儿童细菌性腹泻大肠菌群的的分离及遗传特性研究（ppt版）课件

儿童细菌性腹泻大肠菌群的 分离及遗传特性研究,一、 总述,二、材料与方法,三、实验结果,四、分析与讨论,概要,五、结论,急性细菌感染性腹泻病是儿童的常见病、多发病,也是造成婴幼儿营养不良、生长发育障碍的主要原因之一。常见腹泻致病菌有志贺菌、侵袭性大肠杆菌、沙门氏菌、变形杆菌、肺炎克雷伯菌等。 不同区域,不同季节,不同年代,不同年龄,不同风俗习惯等,其大肠埃希氏菌的分布,类别,流行性,致病性等均有很大不同,总述,总述,除了传统的临床检测措施外,分子生物学技术如ERIC-PCR、RAPD、16S rDNA PCR-RFLP等已大量应用到大肠埃希氏菌的检测中,具有检测准确、迅速的优点 。 将传统的大肠埃希氏菌分离技术与现代分子生物学技术结合,开展某区儿童细菌性腹泻大肠菌群的分离及遗传特性研究,为某区开展儿童细菌性腹泻防疫防控提供依据。,节首,材料与方法,1. 材料 1.1 样品获得 1.2 主要试剂 1.3 PCR引物 2. 方法 2.1 大肠埃希菌的分离与镜鉴 2.2 大肠埃希菌的生化鉴定,材料与方法,2.3 大肠埃希菌的16S rDNA鉴定分析 2.3.1 菌株基因组DNA的提取与检测 2.3.2 16SrDNA目的序列的扩增、检测 2.3.3 16SrDNA构建聚类树状图 2.3.4 16SrDNA测序及序列比较,节首,结果,1.,EMB选择培养基培养后,31份样品中有9 份样品检测出肠杆菌,其检出率29%。获得肠杆菌37株。,生化鉴定后初步表明有大肠埃希菌18株,2.,3.大肠菌群的16SrDNA PCR-RFLP,3.2 16SrDNA PCR,3.3 16SrDNA-RFLP酶切,3.4 16SrDNA序列系统发育树,节首,3.1 总DNA提取,16SrDNA-RFLP酶切,16SrDNA-RFLP酶切,1.,结果表明，16S rDNA PCR-RFLP聚类分析结果中，37个菌株在90%的相似水平上聚在一起，在97.5%左右的相似水平上，37个菌株形成了10个类群。,2.,群最大，由4-1，4-2等19个菌株组成；群次之，由7个菌株组成；群由菌株1-3，30-1，30-8组成；群包括菌株25-2和30-2；,3.,其余6个菌株单独构成不同群。,返回,16S rDNA序列系统发育树,C.freundii DSM 30039,R. planticola ATCC 33531T,K . pneumoniae DSM 30104 T,99,1-3,E.vulneris ATCC 33821,E.blattae DSM 4481,65,25-2,30-2,21-1,E.coli O157：H7,100,100,60,51,100,92,100,21-3,4-2,7-3,E.albertii LMG 20976,E.coli ATCC 11775T,E.fergusonii ATCC 35469,7-6,76,99,24,52,46,16S rDNA系统发育,1.,分支1为柠檬酸杆菌（Citrobacter） : 1-3,25-2,2.,分支2是克雷伯菌属（Klebsiella）: 2个同源性相差比较大的菌株:21-1,30-2,3.,分支3是大肠埃希氏菌种（E.coli）： 7-6,4-2,21-3,4.,分支4是费格森埃希菌种（E.fergusonii）: 7-3。,返回,98.2% 95.5% 95.5% 95.9% 96.6% 96.2% 97.8% 97.7% 99.9% 98.0% 96.6% 96.2% 96.2% 97.6%,25-2 98.8% 95.4% 95.8% 95.8% 96.5% 96.1% 98.4% 98.1% 98.3% 99.0% 96.4% 96.2% 96.1% 97.8% 96.4% 100%,21-3 96.5% 98.3% 96.3% 98.9% 99.9% 99.0% 96.7% 96.7% 96.5% 96.5% 99.6% 99.0% 99.2% 96.6% 100%,21-1 97.6% 95.3% 95.2% 95.9% 96.6% 96.0% 