麻风病复发的微生物学和免疫学检测（诊断中国麻风防治协会课件

麻风病复发的 微生物学和免疫学 检测（诊断）,中国医学科学院皮肤病研究所 吴勤学 2008.9,写在前面 麻风病命名与麻风杆菌 麻风病复发定义及原因 麻风复发的监测和检测 展望与推荐,写在前面,说癞 麻风病是由麻风杆菌引起的慢性传染病，是皮肤病的一种，亦称癞。由于本病严重者可致面部毁容和四肢畸残，给人以丑陋的外貌，人皆惧之。 古时由于不能解其病因而讹传为道德败坏，祖上缺德，视为“天谴”，人皆唾之。终遭致麻风患者被歧视、迫害，甚至火烧、活埋乃至枪杀，其惨无比，人皆恐之。 即使不如此，由于怕传染，也要隔离，麻风村（院）不是建在深山，就是孤岛，抑或江滨，基本上与世隔绝，生活上苦不堪言，人皆畏之。,麻风病控制已经取得了令人瞩目的成绩，尤其在采用标准联合化疗（MDT）方案后。但在看到成绩的同时必须正确地对待和科学地加以分析： 就全球而言，计算麻风达标是以全球人口作为分母，而实际上麻风病在许多发达国家已几乎不存在。在我国达标亦是以全国人口作分母的。所以是人为的统计学的指标，未能完全反映问题的实质； 某些国家2000年底并没达到消灭的目标（我国有的省、地区亦然），在2005年(即使2008)这一目标仍然难以达到；,历史的回顾：成就现状未来,写在前面,所谓的消灭，只是表明登记病例的患病率的降低，它不等于实际患病率的降低。因为某些国家卫生服务人群覆盖率远远低于100%，导致某些地区大量病人未被发现，即使卫生服务覆盖较好，亦仍存在发现不足和延迟发现的情况； 即使在登记患病率低于1/万的某些国家，麻风仍然是重要的公共卫生问题。因为不论从国家水平、还是从省、州、县级水平上看，都存在着大量病人尚未发现和患病率仍然保持在高水平，发病地区不平衡，我国目前云、贵、川、藏就是这样情况。国外主要集中在印度、巴西、缅甸、印度尼西亚、马达加斯加和尼泊尔；,过去的15年中每年新发病人数已趋稳定，1998年后稳中有降；但某些国家和地区新发病人数仍呈上升之势。 这些告诉我们：实际患病率与登记的患病率可能有很大的不同；虽然登记患者数已明显下降，但全球新病人发现率并未减少。此外，尚无有证据表明，一旦患病率降到预先规定的水平，麻风病将会自然消灭。 结论 很可能会有显著数量的新病人在今后很多年内继续出现，即使在那些已达到规定消除目标的国家和/或地区麻风控制活动亦必须确保继续进行。,麻风病,麻风病的命名 麻风病病原体麻风杆菌,麻风病的病名,麻风病是一古老的慢性传染病，其病名多种多样 Set （埃及） Zaraath （西伯来文圣经） Leprosy （英、美） Aussatz （德国） Judham （阿拉伯语） Kushtha （印度） 癞病 业病 例外 傍居 （日本） 疠 疠风 厉 大风 癞疾 癞病 癞 恶疾 天刑 麻疯 癞风 大麻疯 麻风 （我国 ） 现统称：leprosy（麻风） 或Hansen disease（汉森病）,麻风病病原体麻风杆菌（1）,Mycobaterium leprae，ML，麻风菌 Hansen 1873年发现，1974年公开发表 放线菌目，分枝杆菌科，分枝杆菌属，唯 侵人、动物N 比Mtb发现早9年 体外尚不能人工培养，有动物模型,麻风病病原体麻风杆菌（2）,ML一般特征 ZN染色（+）、G+ ZN染色光镜下：长18m ，宽0.3 0.4m ，短小直棒状或略弯曲，无鞭毛、芽孢 1条菌重：3.91.0（SD）10-14克 基因组：2.8Mb，能编码1600种蛋白，比Mtb低，有假基因,麻风病病原体麻风杆菌（3）,染色特点：Z-N粉红色，抗酸性，吡啶可提取，过碘酸染色可恢复 形态特点： 多形性杆 断裂 串珠 颗粒 簇集性形成球团（束） 菌球 形态与活力相关（图）,麻风病病原体麻风杆菌（4）,ML的生物学特征 世代时间：长，平均11-13天(鼠足垫) Mtb 20h 