病理切片技术培训2011年8月22日课件

病理学在疫病诊断中的 应用和石蜡切片制作技术,2011.08.22,第一部分,病理学在疫病诊断中的应用,一、动物疫病的复杂形势,（一）动物疫病种类多 （二）新发动物疫病不断出现 （三）病原型别多、变异快 （四）2010年列入国家监测计划的动物疫病 （16种）,（一）动物疫病种类多,农业部一、二、三类动物疫病病种目录中列入157种：其中一类动物疫病17种，二类动物疫病77种；三类63种 。 OIE陆生动物卫生法典2010版中列入94种：其中多种动物共患病26种，牛病14种，绵羊和山羊病11种，马病11种，猪病8种，禽病14种，兔病2种，蜂病6种，其他疫病2种。,（二）新发动物疫病,非洲猪瘟（俄罗斯等国，我国最近发生的小猪流行性腹泻又是怎么回事？） 小反刍兽疫（西藏） 口蹄疫（新发亚型的出现）,（四）2010年列入国家监测计划的动物疫病,高致病性禽流感、新城疫、口蹄疫、高致病性猪蓝耳病、猪瘟、布鲁氏病、牛结核病、血吸虫病、狂犬病 外来动物疫病：牛海绵状脑病（疯牛病）、牛传染性胸膜肺炎、牛瘟、小反刍兽疫、痒病、非洲猪瘟、蓝舌病。 注：结核病、狂犬病、牛海绵状脑病均可通过病理学的方法确诊，而且目前牛海绵状脑病只能通过病理学的方法确诊,二、目前实验室常用的检测技术,血清学检测技术 分子生物学检测技术 病原学检测技术 病理学检测技术,三、病理学及检测技术,1、病理学在医学及兽医学中的地位 病理学是基础医学与临床医学之间的桥梁 动物学. 解剖学 预防兽医学(寄.传) 组织胚胎学.生理学 临床兽医学(内.外.产) 生物化学微生物学 公共卫生学 病理知识和病理诊断是临床疫病诊断治疗的依据。,病理学,在临床医疗中，病理诊断是诊断疾病的最可靠的方法，有“金标准”之称（确诊）。 病理医生在国外被称为“医生中的医生”。 一个医院的水平取决于诊断水平，而诊断水平取决于病理诊断水平（动物医学病理要向人医病理学习）。,2、病理检测技术,（1）常规病理学检测技术 利用疫病引起的动物组织发生特征性的病变和病理变化对动物疫病进行诊断。 狂犬病、结核、牛海绵状脑病、肿瘤（马立克、白血病、禽网状内皮增生症以及其他的常见肿瘤。）发现新疫病。,肿瘤,鸡淋巴白血病,网状内皮增生,淋巴结核,脂肪肝,（2）免疫病理学检测技术 -免疫组织化学技术,基本原理 免疫组化染色是引入附有标记物的外源性抗体（或抗原），使之锚定于组织或细胞标本中相应的抗原（或抗体）部位，标记物经呈色反应而显示待检抗原（或抗体）。,亲和素（卵白素）是从卵清分离的一种糖蛋白。1个分子内有4个与生物素结合的位点。,屠宰猪肝脏HEV免疫组化染色，被膜下散在肝细胞核和少量细胞浆呈阳性反应细胞（免疫组化染色，40）； The expression of HEVAg in nuclear of some liver cell of slaughtered swine (Immunohistochemical staining. 40)；,屠宰猪肝脏中散在HEV免疫组化强阳性反应细胞（免疫组化染色，40）； The expression of HEVAg in liver cell of slaughtered swine.（Immunohistochemical staining.40）,（3）原位杂交,荧光原位杂交,（4）超微病理学（电镜细胞化学）,电镜细胞化学是在光镜组织化学基础上发展起来的一门生物技术.