂萃取利用化合物在两种互不相溶（或微溶）的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使化合物从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中。经过反复多次萃取，将绝大部分的化合物提取出来。可以通过银杏酸类化合物极性不同采用不同极性的有机溶剂进行萃取，达到分离银杏酸的目的。常用的提取溶剂主要有石油醚、甲醇、乙醇、正己烷、环己烷、氯仿等。马景哲、姚建标20-21对有机溶剂的提取条件进行了探讨：相对于极性溶剂，采用非极性溶剂直接提取，可以减少黄酮和多糖等水溶性和醇溶性杂质在粗提物中的含量。严凤兰等22用浸提法对银杏酸的提取条进行了探讨，工艺流程图如下：（2）超声萃取法超声波提取原理是将超声波产生的空化、振动、粉碎、搅拌等综合效应应用到中草药成分提取工艺中，实现击破细胞壁, 高效、快速提取细胞内容物的过程， 提取率较常规方法高。张蓉仙等23分别利用超声萃取制备银杏外种皮石油醚提取物和热水浴回流制取水提取浸膏，结果表明超声萃取工艺制备粗提物杀灭钉螺效果要好于回流提取方法。银杏外种皮粉碎超声萃取固液分离白果酸图1.5白果酸超声萃取工艺流程23（3）超临界CO2萃取法超临界CO2萃取分离过程的原理是利用超临界二氧化碳对某些特殊天然产物具有特殊溶解作用，利用超临界二氧化碳的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界二氧化碳溶解能力的影响而进行的。在超临界状态下，将超临界二氧化碳与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。当然，对应各压力范围所得到的萃取物不可能是单一的，但可以控制条件得到最佳比例的混合成分，然后借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体，被萃取物质则完全或基本析出，从而达到分离提纯的目的，所以超临界流体二氧化碳萃取过程是由萃取和分离组合而成的。尹秀莲等24对超临界CO2萃取法从外种皮中萃取银杏酚酸工艺可行性进行了研究，确定了超临界CO2萃取银杏酚酸的最佳条件，结果表明萃取压力为30 Mpa，温度45摄氏度，萃取时间6h，CO2流量为2 L/min为最佳条件。此种方法萃取外种皮中的银杏酚酸比传统方法优越,表现在得率、纯度高，无溶剂残留，操作简便。图1.6超临界萃取流程图24A：CO2钢瓶 B：过滤器 C：CO2冷凝器 D：CO2泵 E：止逆器 F：萃取釜 G：恒温水槽 H：针阀 I：分离器 J：排气口表1.1银杏酚酸各种提取方法的比较方法优点缺点有机溶剂萃取法传统方法，操作简单，溶剂廉价，成本较低，适用性广。提取率低，提取物所含杂质较多，部分溶剂有毒。超声萃取法加速植物中有效成分进入溶剂，增加有效成分提取率。比传统的提取方法省时、节能、提取率高25。只能作为辅助手段，不利于大规模生产超临界CO2萃取法萃取外种皮中银杏酸操作简便，萃取率和萃取纯度较高，无溶剂残留，环境污染小，优于传统的溶剂萃取法11。仪器复杂，对设备要求较高。1.4.2 银杏酸的纯化方法（1） 硅胶柱层析法硅胶柱层析法的分离原理：根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。银杏酸类成分是在苯环6位有饱和或不饱和长链烷基取代的水杨酸,由于其结构相似，化学性质相近,要制备银杏酸单体采用常规的如硅胶柱色谱分离等很难实现，故一般采用柱层析法对粗提物进行纯化得到总银杏酸产物。银杏酸粗提物用适量石油醚溶解，采用硅胶柱色谱分离纯化，以石油醚（60-90）：乙醚：乙酸(89111) 为流动相洗脱,淋洗速率为15 mL/min，每20ml收集一次，直到洗脱液在254 nm 处不显蓝紫色荧光为止26。