最适生长温度：30 36 最小感染量：3 40条活菌 活力与致病性：4保存组织匀浆7-10天活力不变； 致病力与种族、地理环境无关； 高平顶株与低平顶株比免疫原性强,麻风病病原体麻风杆菌（5）,ML对物理因素的抵抗力 平皿中 32.5 湿度78% 活28天 32.0 湿度32% 活14天 土壤中（室温） 活43天 0.5N NaOH (20) 活力不变 10%二甲基亚砜(DMSO) (4) 保护剂作用 紫外线照射(2M距离30)和日照(2h) 活力下降 煮沸(30)和高压(1520) 死亡 （焚烧更彻底）,麻风病病原体麻风杆菌（6）,ML对化学物质的抵抗 0.5NaOH和10%DMSO 见上页 抗麻风药物：DDS B663 RFP OFLO（氧氟沙星） MINO（米诺环素） CLARI（甲红霉素） 有不同程度的杀ML作用,麻风病病原体麻风杆菌（7）,ML的临床检验 细菌形态指数（MI） 描写ML形态变化的指标，判定菌的活力用 细菌密度指数（BI） 反映取材部位菌负荷量的参数，对麻风的临床诊断和分型非常重要,ML的临床检验细菌形态指数（MI）,MI是ZN法染色涂片最常用的描写菌形变化的指数。有人认为，ML出现变形，即出现菌体不完整或着色不均匀的细菌，表示细菌处于不利状态，丧失了活力或趋于死亡。这种现象在有效治疗后更为明显。这种形态上的变化往往早于BI的变化。,ML的临床检验细菌形态指数（MI）,MI的计算方法 涂片的每个涂膜计完BI之后应随机计算MI。计算MI时，只计算单条分散的ML(包括完整均匀染色菌，断裂菌及颗粒菌)的数目及其中包含的完整均匀染色菌的数目，不计算菌球或菌束中的细菌数，涂膜的BI在3+以上时，每个涂膜要计数100条菌以上。如涂膜的BI为2+以下时，可不必计足100条菌。如涂膜内细菌很多时，可在目镜内加一带方孔的纸片，将视野缩小使之易于计数。在计数MI时，如涂片上ML较多，最好计足200条或200条以上ML。如计数的细菌太少，MI则缺乏参考价值。每个涂膜计数完毕后，按公式求出该例MI，计算MI不留小数。,MI的计算公式,ML的临床检验细菌形态指数（MI）,ML的临床检验细菌密度指数（BI）,细菌密度指数（BI）：反映取材部位菌负荷量的参数 细菌密度标准*：按Ridley对数分级法，每级相当于10倍之差,*：3+6+至少检50野，阴性至少检100野，若100野 仅见1条菌仍计为“1+”,ML的临床检验细菌密度指数（BI）,细菌密度指数（BI）计算法,如：右耳5+，左耳5+，眶上4+，下颏3+，病损4+,一般常规查4-6处，次数一般一年一次，疗前疗后必查；其次依需要而定，但不宜少于3个月（BI下降很慢）,ML的病原学意义 ML是麻风病的病原体 根据患者的病理、免疫及临床表现，通常分： 瘤型（LL） 界限偏瘤型（BL） 中间界线类（BB） 界线类偏结核样型（BT） 结核样型（TT） 未定类（I） LL/BL/BB又称多菌型（MB） BT/TT称为少菌型（PB） 麻风反应 型麻风反应 主要发生在BB、BT、TT患者 型麻风反应（ENL） 主要发生在LL、BL患者,麻风病病原体麻风杆菌（8）,麻风病病原体麻风杆菌（9）,麻风患者查菌及免疫状态,治疗有效：BI MI BI 0.61.0/年的下降速度 过快：分型不准 过慢：服药不规则，耐药？ MI 半年内看到下降，初判疗效有用,麻风患者查菌及免疫状态,质控：多部位 选有可能阳性的材料 涂片：玻片质好，无脂，无划痕，不重复用（如用干烤1672h） 染色：染色、脱色、复染时间 方式 读片：高水平技术人员，统一标准，培训 其它：编号、记录、保存（褪色）,麻风患者查菌及免疫状态,免疫状态： LL BL 细胞免疫能力 体液免疫能力 TT BT 细胞免疫能力 体液免疫能力 （实际上，TT、BT免疫能力正常或接近正常。