97.4% 99.7% 97.6% 97.4% 96.6% 96.0% 96.0% 100%,7-6 96.2% 99.0% 96.0% 99.5% 99.2% 99.7% 96.2% 96.0% 96.0% 96.2% 99.1% 99.7% 100%,7-3 96.3% 99.1% 96.1% 99.6% 99.0% 99.8% 96.2% 96.2% 96.2% 96.3% 99.2% 100%,4-2 96.4% 98.7% 96.5% 98.9% 99.6% 99.2% 96.6% 96.7% 96.5% 96.4% 100%,1-3 99.9% 95.5% 95.6% 95.8% 96.5% 96.1% 98.3% 97.7% 98.1% 100%,R.Planticola 98.3% 95.4% 95.5% 95.8% 96.4% 96.1% 97.7% 97.8% 100%,K.Pneumoniae 97.5% 95.5% 95.4% 95.8% 96.8% 96.2% 97.6% 100%,E.vulneris 98.4% 95.6% 95.3% 96.0% 96.7% 96.4% 100%,E.fergusonii 96.1% 99.2% 96.2% 99.5% 99.0% 100%,E.coli_O157 96.2% 98.3% 96.3% 98.9% 100%,E.coli_ATCC 95.9% 99.0% 95.8% 100%,E.blattae 95.5% 95.9% 100%,E.albertii 95.4% 100%,C.freundii 100%,30-2,96.7% 98.3% 100%,分析与讨论,EMB分离分析,生化检测与16S rDNA-RFLP,16SrDNA 序列联合分析,2.,1.,节首,31个样品在EMB上的检出率仅为29%,有22个样品 未检测出菌株,而临床31个样品均表现为腹泻现象。其中可能的原因有:导致腹泻的细菌性致病菌不一定全部可在现有实验条件下培养；部分可培养菌在样品中受损或被破坏,不能在培养上生长；非细菌性腹泻菌引起的腹泻如病毒类,在本实验条件下亦不能检测。,EMB分离分析,返回,本实验表明该地区儿童大肠杆菌群有10个类群。其中以大肠埃希氏菌为主，其比率超过50%，其次是克雷白氏杆菌比率为21.6%，弗氏柠檬酸杆菌占有率8.1%，其他菌占有率18.9%。表明该地区大肠杆菌群多样性非常丰富。,本研究中，引起腹泻的病原细菌多，如条件致病菌弗氏柠檬酸杆菌，克雷白氏杆菌，大肠埃希菌，费格森埃希菌等。值得注意的是，4-2，21-3与E. coli O157同源性分别达99.6%，99.9%，说明在雅安导致小儿腹泻的病原细菌中，有E. coli O157存在，由于E.coli O157会导致人严重的腹泻甚至还有死亡病例，因此必须重视该地区儿童细菌性腹泻情况。同时应及时追踪检测，以防止大面积爆发儿童腹泻病例。,5%乳糖发酵中，样品4所分离到的4个菌株均只产酸不产气，而其余33个菌株均既产酸又产气。按传统检验法该4个菌株应该判为非大肠埃希氏菌，在后续实验，其甲基红实验为阳性，枸橼酸盐利用实验为阴性，符合大肠埃希氏菌生化特征。其表型可能和遗传型之间存在差异。16S rDNA-RFLP和16S rDNA序列表明：该菌株在16Sr DNA-RFLP中最大的那个遗传群，序列与E.coli O157:H7的相似性竟达99.6%，至于为何其在5%乳糖发酵管中只产酸不产气，其原因还不清楚。,4-2 产酸不产气的可能的代谢原因,节首,结论,引起某区儿童细菌性腹泻菌的检测分析表明,检出菌的表型多样性明显,遗传多样性丰富。不同属的条件致病菌间以相互作用或单独作用为主引起该地区儿童腹泻。故应加强该地区细菌性腹泻菌流行动态。,1.,检测出了克雷白氏杆菌,条件致病菌弗氏柠檬酸杆菌,故对该地区的儿童细菌性腹泻应加紧防控,综合治疗。防治大肠埃希氏菌时兼顾这些条件致病菌,药物选择能普遍治疗这些致病菌的。,3.,在不同样品中检测出了强致病性的E.coli O157,大肠埃希氏菌占有率在检出菌中的占有率为51.4%。表明本地区以儿童细菌性腹泻菌以大肠埃希