（2）铅盐沉淀法傅永丰27等(1962) ，利用95%乙醇浸提白果肉,浓缩浸提液，加乙酸铅溶液,白果酸性成分以铅盐沉淀，分别用水、乙醇和乙醚洗涤,加稀盐酸研磨，使其铅盐分解，用乙醚提取其酸性成分，在用水洗涤乙醚层至无氯离子反应为止，干燥乙醚液，即得白果的总酸性成分，在一定的温度下有晶体析出,用不同溶剂重结晶变化，分离出白果酸、氢化白果酸和氢化白果亚酸。（3） 碱液萃取法a.Na2CO3萃取法向银杏外种皮石油醚粗提液中分步加入l mol/L Na2CO3水溶液,在磁力搅拌器上充分搅拌，多次萃取至TLC监测萃取液中无银杏酸，然后，萃取液用浓度约0.12 mol/L的HCl水溶液酸化,酸化后用石油醚多次萃取萃取液以分光光度法分析16。b.NaOH溶液萃取法向银杏外种皮石油醚粗提液中分步加入0.l mol/LNaOH水溶液,在磁力搅拌器上充分搅拌，多次萃取至TLC监测萃取液中无银杏酸，然后，萃取液用浓度约0.12 mol/L的HCl水溶液酸化，酸化后用石油醚多次萃取，萃取液以分光光度法分析16。（4） 大孔树脂吸附法大孔树脂又称全多孔树脂，聚合物吸附剂，一般为白色的球状颗粒,粒度在2060 目，是一类以吸附为特点，对有机物具有浓缩、分离作用的高分子聚合物。它具有较大的比表面积和良好的大孔网状结构，可以通过物理吸附及离子交换吸附从溶液中有选择地吸附有机物。树脂吸附作用是依靠它与被吸附的分子(吸附质) 之间的范德华引力，通过巨大的比表面进行物理吸附而工作,使有机化合物根据吸附力及其分子量大小可以经一定溶剂洗脱分开从而达到分离、纯化、除杂、浓缩等不同的目的。按照树脂与吸附组分间作用力不同，可分为大孔吸附树脂和大孔离子交换树脂，大孔吸附树脂又可分为极性、中极性和非极性三种类型，非极性吸附树脂适宜于从极性溶剂(如水)中吸附非极性物质，极性吸附树脂适宜于从非极性溶剂中吸附极性物质,而中极性吸附树脂则对上述两种情况都具有吸附能力，大孔离子交换树脂可分为大孔阴离子交换树脂和大孔阳离子交换树脂。秦俊哲等28对D101（非极性）、DA201（极性）、DM301（中性）、DS401（弱极性）四种大孔吸附树脂进行了比较，DA201对银杏酸的吸附分离效果最好。DA201对银杏酸的吸附为快速平衡型，银杏酸粗提取液上样浓度为0.45 mg/mL，静态吸附时间4h，动态上样流速为1 mL/min，银杏酸吸附容量为59.00 mg/g，洗脱剂乙醇浓度为95%vol，洗脱速度为1 mL/min，解析率为98.46%，银杏酸纯度为83.4%。尹秀莲、张洪国9,29通过对不同树脂吸附比较，找出了最佳吸附树脂以及最佳吸附条件。图1.9树脂吸附法薄层分析91 树脂纯化后的溶液 2 银杏酸标准品 3 石油醚提取液表1.2不同银杏酸分离纯化方法优缺点比较分离纯化方法纯化效果优点缺点硅胶柱层析法回收率：97.5%纯度：85.6%9银杏酸的纯化程度高。硅胶无法重复使用，纯化成本较高，硅胶柱具有不可逆吸附性造成银杏提取物中有效成分损失较大。大孔树脂回收率：92.5%纯度：85.6%9物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等。银杏酸的纯化程度高。 有关银杏酸的吸附理论研究不够。铅盐沉淀法无检测数据传统方法，操作简单，适用性广。有效成分损失较大，银杏酸的纯度不高，且产品中存在铅残留。碱液萃取法无检测数据操作简单。乳化严重，银杏酸的纯化率低。1.4.3 银杏酸单体的制备银杏酸类成分是在苯环6位有饱和或不饱和长链烷基取代的水杨酸，由于其结构相似，化学性质相近，要制备银杏酸单体采用常规的如硅胶柱色谱分离等很难实现，要得到纯度较高的单体标准物质，过程极其复杂和繁琐。目前研究者多采用制备高效液相色谱法分离得到银杏酸单体，但各自的分离方法有差异，现有关这方面的报道如下：(l)WatersDeltaPak柱，流动相为甲醇-l%HAc水溶液,流速12 mLmin-1，检测波长310 nm。分离时间60 min，得到5种银杏酸30。但在此方法下几种银杏酸的分离程度并不好，都没有基线分离,作者又通过重复制备来增加产物的纯度，最后经检验5种银杏酸的纯度都在98%以上，过程繁琐而且溶剂消耗量太大。