分子生物学平台上的食品微生物快速检测及鉴定技术课件

分子生物学平台上的食品微生物快速检测及鉴定技术,在分子生物学技术上引领前行,3/23/2019,3/23/2019,Life Technologies Profile 美国生命技术公司,$3.2B,50,000,160,9,600,75,000,3,600,Note: LTM revenue as of September 30, 2009; does not include Mass Spec JV revenue,临床 分子诊断 基因治疗药物 再生医学,工业 生物制药 法医 食品安全 动物健康,科研 PCR技术 测序技术 细胞(分离, 操作，分析),“Tools Provider” 提供工具,“Solutions Provider”提供解决方案,Applied Biosystems 分子生物学技术的领导者,超过25年的分子生物学产品开发历程 1982年, 全球第一台蛋白质测序仪；1986年，全球第一台核酸测序仪 1986年，全球第一个实时荧光定量技术和TaqMan技术 全球30,000 个实验室的220,000 仪器正在被使用,3/23/2019,Life Technology 食品微生物系统解决方案,灵活的组合方案，满足不同层次的应用需求,3/23/2019,病原微生物样品制备,PrepSEQ 快速离心核酸提取试剂盒 AB专利的离心柱材料 较化学法，更加有效去除PCR抑制剂 步骤少、操作简单 可处理多达750uL的样品 无需额外的设备,适合少量样品,采用PrepSEQ快速离心试剂盒，结果明显优于普通直接裂解；尤其对于存在PCR抑制剂的样品，普通裂解法可能无法检出， 而PrepSEQ快速离心法可以得到一致的结果,样品：巧克力 检测项目：沙门氏菌,样品：布里奶酪 检测项目：李斯特菌,*标注的是因PCR抑制剂的存在导致样品中待测菌无法检出,3/23/2019,Sample,PCR compatible NA solution,Lysis,MME-96 核酸提取仪 自动化 高通量,自动化的理想选择,PrepSEQ 核酸提取试剂盒 提高核酸回收率 有效去除抑制剂 食品，环境及临床样品,病原微生物样品制备,+,自动化的核酸提取流程，一次最多处理96个样品,3/23/2019,样品制备,软件,RapidFinder Express 软件,PrepSEQ RapidSpin 样品制备 系统,检测试剂,MicroSEQ 食品致病菌 检测试剂盒,仪器,7500 快速 实时荧光定量PCR仪器,PrepSEQ NA Extraction 样品制备 系统,食品致病菌检测解决方案,3/23/2019,食品及环境病原微生物检测,致病菌系列 沙门氏菌 （AOAC certificated） 单增李斯特菌（AOAC certificated） 李斯特菌属 （AOAC certificated） 大肠杆菌O157:H7 （AOAC certificated） 阪崎肠杆菌 空肠弯曲杆菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 弯曲杆菌多重检测：空肠/大肠/红嘴鸥 金黄色葡萄球菌 创伤、霍乱和副溶血性弧菌的多重检测 定制设计 环境和生物安全系列 军团菌属定量检测试剂盒 嗜肺军团菌定量检测试剂盒 土拉弗朗西斯菌检测试剂盒 炭疽芽孢杆菌检测试剂盒 布鲁氏菌属检测试剂盒 鼠疫耶尔森菌检测试剂盒,3/23/2019,最新O157:H7检测试剂盒：提升特异性,引物、探针设计：基于 SOLiD 测序技术分析结果 新的设计，针对O157:H7特有的序列，避免O55:H7被测出 - 双重目标基因设计，提高特异性 - 将O55 全基因组测序，并与 O157相比较,3/23/2019,TaqMan 实验数据验证： 包括低浓度的O157:H7/HM 不同菌株 包括对非O157:H7的大肠杆菌菌株的检测 不含O157的真实牛肉样品,最新O157:H7检测试剂盒：提升特异性,3/23/2019,O157:H7检测试剂盒：8小时内获得结果,6小时 BHI 增菌,60分钟 DNA 提取,40分钟 PCR,25g 牛肉,手工操作时间 1小时,10 分钟,10 分钟,整个流程 8小时,MicroSEQ 大肠杆菌 O157:H7 工作流程,10分钟样品 制备设置,10 分钟,10分钟 PCR 设置,市场上最快的检测方法 已经获得 AOAC 及 AFNOR 的认可,3/23/2019,MicroSEQ 沙门氏菌检测操作流程 快速获得结果，最少的手工操作时间, 18 小时获得结果,过夜增菌,提取 反应设置 运行及分析,3/23/2019,16S rDNA,双氮养弧菌与创伤弧菌，解蛋白弧菌与副溶血性弧菌，最小弧菌与霍乱弧菌的亲缘关系很近 