上述描写指MB、PB相比较时）,麻风患者查菌及免疫状态,小结,小结,麻风动物模型 小鼠足垫接种：正常小鼠 104条ML/0.03ml足垫 平均6个月有限增殖到106条ML/足垫 免疫抑制小鼠：小鼠胸腺摘除后加全身X线照射(900R) ML可增殖到108-109/足垫 其它：先天无胸腺裸鼠，九带犰狳，黑猩猩，猕猴 用途 麻风实验化疗连续法 动力法 鉴定耐药菌株 持久菌的检测 麻风病原学研究 麻风传播途径的研究,麻风多聚酶链反应 分子生物学方法 敏感性和特异性都高 目前仍用于研究工作中,麻风复发,Beck-Bleumink复发的定义（1992） 新皮损 原皮损再活跃 两组皮损刮片BI2+或2+ 新神经功能损伤 皮肤或神经活检中出现复发证据 眼出现（瘤型）麻风活跃 后来亦有把定义简化为： 皮肤切刮液涂片出现ML或一个新皮损涂片有含完整菌的高BI，有组织学上证据，新损害中ML可在鼠足垫生长,复发的定义及其演变,Boerrigter等： 一个新皮损出现或原皮损增大，有临床和组织学证据 Paudian等：（7个标准） 皮损扩大，浸润，红斑，产生新皮损，神经痛和肿大，新的肌肉麻痹，BI阳性 第6届WHO专家组会议同意上述标准(1988)，提出：MB复发临床上容易识别，但在完成治疗后产生的PB复发与逆向反应很难鉴别,麻风复发,复发的定义及其演变,近来复发的定义 DDS单疗复发定义 病人疾病在痊愈后疾病再现 MDT复发定义（WHO，1988） 病人在完成MDT规定疗程，在监测或监测时段后又发生新麻风症候和症状者谓MDT复发。,麻风复发,复发的定义及其演变,复发原因,耐药 DDS单疗即使很好完成，复发者达50%(MB) 持久菌 即使MDT，亦有10%的MB存在持久菌。 其它原因,麻风复发,复发原因耐药,耐药菌株的定义 在抗感染的化学治疗过程中，由于致病微生物对药物产生耐受性，敏感性减弱以至丧失，造成疗效降低或丧失，甚至病情恶化，这种现象谓之耐药性（或称抗药性）。这种具有耐药性的细菌则称为耐药菌株。,耐药菌株的实验室检查 MI 接受有效抗麻风药物治疗的瘤型麻风病人6-9个月期间MI不下降到5%以下，或开始下降后又上升者，疑为可能耐药。 BI 经3-5年有效(规律地)DDS治疗的LL和BL病人BI下降不明显或有上升趋势，或开始下降后又上升者，疑为可能耐药。 病理变化 若经一定期间的DDS治疗病理上浸润未见好转，甚或出现组织样麻风瘤图像者，应考虑耐药的可能,复发原因耐药,复发原因耐药,耐药菌株的实验室检查结合临床证实 长期正规足量DDS治疗，病情持续恶化者 长期正规足量DDS治疗，病情好转但以后停顿不前，有的还出现恶化，但改用其它抗麻风药物治疗后临床改善，BI又重新下降者 不规则小剂量治疗或开始用小剂量治疗后用小剂量维持，临床无改善或恶化 已达临床标准，复发后用DDS再治无效 有组织样麻风瘤损害（histoid leproma） 对上述病例可进行“核实治疗”：在严密管理与观察下，每日口服100mg DDS或肌射二乙酰氨苯砜（DADDS），每周注射300-400mg，正规治疗6个月，MI、BI、病理均不见效，临床亦无进步或恶化者，可定为临床耐药。,复发原因耐药,耐药菌株的实验室证实 鼠足垫接种证实是较可靠办法，一般观察6-12个月，连续给药,复发原因耐药,耐药的原因 小剂量和不规则治疗 病人吸收药物不佳 交叉耐药(与长效磺胺) 耐药的危害 治疗困难；耐药菌株流行 耐药药物 DDS治疗6年后 DPT治疗后2-3年 D63、RF都发现了耐药菌株,复发原因耐药,耐药的防止方法 规则足量治疗 联合化疗,复发原因持久菌,持久菌 即使MDT，亦有10%的MB存在持久菌 持久菌存在的地方： 皮肤神经（Dharmendra,1973） 平滑肌（Harman,1965） 淋巴结（Kauretal,1975） 虹膜（Hashizuma et al,1965） 骨髓和肝脏（Karal