(2)色谱柱BondpakTMC18，采用甲醇-水为流动相，流速5 mLmin-1，检测波长310nm，制备银杏酸C13:0纯度达98%31。该方法只是针对银杏酸C13:0的，其实分离效果由其报道的图可以看出，不是很理想，但就银杏酸al来说，分离也并不理想。(3)色谱柱林BondPakTMC18，以甲醇-水-醋酸为流动相，流速2 mLmin-1,检测波长245 nm，分离得到三种褐色油状物银杏酸产物32。流速太低与普通分析液相差不多，制备能力小。(4)色谱柱HIQ Sil C18流动相组成甲醇-3%HAc水溶液，流速3 mL/min，检测波长280 nm，多次制备后，分离得到纯度均达95%以上的6种银杏酸单体26。第2章 银杏外种皮有机酸的提取与纯化2.1 实验仪器与材料表2.1 试剂及原料试剂名称规格生产厂家甲醇色谱纯、分析纯国药集团化学试剂有限公司石油醚（6090）分析纯国药集团化学试剂有限公司冰醋酸分析纯中国上海试剂一厂无水乙醚分析纯天津市恒兴化学试剂制造有限公司硅胶试剂级青岛海洋化工厂分厂磷酸色谱纯天津市光复精细化工研究所银杏外种皮自制总银杏酸标准品中国药品生物制品检定所硅胶预制板GF254国药集团化学试剂有限公司表2.2试剂的物理性质试剂熔点（）沸点（）密度(g/mL,20)溶解性性状甲醇64.50.7914与水、乙醇、乙醚、丙酮、苯、氯仿混溶。无色澄清易挥发液体。石油醚60900.669不溶于水，溶于丙酮、苯、氯仿、乙醚。无色澄清易挥发液体。冰醋酸16.6117.91.0492溶于水、醚、甘油,不溶于二硫化碳。无色透明液体,有强烈的刺激性气味乙醚34.50.7147微溶于水,能与多种有机溶剂混溶。有愉快气味的无色、易挥发液体。表2.3 实验所用的仪器设备仪器设备名称型号规格生产厂家真空干燥箱DZX3上海福玛实验设备有限公司离心机H1850Cence湘仪精密増力电动搅拌器JJ1常州国华电器有限公司紫外分光光度计UV757CRT上海精密科学仪器有限公司电子天平AR2140Ohaus corp数显恒温水浴锅HH2常州国华电器有限公司数显鼓风干燥箱GZX9030上海博讯实业有限公司医疗设备厂傅里叶红外光谱仪IR200Thermo Elec-tron corp旋转蒸发仪RE52AA上海亚荣生化仪器厂循环水式真空泵YHE巩义市予华仪器有限公司高效液相色谱仪LT20A岛津公司高速多功能摇摆粉碎机XTP500A浙江市永康红太阳机电有限公司2.2实验过程以银杏外种皮为原料，提取纯化银杏酸的主要流程如下图：银杏外种皮晒干、粉碎石油醚回流提取两次减压蒸馏银杏酸粗提物分析检测粗提物过硅胶柱合并洗脱液并减压蒸馏银杏酸产物分析检测银杏酸产物的定性和定量分析图2.1实验流程图2.3银杏外种皮中银杏酸的粗提目前，银杏酸常用的提取方法有从银杏外种皮中提取银杏酸的方法很多，常用的提取方法有水提法、有机溶剂提取法、水提一树脂法、超临界C02提取法、细胞组织培养合成提取法、树脂提取法、酶提取法等。本课题采用有机溶剂提取法。有机溶剂萃取利用化合物在两种互不相溶（或微溶）的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使化合物从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中。经过反复多次萃取，将绝大部分的化合物提取出来。可以通过银杏酸类化合物极性不同采用不同极性的有机溶剂进行萃取，达到分离银杏酸的目的。常用的提取溶剂主要有石油醚甲醇、乙醇、正己烷、环己烷、氯仿等。由于银杏酸的极性较弱，采用非极性溶剂直接提取，可以减少黄酮和多糖等水溶性和醇溶性杂质在粗提物中的含量。马景哲、姚建标24-25等探讨了提取溶剂的选择，相对于乙醇等极性溶剂来说，石油醚提取的银杏酸的杂质更少。2.3.1石油醚提取总银杏酸的条件探讨（1）样品的预处理将银杏外种皮晒干，拣去其中腐烂的部分，用粉碎机粉碎，然后用60目的筛子过筛，置于冰箱中保存。