分子诊断与临床ppt课件

,分 子 诊 断 与 临 床,主要内容,概述 分子诊断的常用技术 分子诊断在临床的应用 分子诊断在应用中的问题及对策 分子诊断的发展方向,检验医学,临床基础检验学 临床生化检验学 临床免疫检验学 临床微生物检验学 临床血液检验学 临床寄生虫学 临床分子诊断学(基因诊断=PCR?) 科研平台？,分子诊断学,以分子生物学理论为基础 利用分子生物学的技术和方法 研究人体内源性或外源性的生物大分子（如DNA、RNA和蛋白）和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化 为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据 检验医学的分支学科之一,分子诊断学的研究对象,生物大分子 核酸：DNA、RNA 蛋白 大分子体系 基因 细胞 组织,临床学诊断,不同诊断方法的研究对象,高通量技术 核酸测序技术基因诊断的金标准 生物芯片(基因芯片)技术 蛋白质组学技术 2-DE 质谱技术：MALDI-TOF 组织芯片 蛋白质组信息学,RLFP原理,FISH NTERT-1与人着丝粒DNA片段杂交（绿），与人端粒DNA片段杂交（红）,二、几种常用的分子诊断技术,核酸扩增 分子克隆 核酸分子杂交 DNA测序 单核苷酸多态性分析技术 生物芯片技术 蛋白质组学技术 生物信息学,1、PCR,体外核酸扩增 生物技术领域最重要四项技术之一 细胞整合技术 分子克隆技术 蛋白工程技术,模板DNA,94变性,55退火,72引物延伸,第二次循环,模板变性退火,延伸,经25-30次循环，目的DNA增加106-7,PCR原理示意图,2、分子克隆,（基因克隆，基因重组） 基本步骤 分 切 接 转 筛,含重组子的阳性克隆,DNA重组体,分,切,筛,转,定义 不同来源的、具有互补序列的两条核酸单链 在一定条件下通过碱基配对原则形成双链的过程 分子杂交技术的理论基础 DNA（RNA）的变性与复性,核酸分子杂交,基本类型 Southern杂交-待测核酸是DNA片段 Northern杂交-待测核酸是RNA片段 衍生类型：斑点杂交、原位杂交 等,Southern blot 操作 流程,斑点杂交示意图,4、DNA测序,已知序列的验证性测序策略 未知序列的从头测序策略 随机测序法 （鸟枪法、人工转座子法 ） 定向测序法 （引物测序法、互套缺失法 ） 全基因组测序策略,DNA测序常用技术,链末端终止法（ Sanger法） 化学降解法 测序新技术 MALDI-TOF MS 杂交测序法 焦磷酸测序技术 原子探针显微镜法 单分子测序技术 自动化测序-常规应用,链末端终止法测序原理,化学降解法测序原理,自动化测序,充分体现DNA序列自动化分析技术的简单、安全、精确、并行和高效等特点 目前，自动化测序已成为DNA序列分析的主流，几乎完全取代了手工测序 类型： 基于单一荧光染料标记的自动化测序系统 基于多种荧光染料标记的自动化测序系统,单荧光,多荧光（四荧光）,377型DNA 全自动测序仪,5、单核苷酸多态性分析技术,SNP：第三代遗传标志，是决定人类疾病易感性和药物反应差异性的主要因素 SNP检测技术基本步骤 靶序列的扩增 SNP特异位点的区分 方法：杂交、PCR、分子构象、酶法等 数据的检测分析 方法：凝胶电泳、荧光检测、基因芯片、 质谱分析 等,主要的SNP检测方法,凝胶电泳分析技术 SSCP、TTGE、TGGE、DGGE 分子杂交技术 ASO、DASH、PNA杂交、LNA 杂交 荧光共振能量转移 Taqman探针技术、分子信标技术、 蝎状探针技术、替代探针技术,PCR-SSCP,6、生物芯片技术,技术的核心：杂交技术 实质：分子生物间特异性相互作用（互补配对） 步骤： 