基于公共数据库， AB自有数据库，特定基因测序分析，筛选出针对三个目标菌种的8个不同基因的19个Assay,MicroSEQ 微生物鉴定系统,快速同时检测创伤弧菌，副溶血性弧菌，霍乱弧菌,3/23/2019,弧菌多重PCR设计,考虑到多重检测在一起的相互影响，三个不同的种分别设计了1-2套不同的Assay,3/23/2019,优化配方， 最终实现弧菌的多重检测,通过不同的荧光标记，将副弧、霍乱、创伤这三个不同种的弧菌区分开来,3/23/2019,开放的系统:满足不同的食品检测需求,致病菌检测试剂盒 沙门氏菌，单增李斯特菌 大肠杆菌O157:H7 空肠弯曲杆菌，金葡菌 绿脓杆菌，副弧/霍乱/创伤 军团菌,坂崎杆菌,个性化订制 引物、探针合成服务,转基因检测试剂盒 玉米转基因检测试剂盒 大豆转基因检测试剂盒,动物健康检测试剂盒 禽流感，新城疫 蓝耳病，猪胎毛滴虫 猪肺炎支原体，猪瘟 蓝舌病，副结核 牛病毒性腹泻病毒 牛呼吸道合胞体病毒,客户实验室设计合成 实验室设计,人类传染病检测试剂盒 甲型H1N1检测 甲型流感通用型 流感亚型 H5/H7/N1 炭疽芽孢杆菌/布鲁氏菌 鼠疫耶尔森 土拉弗朗西斯菌,肉类ID鉴定试剂盒 猪肉ID鉴定 牛肉ID鉴定 鸡肉ID鉴定,3/23/2019,3/23/2019,OpenArray定量PCR微流体芯片,Hydrophilic,Hydrophobic,SPATIAL MULTIPLEXING,3072 个通孔： 相当于 32 x 96孔板或者 8 x 384微孔板,3/23/2019,TaqMan OpenArray 玻片: 格式,OpenArray SNP芯片：格式,3/23/2019,为什么使用 OpenArray 做病原体检测,一次实验，检测并定量多种病原体生物 一次检测多样本 快速出结果 灵敏度和准确性优于标准的培养法和免疫法 Life Tech 可以帮助用户设计所需的芯片,3/23/2019,应用案例：人类病原体检测,来自Robert Slinger 小组在加拿大安大略省儿童医院的实验结果 从临床样品(咽喉拭子棒）快速检测多种呼吸道病毒或病菌. 验证 在OpenArray 平台上检测纳升级别的qPCR反应的适用性,“We wanted to see if we could use qPCR to figure out the cause of infections, and thought the OpenArray platform had the most potential because we could do thousands of reactions at once,” Robert Slinger, CHEO,3/23/2019,Viral Influenza A-pan Influenza A H3, H1 & H5 Influenza A H1 Swine 2009 strain Influenza A N1 oseltamivir-resistance mutation Influenza B Respiratory syncytial virus A and B Parainfluenza virus 1-4 Rhinovirus Enterovirus Coronavirus OC43, NL63, HKU1, 229E Human metapneumovirus Bocavirus Adenovirus,一张芯片整合多种呼吸道病原体检测,Bacterial Mycoplasma pneumoniae Chlamydophila pneumoniae Legionella pneumophila Mycobacterium tuberculosis Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Staphylococcus aureus Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Streptococcus dysgalactiae subsp. Equisimilis (Group C and G streptococci) Streptococcus agalactiae (Group B streptococcus) Haemophilus influenzae Moraxella cararrhalis Bordetella pertussis Bordetella parapertussis,One sample,每个样本检测22种呼吸道病毒和 16种呼吸道 细菌 每张芯片检测12个样本 每个检测3重复 每个病毒检测3个target 