血袋细菌内毒素定量检测方法的建立ppt课件

血袋保养液细菌内毒素定量检测方法的建立,钟炽辉,细菌内毒素的基本知识,1. 细菌内毒素 细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖和微量蛋白的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。其化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌及其它微生物的细胞壁层的脂多糖，主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。内毒素能引起热原反应。,2. 细菌内毒素标准品 细菌内毒素国家标准品（RSE）：批号：981 效价： 9000EU 细菌内毒素工作标准品（CSE）：以细菌内毒素国家 标准品为基准标定 效价,3. 细菌内毒素在水溶液中的状态,细菌内毒素很容易吸附在容器壁上或聚集在一起，2005版中国药典明确注明：细菌内毒素标准溶液要混旋15min并且每稀释一步要混旋30s，以充分混匀。,4. 鲎试剂 从海洋生物鲎的血液提取的生物试剂，只有鲎血与内毒素有特异性的凝胶反应，该试剂达到了国际标准化，全世界均采用该试剂检测细菌内毒素，尚不能采用生物合成的办法制造。,实验证实，临界时间t0.02 与内毒素浓度C之间也是负相关。通过对标准品进行实验，可得C-t0.02 关系曲线，对该曲线采用最小二乘法拟合，可以求解出a0、b0的值。在对实验品进行检测时，根据实验品的临界反应时间t0.02和标准曲线方程即可求出实验品的内毒素浓度。,6.2 反应速率测定法 大量实验表明，内毒素浓度越高成胶时间就越快，即反应速度越快，将动力学反应曲线变换成微积分曲线，即反应速率曲线，其反应速率最大的点即是反应曲线的拐点，该点的时间作为反应时间就是浊度反应时间法中的t50，最大的反应速率也与内毒素含量相关，通过对标准品进行实验，可得C-Vmax关系曲线，对该曲线采用最小二乘法拟合，可以解出a0、b0的值。在对试验品进行检测时，把试验品的最大反应速率Vmax代入标准曲线方程，即可求出其内毒素浓度值。,7. 血袋保养液细菌内毒素定量检测,7.1 材料：鲎试剂，内毒素工作标准品，检查用水， 血液保存液调节液。 7.2 设备：BET-32M细菌内毒素分析仪，ZH-2 BLENDER 混合器。 7.3 标准曲线的设置 7.3.1 在软件里点击“使用以前标准曲线”，可在软件右方框选择 曾保存过的标准曲线； 7.3.2 在软件里点击“做新标准曲线”，可重新制作标准曲线，具 体步骤如下： （1）填好鲎试剂、内毒素、检查用水的批号；,（2）分别设定好“初始浓度”（为标准曲线的最高浓度点）、 “稀释梯度”（为各标准点之间的稀释倍数）、“浓度点 数”（为所做标准曲线点的个数）、“平行管数”（为各 点重复的管数） 如下图所示：,（3）点击“自动设置标准曲线” ，在表格中出现所设置的数 据，再点击“阴阳性对照”，选中“阴性对照”，填写平行 管数，点击“试管位置选择”， 点击“自动选择”，如下图 所示：,（4）点击“开始检测”，程序设置完毕。新建立的标准曲线保 存在 “检品管理中心”的标准曲线内，新标准曲线以默 认【鲎试剂批号】+【内毒素批号】+【当前时间】作 为文件名存盘，也可在画面底列“保存文件名”处自行输 入，如下图所示：,（5）溶解分装鲎试剂 根据用量溶解鲎试剂，将溶解的鲎试 剂混合在一起，分装到无热原的仪器专用检测管内， 每支检测管内0.1ml 。 （6）加样 取稀释好的内毒素系列浓度溶液，根据所设定管 数分别加入有鲎试剂的小试管中，每管0.1ml，另取细 菌内毒素检查用水做阴性对照。 （7）检测 每个浓度点在加完样后应立即用封口膜封口，放 入细菌内毒素测定仪设定位置，仪器自动开始检测。 待标准曲线最后一个浓度的OD值超过预设值后，用鼠 标点击“手动停止检测”，停止数据采集。 （8）点击标准曲线坐标画面，生成并储存标准曲线，计算 出相关系数。 （9）报告打印 点击“报告打印预览”，在报告打印预览画面 点击“打印”即可，如下图所示：,7.4 供试品的检测过程 7.4.1 供试品溶液制备 根据干扰预试验结果，用血液保存液 调节液将供试品稀释到无干扰浓度，同时制备该浓度 的供试品阳性溶液和阳性标准品溶液，样品阳性溶液 外加内毒素标准品浓度和阳性标准品浓度相同，标准 品浓度为所选用标准曲线的中间浓度。 7.4.2 检测软件设置 （1）点击“新试验”，出现试验向导画面，首先填写鲎试剂批 号、内毒素批号、检查用水批号，点击“供试品设置”， 选择供试品名称，所做供试品管的稀释倍数；填写供试 品批号、稀释倍数平行管数。选中“回收率管” ，填写外 加内毒素浓度、供试品稀释组数、“供试品稀释组数”填 写“1”。点击自动设置，在表格中出现所设置数据。,（2）点击“阴阳性对照”画面，选中“阴性对照”，填写平行管 数，选中“阳性对照”，填写平行管数。鼠标点击“试管 位置选择”， 点击“自动选择”后点击“开始检测”，程序 设置完毕。文件存在最后设置的“供试品名称”目录下， 以【供试品批号+当前时间】为该试验的文件名。,7.4.3 试验检测 （1） 溶解分装鲎试剂 根据用量溶解鲎试剂，将溶解的鲎试 剂混合在一起，分装到无热原的仪器专用检测管内，每 只检测管内0.1ml 。 （2）加样 取稀释好的供试品溶液、供试品阳性溶液、阳性 标准品溶液，根据所设定平行管数分别加入有鲎试剂的 小试管中0.1ml或0.2ml（没有气泡），注意加样前应混 合溶液30秒，且每个浓度加样前应更换加样头。另取细 菌内毒素检查用水做阴性对照。 （3）检测 每个供试品在加完样后应立即用封口膜封口，放 入细菌内毒素测定仪设定位置，仪器自动开始检测。试 验完成后，点击“手动停止检测”，停止数据采集。在 “标 准曲线”处选择标准曲线后，计算机自动计算出结果。,（4） 观察分析反应曲线 在试验的过程中和试验结束后数 据分析时可以观察每一个试管的反应曲线，下图中的 反应曲线为内毒素标准品的正常反应曲线，如果供试 品中存在的干扰成分未被排除，它的反应曲线必定有 所变化。另外，根据使用的不同鲎试剂，要适当调整 显示幅度、零化期时间、预设OD值，以适应该种鲎试 剂的反应特性。,（4）试验报告打印 用鼠标点击“报告打印预览”，在报告打 印预览画面点击“打印”即可。 8. 结果分析 8.1 标准曲线：lrl=0.99920.98，符合要求；