已知物质点样（阵列） 加标记的待测样品，杂交 检测 数据分析、处理 优点：高度并行性、多样化、自动化、微型化 缺点：只能检测已知的大分子 不能发现未知的大分子,应用 核酸分析（基因表达分析、基因突变检测、基因测序、基因图谱制作、多态性分析）、 药物研究、蛋白质组鉴定及微生物菌种鉴定 主要类型 基因（DNA）芯片 RNA芯片 蛋白质芯片 细胞芯片 组织芯片 芯片实验室 (Lab-on-a-chip ),6400点的基因芯片 （面积 1214 mm),7、蛋白质组学,蛋白质组：一个细胞或一个组织或一个机体的基因所表达的全部蛋白质。 蛋白质组学：从整体的角度，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，提示蛋白质功能与细胞生命活动规律的相互关系。 研究对象的整体性 研究目标的动态性 体现生命的复杂性,蛋白质组学,研究范畴： 蛋白质与蛋白质间的相互作用 蛋白质与核酸间相互作用 蛋白质及其组成质点的分离、分析与鉴定 蛋白质结构分析 生理与病理状态或不同发育阶段的蛋白质表达差异 丰富与完善蛋白质信息库,蛋白质组学的常用分析技术,从技术层面来讲的，它是一门综合的分析技术，主要有3个方向为蛋白质组学研究提供技术平台。 蛋白质组分离技术：双向电泳（2-DE） 蛋白质组鉴定技术 ：图像分析技术、微量测序、 蛋白质质谱、 氨基酸分析 蛋白质组数据库的建立和生物信息学,2-DE,酵母双杂交技术的原理,8、生物信息学,概念：以数学、信息学、计算机学为主要手段，以计算机硬件、软件和网络为主要工具，对巨量的数量进行处理、存储、分配和解释，成为具有明确生物学意义的生物信息，并通过对生物信息的查询、搜索、比较和分析实现其研究目标（基因组信息结构的复杂性及遗传语言的根本规律律） ，解释生命的遗传语言，探索生命起源、生物进化的基本规律，探索细胞、器官和个体发生、发育、衰亡等生命科学中的重大问题。 研究对象：生物学数据 研究核心：基因组信息学,生物信息学,广义：使用数学和信息学的观点、理论和方法去研究生命现象，组织和分析呈指数级增长的生物数据和资料的一门学科。 狭义：主要指基因组信息学，即以计算机和互联网为主要手段，采用计算机学和数学处理DNA及其编码的大分子物质的信息，寻找其规律性。 流程： 建立数据库，将获得的物质信息进行比较,现有的数据库,基因组数据库 人类基因组数据库：NCBI genome、GDB、Ensembl、Genatlas 模式生物基因组数据库：SGD、MGI 核酸序列数据库：GeneBank、EMBL-DNA、DDBJ、Unigene、HGMD 蛋白质数据库：PIR、SWISS-PORT 结构数据库：PDB、SCOP、CATH、COG 功能数据库：KEGG、DIP、TRRD、ASDB,中国生物信息数据库,中国国家生物医学数据库 中国核酸序列数据库 中国核酸序列数据库 中国人核酸序列统计数据库,三、分子诊断在临床的应用,单基因疾病的分子诊断 多基因疾病的分子诊断 肿瘤的分子诊断与预测 感染性疾病的分子诊断 在耐药性研究中的价值 在个体化治疗中的应用 分子诊断在临床的其他应用,1、单基因疾病的分子诊断,血红蛋白病的分子诊断 肌营养不良症的分子诊断 血友病的分子诊断 1抗胰蛋白酶缺乏症的分子诊断 Lebers遗传性视神经病变的分子诊断 其他单基因疾病的分子诊断,镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,谷氨酸(GAN) 缬氨酸(GUN) HbA HbS,镰状红细胞贫血基因组的PCR-RFLP电泳图,DMD基因缺失的多重PCR诊断。共采用9对引物，可见患者（P）有电泳带的缺失。