兽药残留分析技术课件

兽药残留分析技术,陈 品,华中农业大学动物医学院,第一节 概述,一、基本概念,指给畜禽等动物用药后蓄积或贮存在动物细胞、组织和器官内的药物或化学物质的原形、代谢产物和杂质。,1.兽药残留（veterinary drug residue),2.总残留物（total residue),指食品动物用药后，动物产品的任何食用部分中某种药物残留的总和，或指动物组织中可被提取的原型药物及任何具有毒理学意义的代谢产物的总称。,3.标示残留物（marker residue),4.靶组织(target tissue）,指总残留物中，在动物体内消除缓慢、残留量高、残留期长、性质稳定、有灵敏方法检测的组分。,指残留量高、残留物最后消除的组织。,二、兽药残留的原因,不正确用药,不遵守休药期,宰前用药物掩饰临床症状，以逃避检查,以未经批准的药物作饲料添加剂,药物标签指示用法不当,加工贮存过程中污染,接触环境中污染的药物,三、兽药残留种类,-兴奋剂 克伦特罗 沙丁胺醇 来克多巴胺,抗菌药 硝基咪唑类、,1.违禁药物,甲状腺抑制剂 丙硫氧嘧啶 甲巯咪唑,激素 己烯雌酚、睾酮、群勃龙、雌二醇、孕酮等,镇静剂 氯丙嗪、安定、利血平,皮质激素类 地塞米松、氢化可的松,呋喃类、氯霉素,2.毒性较大、休药期较长的药物,呋喃唑酮,阿维菌素类,磺胺类 磺胺二甲嘧啶 磺胺喹恶啉,喹恶啉类 卡巴氧 喹乙醇 乙酰甲喹,二氨嘧啶类 TMP,四环素类 金霉素 土霉素,苯并咪唑类 阿苯达唑 氟苯咪唑,左咪唑,氯羟吡啶 双甲咪 二嗪农等,工业污染物 如重金属,环境污染物 如二恶英,3.其他,四、兽药残留的危害,过敏反应,毒性作用,激素样作用,耐药性,环境污染,1.过敏反应,经常食用含低剂量抗菌药物的食品能使易感个体出现过敏反应，如青霉素、四环素、磺胺胺类药物及某些氨基糖苷类抗生素等。 这些药物具有抗原性，刺激机体内抗体的形成，造成过敏反应，严重者可引起休克、喉头水肿、呼吸困难等严重症状。,呋喃类引起人体的不良反应主要是胃肠反应和过敏反应，表现在以周围神经炎、药热、嗜酸性白细胞增多为特征的过敏反应。,磺胺类药物的过敏反应表现为皮炎、白细胞减少、溶血性贫血和药热。抗菌药物残留所致变态反应比起食物引起的其他不良反应所占的比例小。,青霉素药物引起的变态反应，轻者表现为接触性皮炎和皮肤反应，严重者表现为致死性过敏性休克。,2.毒性作用,急性中毒 如-兴奋剂,慢性中毒,磺胺类 肾损害,氯霉素 再生障碍性贫血,四环素 骨骼和牙齿发育,苯并咪唑类 致畸、致癌、致突变,二恶英 肺、肝肿瘤,3.耐药性,动物在经常反复接触某一种抗菌药物后，其体内的敏感菌株将受到选择性的抑制，细菌产生耐药性，使耐药菌株大量繁殖。 人体经常食用含药物残留的动物性食品，动物体内的耐药菌株可传播给人体，当人体发生疾病时，就给临床上感染性疾病的治疗带来一定的困难，延误正常的治疗。,已发现长期食用低剂量的抗生素能导致金黄色葡萄菌耐药菌株的出现，也能引起大肠杆菌耐药菌株的产生。,在正常条件下，人体肠道内的菌群与人体能相互适应，如某些菌群能抑制其他菌群的过度繁殖，某些菌群能合成B族维生素和维生素K以供机体使用。过多应用药物会使这种平衡发生紊乱，造成一些非致病菌死亡，使菌群的平衡失调，从而导致长期的腹泻或引起维生素缺乏等反应。,4.激素样作用,-兴奋剂（瘦肉精）引起中毒。,长期食用含低剂量激素动物性食品，肿瘤发生率上升。,同化激素用于促进动物生长，提高饲料利用率，目前多数国家已禁用。,5.环境污染,动物用药后，药物随粪、尿排到环境中，对土壤微生物和昆虫、水体均造成影响； 在土壤中检测到金霉素； 在土壤中残留的药物，可通过生物富集和生物放大作用影响人和其他动物；,五、最高残留限量和休药期,1.食品动物（food-producing animal) ：指各种人工养殖供人食用的动物。,2.可食组织（edible tissue) ：指全部可食用的动物组织，包括肌肉和脏器等。,3.最高残留限量（maximum residue limit，MRLs)：,指食品动物用药后，允许存在于食物表面或内部的残留药物或化学物质的最高量或浓度。一般以鲜重计，用mg/kg、 g /kg或mg/kg、 g/L。,兽药最高残留限量（MRL）的确定,最大无毒性作用剂量是根据最敏感实验动物（一般为大鼠、兔、狗）的毒理学试验，对动物不产生任何毒性的最大剂量。实际是一种从实验动物外推到人的安全性数据。具体来讲，就是根据兽药的三性（急性、亚慢性慢性）和三致（致突变、致畸胎、致癌）试验结果得来。,（1）最大无毒性作用剂量（No observed effect level，NOEL）的确定,（2）每日允许摄入量（Acceptable Daily Intake，ADI）的确定,每日允许摄入量是指可以被一个人安全地消费而不产生任何作用的量。ADI=NOEL/安全因子，其中安全因子，如果NOEL是根据急性试验得到的，安全因子为1000；如果NOEL是根据慢性试验得到的，安全因子则为100。,（3）最高残留限量（Maximum Residue Limit，MRL）的确定,根据ADI，计算出各种组织中的最高残留限量。