（2）石油醚最佳提取条件确定影响银杏酸浸提效果的因素很多，如溶剂用量、提取温度和提取时间。在单因子试验的基础上，采用正交法设计试验确定最佳浸提条件，因素水平见表2-4。试验方法如下：准确称取干燥粉粹的银杏外种皮（干燥过后的）2.00 g，以石油醚为提取溶剂，回流提取一次，提取溶液离心后,用石油醚定溶到50 mL，取部分溶液过滤后，再取过滤后的溶液0.5 mL用甲醇稀释至2.5 mL，用高效液相色谱测定银杏酸的含量。银杏酸的得率（%）= （2.1）表2.4 正交试验因素水平表水平A温度（）B时间（h）C溶剂：皮量（V:W）16015:12701.510:1380215:1表2.5 正交试验结果水平A温度（）B时间（h）C溶剂：皮量（V:W）D银杏酸的总含量%111119.26212229.81313339.37421229.385223310.14623118.79731339.43832119.26933229.25K19.489.379.10K29.449.749.48K39.319.149.65R0.170.600.55将试验结果进行方差分析可知，3个因子对提取效果的影响与单因子试验结果基本相同。各因子对浸提效果影响的大小顺序为：提取时间（因子B） 溶剂用量（因子C）提取温度(A)。溶剂的用量对银杏酸的提取影响较大，随着溶剂量的加大，银杏酸溶出的量也随之增大。时间对银杏酸的提取达极显著水平，刚开始随着时间的加长，银杏酸的溶出量也增大，但是当时间达到一定程度时银杏酸的溶出量不再增加，并且当时间再加长时，已经溶出的银杏酸会有比较大的损失。温度对银杏酸的提取影响较小，当温度比较低，温度对银杏酸的溶出量影响较少，但是随着温度的升高，银杏酸的提取率会有所下降，说明银杏酸的热稳定性较差。随着溶剂用量的增加，提取次数增加，银杏酸的浸出量明显增加，但溶剂用量过大，不仅增加了溶剂费用消耗，也增加浓缩时的能耗。综合以上分析，银杏酸的最佳提取条件为A2B2C3，即以石油醚为提取溶剂，采用1:15（W/V）的料液比，在70 下，回流提取一次,提取时间为1.5 h,此条件下银杏酸的提取率最高。在此条件下，对提取次数进行了探讨，提取次数对提取率的影响如下图：图2.1 提取次数对银杏酸得率的影响通过实验数据分析，随着提取次数的增加，银杏酸的得率会增大，但是随着次数的增多，银杏酸的提取率变化不大，为了节省能耗和时间，银杏酸的最佳提取次数为两次。2.4 硅胶柱层析法纯化银杏酸硅胶柱层析法的分离原理：根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。银杏酸类成分是在苯环6位有饱和或不饱和长链烷基取代的水杨酸,由于其结构相似,化学性质相近,要制备银杏酸单体采用常规的如硅胶柱色谱分离等很难实现,故一般采用柱层析法对粗提物进行纯化得到总银杏酸产物。称量5.00 g的银杏外种皮，加入75 ml石油醚，在70 回流提取两次，每次1.5 h，将两次的提取液合并,浓缩到一定的体积。硅胶柱（27mm495mm），石油醚进行湿法装柱，并用洗脱剂排尽柱中的石油醚，湿法上样，洗脱速率为5 mL/min，每50 ml收集一次。由于银杏酸的极性较弱，因此采用石油醚进行洗脱，并用乙醚调节洗脱剂的极性，加入少量乙酸调节洗脱剂的酸性，pH大约为3左右。表2.6 流动相的探讨洗脱剂洗脱液检测结果石油醚：乙醚：乙酸（95:5:1）第一部分洗脱液没有银杏酸石油醚：乙醚：乙酸（90:10:1）第二部分洗脱液大部分为银杏酸，并含有少量杂质。第三部分洗脱液没有银杏酸石油醚：乙醚：乙酸（70:30:1）第四部分洗脱液没有银杏酸图2.2 第一部分的紫外扫描（95%的石油醚）图2.3 第二部分的紫外扫描（90%的石油醚）图2.4 第三部分紫外扫描（90%的石油醚）图2.5 第四部分紫外扫描（70%的石油醚）通过全波长扫描扫描主要有四类物质，这四类物质极性大小：第一部分第二部分第三部分第四部分，为了确定哪一部分是银杏酸，分别取第一、二、三、四部分的洗脱剂少许，进行高效液相色谱分析。