,2、多基因疾病的分子诊断,糖尿病的分子诊断 家族性高脂血症的分子诊断 高血压的分子诊断 支气管哮喘的分子诊断 皮肤的复杂疾病,其他：冠心病、动脉粥样硬化、胃及十二指肠溃疡、精神分裂症、风湿病、癫痫、甲亢、唇裂、腭裂等。,遗传病的基因诊断方法选择原则,3、肿瘤的分子诊断与预测,肿瘤的分子分类与分期 肿瘤的分子标志 肿瘤的分子诊断 肿瘤的分子预测,肿瘤的分子标志,肿瘤基因的分子诊断,肿瘤的早期诊断和筛选 肿瘤的疗效监测 肿瘤的预后判断 肿瘤微转移检测,主要方向,4、感染性疾病的分子诊断,诊断途径： 感染性病原体的分子诊断 感染性病原体的分型检测 感染性病原体的耐药监测 人感染性疾病的易感基因检测 感染组学-对感染性疾病的总体性和综合性研究,感染性疾病的分子诊断,分子诊断方法 核酸杂交技术 核酸扩增技术 基因定量诊断技术 基因芯片技术 蛋白质组学技术,感染性疾病的分子诊断,目前主要的应用 病毒的分子检测 细菌感染的分子检测 衣原体的分子检测 支原体的分子检测 螺旋体的分子检测 原虫的分子检测,5、分子诊断在耐药性研究中的应用,微生物耐药性的研究 耐药基因的检测与分析 PCR、PCR-SSCP、PCR-RFLP、核酸杂交、 FQ-PCR、基因芯片等 耐药菌株的鉴定与分析 质粒谱DNA指纹分析、DNA的特异性位点分析、全基因DNA指纹、基因芯片,分子诊断在耐药性研究中的应用,肿瘤的多药耐药基因的检测与分析 主要的MDR基因 mdr1-p-蛋白 MRP-多药耐药相关蛋白 LRP-肺耐药相关蛋白 Topo -DNA拓扑异构酶同工酶 GSTp1-谷胱甘胱S-转移酶P1-1同工酶,6、在个体化医疗中的应用,个体化医疗 个体化医疗的前提 药物基因组学与个体化用药 肿瘤的个体化治疗,7、分子诊断的其他应用,在移植配型中的应用 在法医学中的应用 在产前诊断中的应用 在新生儿筛查中的应用 在预防医学检验中的应用,RFLP在法医学中的应用,四、分子诊断在应用中的问题及对策,在感染性疾病检测中的问题与对策 易感基因诊断中的问题与对策 肿瘤的分子诊断和预测的问题与对策 分子诊断中的伦理问题 分子诊断中的质量问题与标准化,1. 在感染性疾病检测中的问题与对策,问题： 病原微生物日益复杂 新病原体的出现 耐药株的出现 对策： 开发快速、准确、特异、灵敏的新方法 新方法与传统方法、实验室检查与临床表现结合 多种方法联合应用 开发新方法，加强耐药性检测 利用人易感基因检测进行诊断（如SNP）,2、易感基因诊断中的问题与对策,问题： 遗传异质性 多因素复杂性 假阳性 存在拟表型 各种因素导致的误导,易感基因诊断中的问题与对策,对策 提高关联性检测的可能性 选择单体型作为标志 利用LD、tagSNP和单体型进行关联研究 采用大样本研究提高关联研究的效应 同时检测多个遗传标志 根据环境因素和多基因因素进行分析,利用易感基因进行健康预测的问题,单基因疾病：检测相关基因或染色体畸变做健康预测，或产前诊断-可信的 易 感 基 因 ：只能作有限的参考 原因： 易感基因的研究和检测技术正处发展过程中 并非所有疾病都可以预测 现阶段发现的部分疾病的易感基因还难以直接应用于临床治疗和预防,3、肿瘤分子诊断的问题与对策,癌基因的激活、抑癌基因的失活（或缺失） 原癌基因 细胞癌基因 病毒癌基因 生长因子及受体、蛋白激酶、转录因子等 肿瘤抑制基因 肿瘤转移相关基因 肿瘤耐药基因 等,癌基因或抑癌基因在正常细胞的基因组中 存在 表达/不表达状态 表达程度 肿瘤标志的特异性 易感基因的关联性,肿瘤分子诊断的问题与对策,4、分子诊断中的伦理问题,医学论理学的一般原则： 有利、无害、公正、尊重 遗传服务：一种面向社会的应用遗传技术的医学实践 需遵守医学伦理学 实施依赖于分子诊断技术 内 容：遗传咨询、遗传检查、遗传筛查、 基因治疗、辅助生殖等 主要途径：基因检查、染色体