et al,1972）,治疗不足 治疗依从性差 仅DDS单疗治MB PB单用RF治疗 PB有多个皮损和N受累 免疫力下降 再感染,麻风复发,复发原因其它原因,麻风复发,耐药菌与持久菌的区别,复发原因,1995年WHO报告 DDS 1940s发现，单疗10年后复发率30%，30年累积复发危险达40%，3%/人年 MDT 10年后，观察20 000 MB（复发率0.77%), 50 000 PB（复发率1.07%） 危险率比DDS单疗低10倍,麻风复发,复发的危险性,复发潜伏期,DDS单疗 55%57% PB 3年 BB 5年内 MB 6年内 MDT 55%57% PB 3年 MB 平均9年,麻风复发,亦有报告 复发50%产生在MDT停后头三年,75%在6年内。 PB50%产生在MDT后2年半内，75%在5年内。且复发危险不是与时俱进的，即若一个病人在5-6年内不复发，以后复发可能性很小。 MDT后复发危险性低，且大多产生在5-6年内，故监测意义不大，可以宣布病人“治愈”了。 MDT预防复发效果比DDS高90%，可以说，10年可以减少复发达1/2百万。 （以上是WHO1995年结论）,麻风复发,复发潜伏期,联合化疗复发的诊断标准,少菌型麻风 在完成WHO少菌型联合化疗方案治疗6个月后，在监测期或其后原损害再活动或加剧，或又发生新的麻风症状和体征。,已达临床治疗标准后又发生新的活动性皮损，或虽未达临床治愈标准，但损害加剧或其病情趋向静止后原有皮损再活动，如浸润加剧和皮损扩大 皮肤涂片查菌持续阴转后，在监测期或其后又重现抗酸杆菌，且任何部位细菌密度2+者；或在监测期或其后皮肤查菌虽未阴转，但连贯次皮肤涂片检查，任何部位细菌密度较前增加2+或2+以上，或有完整染色菌者 皮肤活检的组织病理学检查抗酸染色阴转和肉芽肿完全消退后，又重现活动性麻风特异性病理改变 ，抗酸染色细菌密度在2+或2+以上，且有完整染色菌者 鼠足垫接种证实有活菌者,多菌型麻风 在完成WHO多菌型联合化疗方案治疗2年后，又出现下列情况之一者,联合化疗复发的诊断标准,麻风复发的监测与检测,监视新合成蛋白的免疫反应 氨基酸序列不同 监视血清抗体水平 现有方法：PGL1-ELISA或35KD-ELISA 我们用ND-ELISA 监视白细胞介素水平 麻风患者的细胞因子模式,麻风复发的免疫学诊断方面,ML计数法评估菌的荷量：BI ML活力的测定：活菌引起复发，死菌抗原成分引起免疫 体内法： 鼠足垫接种（正常鼠、免疫抑制鼠） 体外法：1）细菌指数（MI） 2）荧光二乙酸溴乙锭染色法（FDA） 3）激光微探针质量分析（LAMMA） 4） ATP测定 5） M试验 6）其它体外试验,麻风复发的监测与检测,麻风复发的微生物学诊断()传统法,DNA靶探针 敏感度为104105 RNA靶探针 比DNA稳定性差 PCR 敏感性达1-10条菌，在PB，6075%阳性 但死菌也可阳性 RT-PCR 80%PB复发和25%RR试验阳性,麻风复发的监测与检测,麻风复发的微生物学诊断() 分子生物学法,小 结,问题的提出,治愈后复发的疑问（三个“R”） 是菌没有真正杀死，抑或是什么药物浓度达不到的地方，停药后再燃(reactivition)? 是菌已被杀死，疾病痊愈，但死菌中的抗原惹起迟发超敏反应，抑或逆向反应(reversal reaction)? 是病人又获同一菌株，抑或不同菌株的再感染(re-infection)?,炎症和迟发超敏反应（DHR）,炎症（inflammation） 表现为疾病活动性，系疾病的天然（自然）过程。在此过程免疫（宿主与寄生物相互关系）未发生变动。 变态反应（DHR） 表现为逆向反应，系疾病一种恶化，过程加速，病情加重。免疫在反应时发生变化或病情迅速恶化或发生病型的改变。,再燃（复发）与反应,已愈疾病（治愈、静止状态）尔后再燃，病理学表现为正