通过文献查阅银杏酸的主要紫外吸收峰为220、244、310 nm。故选定了240 nm和310 nm两个检测通道。液相分析条件：流动相：80%95%的甲醇梯度洗脱，另加0.1%的磷酸，流速：1.2 mL/min,柱温：30 。图2.6 银杏酸的标准高效液相色谱图图2.7 第二部分的高效液相色谱图如图2.7所示，通过与标准高效液相色谱图比较，在310 nm和240 nm两个检测通道都能检测到银杏酸的存在，并且在240 nm处检测出一部分杂质。图2.8 第一、三、四部分的高效液相色谱图通过对图谱2.8的分析，第一、三、四部分没有检测到银杏酸的存在。综合以上分析：银杏酸主要集中在第二部分洗脱液，洗脱剂的最佳配比为石油醚：乙醚：乙酸=90:10:1。将含有银杏酸的洗脱液合并，真空挥去溶剂，得到的黄色油状物用适量石油醚溶解，用等体积的水洗3-4次除去产品中残留的乙酸。水洗后的石油醚溶液用无水硫酸钠干燥，真空浓缩得到纯化的银杏酸样品。2.5本章小结本章对银杏外种皮有机酸类化合物的提取纯化进行了研究，主要得出以下结论：（1）总银杏酸的提取：以银杏外种皮为原料，考察了石油醚提取银杏酸的四个影响因素：溶剂用量、提取温度、提取时间、提取次数，基本确定了石油醚的最佳条件：采用1:15的料液比，在70 下回流提取2次，每次1.5 h。（2）采用硅胶柱层析法对总银杏酸粗提物进行纯化，洗脱剂采用紫外全波长扫描和液相色谱结合的方法确定，并且确定最佳洗脱剂为石油醚：乙醚：乙酸=90:10:1。第3章 银杏酸的定性和定量分析3.1 银杏酸的薄层色谱法分析薄层色谱法(TLC)具有设备简单、操作方便、分离速度快、灵敏度与分辨率高以及显色剂选择性大等优点，样品的预处理比较简单,对被分离物质的性质没有限制,应用范围广，可同时平行分离多个样品,分离样品所需的展开剂量极少，既节约溶剂又减少了污染，固定相、流动相选择范围宽，有利于不同性质化合物的分离。由于薄层色谱法具有以上优点，使得其在医药工业、食品化学、环境化学及化学化工等方面被广泛应用。化合物的薄层定性分析可以根据其在一定的展开剂中的比移值Rf值来确定。Rf = 原点到斑点中心的距离/原点到展开剂前沿的距离 （3.1）取少量纯化的银杏酸，用适量的石油醚溶解，至于层析缸中展开，利用银杏酸在UV254下显示蓝色荧光的特性，将展开的硅胶板置于紫外灯下，观察蓝色荧光。探讨不同的展开剂对银杏酸的Rf值的影响:表3.1 不同的展开剂银杏酸的展开结果展开剂组成比例展开结果石油醚乙醚乙酸90:10:1Rf=0.26石油醚乙醚乙酸80:20:1Rf=0.51石油醚乙醚乙酸-70:30:1展开前沿有黄色物质，没有分开。本实验通过改变展开剂旳极性，来探讨银杏酸的分离情况。由于银杏酸是一类结构和性质相近的同系物，在采用硅胶板定性分析中，常以一个斑点出现。由表3.1可知，如果展开剂旳极性太大，银杏酸会分不开，石油醚的浓度在80%左右比较好。3.2 银杏酸的高效液相色谱分析高效液相色谱法是以经典液相色谱法为基础同时引入气相色谱的理论和实验方法并加以改善而发展起来的现代液相色谱。HPLC使用了细颗粒的填料作为固定相，其柱效大大提高，同时采用高压泵输送流动相、可梯度洗脱及类似于气相色谱的自动化检测技术，使其迅猛发展，成为现代分析化学中最重要的分离分析技术之一。3.2.1图谱分析液相色谱分分析条件：C18（2004.6 mm）,柱温30 ，流动相为甲醇0.01 mol/L的磷酸溶液（90:10），流速1.2 mL/min，检测波长310 nm。图3.1银杏酸纯化产物的液相色谱图图3.2 银杏酸粗提物的液相色谱图一般来讲，化合物在反相高效液相色谱中的出峰顺序与化合物本身的极性有关，极性大的化合物先出峰。银杏酸系列化合物的极性差异与其侧链的长短及侧链中双键的数目有关。如图3.2所示，六个化合物的出峰顺序是C13:0、C15:1、C17:2