,其中，组织消费量如下（按WTO推荐）： 肌肉 300g 脂肪 50g 肝脏 100g 肾脏 50g 蛋 100g 奶 1.5L,4.休药期（withdrawal time),指食品动物从停止给药到许可屠宰或其产品许可上市的间隔时间。,（1）影响药物残留消除和休药期的因素,药物的剂型与剂量 给药途径 合并用药和重复用药 动物年龄、性别、品种、个体差异 胃肠道环境及机能状态,（2）休药期估算方法,估算休药期的程序 确定靶组织 确定被测残留物 研究组织残留消除规律 数据统计处理,根据动物实验估算 按实际给药剂量和途径给药后停药 在MRLs附近设置至少4个采样点，采取靶组织样品 对样品进行残留分析 绘制残留消除半对数曲线图，用直线回归法对数据进行统计处理 将MRLs作为统计量估计时间的99%置信区间，取上限时间作为休药期 根据组织药动学参数估算,六、监控和防范兽药残留的措施,加强药物生产和使用管理，完善法规 严格规定药物的休药期和允许残留量 对药物进行安全性毒理学评价 加强兽药残留分析方法的技术研究,第二节 残留分析,1.筛选方法（screening method）,指在一定浓度内，用于快速检测大量样品的方法。如微物法、免疫化学法。,一、 残留分析中的常用术语,筛选方法的要求: 必须限定方法的特异性 允许出现假阳性，最低限度控制假阴性 检测限和定量限必须适合检测目的 方法快速简便,2.常规方法（routine meithod）,指可以基本确定样品中某种残留物存在和确定其浓度的方法。,要求 具有准确的定量分析能力 不一定具有准确的定性分析能力,方法 HPLC GC,3.确证方法,指用于测定并确证筛选方法和常规方法检测为阳性结果的样品中是否存在药物残留及残留量。,确证方法的要求 特异性高、定量分析能力强 精密度、准确度达到规定 检测限和定量限适合检测目的,常用方法 GC-MS、LC-MS、GC-IR、LC-IR,4.参比方法 （reference method）,指以被某国家或国际机构验证和接受的法定性确证方法，可用于验证有关方法的精确度和精密度。,5.标准分析物（standard analyte）,指在分析中用作参比的高纯度已知物质，一般用于制作标准曲线或测定添加回收率。,6.特异性（specificity ）,指样品基质中其他组分共存时该分析方法对待测物的分辨能力，有时称选择性。,7.准确度（accuracy）,指测定值与其真实值的接近程度，反应分析结果的正确性。通常用添加回收率（recovery）表示。,添加浓度m（mg/kg） 回收率（） m0.1 80110 0.1m0.01 70110 001m0.001 60120 m0.001 50120,不同添加浓度的回收率原则要求如下：,8.精密度（precision）,指在限定条件下，用某种测定方法重复测定同一均质样品所得测定值的彼此接近程度。反应分析结果的重复性和重现性。通常用变异系数（CV）或相对标准差（RSD）表示。,不同待测物浓度的精密度要求,9.重复性,重复性（repeatability）：指在短期内相同条件下，测得的同一样品各个相互独立分析结果的符合程度。,相同条件：同一实验室、同一操作者、同一批号试剂、同一样品、同一仪器、同样分析方法,表示方法： 日内变异系数或批内变异系数 日间变异系数或批间变异系数,10.重现性,重现性（reproducibility）：指在不同试验条件下，测得同一样品各个相互独立的分析结果的符合程度。,不同条件：不同实验室、不同操作者、不同仪器、同一样品、相同的分析方法。,11.检测限与定量限,检测限（limit of detection，LOD）：指某种分析方法能够从样品的背景信号中检出待测物存在的最低浓度。反应分析方法的灵敏度，一般为空白测定平均值加2倍或3倍标准差（信/噪3）。,定量限（limit of quantitation）：指某种分析方法能够对样品待测物进行定量测定的最低浓度。具有精密度和准确度要求，反应方法在低浓度端分析结果的可靠性，为空白测定平均值加10倍标准差。,二、残留分析的原理,兽药残留的特点 残留水平低 ，大多在0.0011mg/kg 样品基质复杂，残留物不易分离纯化,基本原理：用物理或化学的方法将待测残留组分从样品中提取、分离、纯化，溶于适当溶剂，利用其光学或波谱特性，进行定性定量检测。,三、残留分析方法的分类,1.按分离或检测原理分：,理化分析法 波谱法、色谱法及联用技术 HPLC、GC、TLC、-、LC-MS,免疫分析法 放射免疫 酶联免疫、荧光免疫,生物测定法 微生物法 放射受体测定法,筛选方法 常规方法 确证方法 参比方法,3.按被测组分分,单组分 多组分,2.按残留分析目的和用途分,四、残留分析方法的建立,查阅文献、设计分析方法 建立基本测定方法 包括确定测定方法、线性范围 建立样品处理方法 绘制标准曲线 外标法 内标法 确定检测限和定量限 测定样品回收率和变异系数 稳定性分析 温度 放置时间,（一）残留检测方法标准结构,（二）样品提取及分析技术路线,（三）分析方法评价及其标准,检测限与定量限 添加回