每个和样品8个空白对照 内参人工合成对照,qPCR Assays,3/23/2019,MicroSEQ 微生物鉴定系统,3/23/2019,微生物鉴定分型发展的三个阶段,第一阶段：依据表型鉴定分型 培养、格兰氏染色、生理生化、形态学等 黄金时代：上世纪80年代- 本世纪初 第二阶段：片段长度多态性分析 限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增的多态性DNA(RAPD)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、细菌的核糖体基因分型(Ribotyping)、多位点序列分析(MLST)、扩增片段长度多态性(AFLP) 、重复序列扩增(rep-PCR) 黄金时代：本世纪初-至今 第三阶段：基因序列分析（分子生物学的方法） 采用测序技术，确定目标基因的每个碱基 黄金时代：现在- 未来5-10年/下一代单分子测序技术产生,3/23/2019,基于16S核糖体基因测序的鉴定方法 伯杰氏手册推荐,细菌命名学的新标准 伯杰氏系统细菌学手册采用16S rDNA 测序 提供更高的分类学信息 快速准确提供鉴定结果 客观性，重现性好 方便不同团体、实验室间信息共享和交流,正在成为微生物鉴定的金标准,3/23/2019,MicroSEQTM 微生物鉴定系统,不需要事前掌握微生物的信息 微小的可见的单菌落即可 无需革兰氏染色 无需生化试验 无需鉴定的经验,Easy 5-step Workflow,3/23/2019,结果 数据比对结果,种 最高匹配 同源性 遗传进化树 差异,3/23/2019,MicroSEQ ID 经过验证的强大数据库,全部经过验证 16S 500: 2020 entries 16S 全基因: 1261 entries D2 (真菌): 1113 entries 每隔一年半定期更新 新增加的菌 最新的命名原则 包括诸多环境分离菌的信息 使用者可以登录公司网站提供建议 ,最大，最全面且经过验证的细菌和真菌数据库,3/23/2019,MicroSEQ ID 鉴定技术的特点,MicroSEQ ID 的方法 准确 重现性好 稳定 简单 将不能或难以鉴定的微生物种类从20 下降到2！,3/23/2019,微生物鉴定及菌株分子分型 满足不同层次的应用需求,MicroSEQ微生物鉴定系统 基于16S rRNA 序列测定实现细菌在种水平的鉴定 基于核糖体大亚基 (LSU) 序列测定实现真菌在种水平的鉴定 菌株分型的分子平台 测序检测 MLST 片段分析 AFLP MLVA 微生物耐药机理的研究 SNaPshot Multiplex SSCP,3/23/2019,遗传分析仪在MLVA研究中的应用,多重 PCR 选择正确的扩增引物是取得成功的关键 16 个甚至更多的 STR 位点同时被扩增,7 repeats,8 repeats,STR 位点 由特定引物延伸的旁侧序列具有保守性 不同菌株的串联重复序列拷贝数存在差异,由遗传分析仪电泳分离PCR扩增产物/片段 结合不同的荧光染料标记和迁移率的修饰技术，实现多重分析,3/23/2019,STEC O157/ Salmonella Typhimurium Protocol,MLVA 是食源性微生物分型国际组织Pulsenet推荐的食品微生物分型方法， 中国CDC及各省级CDC均设立相关机构参与其中.,3/23/2019,大肠杆菌7个位点的 MLVA， 实现对O157:H7 的分型,Lindstedt, et al. (2003) Ann. Clin. Microbiol. Antimicr., 2, 12. Seven locus MLVA scheme in a single dye channel Identified 47 distinct MLVA patterns among 73 O157:H7 strains,Sequence alignment of the Vhec4 VNTR loci from isolates G5300 and IHE5344. The results from the sequencing show that the electrophoretic mobility shift between isolates IHE5344 (upper strand) and G5300 (lower strand) is caused by different numbers of AAATAG repeat units alone,Escherichia coli O157 MLVA Fragment patterns generated from seven