(作为一门学科)它是在超微 水平上观察细胞内化学物质,并在此基础上 进一步阐明其生理和病理状态下的生化代 谢改变。,在光学显微镜下所见的结构,称为显微结构.。现一般光学显微镜最大分辨率约为0.2m,最大放大倍数为14001500倍。细胞内的结构如线粒体、中心体、核仁、高尔基体、染色体等都大于0.2m。因此能在光学显微镜下观察到。,在电子显微镜下所显示的结构一般称为超微结构(US)。目前常用于超微结构研究的工具有电子显微镜、X光衍射仪等。电子显微镜分辨率一般可达0.12nm。最高的分辨率已经接近了对单个原子(一个埃A左右)的分辨.(放大倍数高达80100万倍).,狂犬病毒,第二部分,石蜡切片制作技术,一、目的意义 活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出， 组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。,光学显微镜的制片技术方法可分为两大类： 非切片法 切片法,非切片法：是用物理或化学的方法，使细胞彼此分离，如有分离法、涂布法、压碎法等。非切片法的操作比较简单，能保侍细胞的完整，但是细胞之间的正常位置往往被更动，无法反映细胞之间的正常联系。它可以与切片法配合使用，各取其长处。,切片法：是利用锐利的刃具将组织切成极薄的片层，材料须经过一系列特殊的处理，如固定、脱水、包埋、切片、染色等，过程十分繁复。在制作过程中，还要经过一系列的物理和化学的处理，这些处理方法可根据各种不同材料的性质要求进行合理选择。切片法虽然工序繁琐，技术复杂，但是，它最能保持细胞间的正常的相互关系，能较好和较长时间地保留细胞的原貌，所以仍然是光学显微镜的主要制片方法。,光学显微镜切片制作技术最简单的切片法是徒手切片，但是由于组织块往往十分柔软，切削很困难，而且无法得到十分菲薄的切片，因此必须先用某些特殊物质渗入组织块的内部起支持作用，并将整个组织块包住，然后再用精密的切片机制作切片，才能获得良好的效果。这种方法称为包埋法，包埋的物质称为包埋剂。常用的包埋剂有石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶等，水和塑料也可作为包埋剂。根据包埋剂的不同，分别有石蜡切片、火棉胶切片、冰冻切片等，它们各有长处，可以根据需要选用，但是使用得最多的还是石蜡切片技术。,取 材,固 定,脱 水,透 明,包 埋,切 片,染 色,封 片,二、石蜡切片制作步骤, 取材,材料的好坏直接影响到切片的质量。,注意事项,当怀疑病畜死于传染病、侵袭病或中毒病的时候，应由县(市、区)动物疫病预防控制中心进行诊断，做不出结果时，迅速采取病理材料送交省、地、市动物疫病预防控制中心检验室、农业大学动物病理诊断实验室或其他检验机构进行检查。 病理组织学检验材料需及时采取,及时固定,以免自溶出现死后变化,影响诊断。,用作病理组织学检验的组织病料应选取病变最典型、最明显的部位，并应包括病灶和其邻近的正常组织两部分。这样便于对照观察,更主要的是看病灶周围的炎症反应变化。 采取的病理组织材料,要包括各器官的主要结构, 如肾应包括皮质、髓质、肾乳头及被膜。,选取病料时,切勿挤压（可使组织变形）、刮抹（使组织缺损）、冲洗(水洗易使红细胞和其他细胞成分吸水而胀大, 甚至破裂)。 选取的组织不宜太大,长宽厚一般为1.51.50.5(厘米)。尸检取标本时可先切取稍大的组织块,待固定一段时间(数小时至过夜)后,再修整成适当大小,并换固定液继续固定。