实验八 rtpcrrt实验

实验八 RT-PCR （1）RT实验,RT-PCR:逆转录聚合酶联反应 RT: Reverse transcriptase transcription 一、实验目的 了解RT-PCR的技术原理； 通过本实验学习用试剂盒进行RT-PCR的方法。,二、RT-PCR的基本原理 RNA是一类极易降解的分子。首先RNA在逆转录酶作用下反转录为cDNA第一链：脱氧核苷酸引物与mRNA杂交，在RNA依赖的DNA聚合酶指导下合成互补的cDNA序列； 然后在DNA聚合酶的作用下扩增目的基因：PCR第一个循环由正义引物(oligo-dT)和cDNA第一链退火结合，在DNA依赖的DNA聚合酶指导下合成第二链，从PCR第二循环起开始扩增目的片段。,TakaRa RT-PCR 试剂盒(AMV装)概述 本试剂盒适用于各种RNA制品（包括RNA病毒）的反转录反应以及随后的PCR扩增。它采用AMV （禽源的）进行反转录反应，能够获得较长的反转录产物，约1-2kb。 同时，在10l反转录体系，50l PCR反应体系中，还可以一次性得到足够量的PCR产物用于后续克隆实验。,三、实验仪器、材料与试剂 仪器 1. 200以上烘箱 2. 低温离心机 3. 恒温水浴锅 4. 微量移液器 材料 试剂盒组成及包装,100次 反转录酶（AMV：5U/l ） 50l RNAse Inhibitor（40U/l ） 25l Random 9mers (50pmol/l ) 50l Oligo dT primer(2.5pmol/l) 50l RNase Free ddH2O 1ml TaKaRa Ex Taq HS(5U/l) 40l M13 Primer M4 (20mol/l) 50l 10RT Buffer 1ml 5PCR Buffer 1ml dNTP Mixure(各10mM) 150l MgCl2 （ 25mM ） 1ml,四、操作步骤,RT 反转录反应： 1在冰浴的试管中加入如下反应混合物： （1）模板RNA：总RNA 0.1-5g（3-4 l ） （2）引物：Oligo(dT)18（0.5g/l）1l （3）无RNA酶的去离子水（RNase-free ddH2O）：定容至11l,五、注意事项 吸取试剂盒中的dNTPs时，请用DEPC 处理过的Tips。 -20C冻存，有效期12个月。 RT-PCR成败的关键首先在于RNA模板的制备,逆转录酶和逆转录反应：在一般的逆转录反应中，较常用的是MMLV（鼠源的）和AMV（禽源的）两种，现在更有各家公司推出的耐热的（50-60度）、超长片段的逆转录酶，这方面具有专长的数gibco（现在并购于Invitrogen） AMV有其自身的优点，酶的活性很高，扩增1kb以下的基因时比较常用，临床上血液检测中有时使用AMV，省时，也省试剂。,六、实验结果与讨论,实验结果与讨论 讨论,附I：常用的RNA酶抑制剂 焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。,氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。,附II： TRIZOL试剂 TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。 它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。 加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。 收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。,在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。 乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。 TRIZOL是有毒物，接触皮肤或者不慎吞服，会导致灼伤，一旦接触皮肤后立即以大量的洗涤剂和清水清洗。 TRIZOL在室温下能稳定保存12个月。尽管如此，为达到最佳效果，建议保存在2-8C的环境下。,附III：RT反转录效果鉴定方法,采用1%琼脂糖凝胶电泳，取1l 反转录产物跑电泳，正常情况下cDNA应该呈从200bp56Kb连续Smera分布，非正常情况下，电泳结果呈溴酚兰前一大团降解产物。 如果有条件，可以采用Beta-Actin 引物进行扩增，正常情况下可以扩增出一条约300-560bp大小的Beta-Actin基因。,附IV：PCR反应 在0.5 mlEppendorf管内，依次加入1l反转录产物，1l dNTPs，0.4lTaq酶，5 l 10PCR 反应缓冲液，混匀后，加入适量引物，再用ddH2O补足至50l，即可上机反应； 以下参数可供参考：94C，预变性5分钟；94C，变性50秒；用两个引物中Tm值较小者减去5作为退火