常用的固定液是10%福尔马林,固定液量为组织体积的510倍。容器可以用大小适宜的广口瓶。细小组织（小于5mm、纤维镜活检标本）及脆而易碎的小组织，请先附贴于滤纸上再放入固定液中，以免遗漏。,记录与存放。取材完毕后应在固定容器表面贴好标签，表明标本名称和编号，有的瓶口可用蜡严密封闭。同时，应对被检组织进行核对，整理好的尸检记录及有关材料,并在送捡单中说明送检的目的和要求。标本来源：系指手术切除的部位或器官。如“结肠癌”、“子宫肌瘤”等等。应填写“结肠”、“子宫”，不要填写“术中”；送检标本容器上应贴有病畜的种类和标本部位，同一患畜同时取有数种组织，或同一组织由不同部位取出，应分盛容器，分别注明，并在病理送检单上注明送检标本的份数及部位；标本瓶口宜大，便于标本的取出。病理检查申请单是医疗举证的重要文书，是病理诊断中心永久保存的医 学资料，请务必保持清洁、完整无损，请勿涂改。严禁用病理检查申请包裹标本容器送检。,病理报告：病理诊断报告在收到病理标本后五个工作日发出，须加做特殊染色和/或免疫组化染色者除外。, 固定,固定是将需保留或制作成标本的脏器或病变组织浸入固定液内，使组织的形态结构尽可能保持在生前的状态，组织细胞的物质成分变为不溶性，而得到保存，且能适于某些研究程序。,1、固定的意义与作用 在一般情况下,凡是需要制作成大体标本和显微镜切片标本的各种病理组织,都要先行固定。固定是切片制作的关键。固定不良在以后任何阶段皆不能补救。 因此,可以说没有良好的固定基础,就不可能制作出质量可靠的组织学切片,反映不出被研究的组织细胞的生化特点,以致影响诊断结果。,杀死细胞, 改变组织细胞膜的通透性, 使染料 或作用物能进入细胞内。 抑制自溶和腐败。 固定使细胞内蛋白质、脂肪、糖等各种成分沉 淀凝固,从而保持其原有的结构和性质。 固定也可使细胞从正常溶胶状态凝胶状态，从而增加组织的硬度，有利于制片。,2、固定时应注意的事项 取材新鲜,固定及时。 处死方法:一般是采用 兔耳静脉注入空气, 造成急性心血管的空气栓塞, 循环障碍； 鼠是剪断颈部放血； 鸭采取拉颈椎使之脱位损伤延髓； 鸡常采用切断颈静脉放血或扭拉延髓致死。 采取的组织应立即放入固定液中使其固定，以免发生自溶、失水。,切取的组织块不宜过大,大小厚薄应较一致。 大小一般为1 1. 5cm; 厚小于5mm; 切取组织用的刀剪要锋利,切忌来回拉锯式切割,以免造成挤压、碎裂。用镊子夹时不要用力过大,鼠齿镊子损伤的部位不能用。 所取组织不应用刀刮、涂擦;更不应用水冲洗、浸泡。,所取组织应包括病变部位和邻近的健康的部位,这样有利于对照鉴别。 另外,所取组织应包括器官的基本或重要结构。如肾脏应包括皮质、髓质、包膜和肾盂、肾乳头;胃肠道应包括粘膜至浆膜各层结构。,固定液要充分，一般为组织块体积的10倍。 固定所用的容器应宽大,以使组织块在固定过程中不被挤压变形并得到充分固定。瓶口不能过小,以免固定的组织变硬取不出来。同时注意组织块与容器不要贴壁。 对于柔软或薄的组织,为了防止固定后的扭 曲.变形，可在切取时将其平摊在吸水纸上，再固定。肺组织常漂浮，不宜固定，最好用注射器抽吸肺内气体，以利固定液侵入。,所取的组织块较多时,为避免混淆,应加标记。容器上应贴标签，注明固定液、采集日期、编号等。 一般固定剂都以新配制的为好，用过的不能再用。有些混合固定剂由甲、乙两液合并者，一定要在使用前才混合；固定完毕，根据所用固定剂的不同，用水或乙醇冲掉残留的固定剂，以免固定剂形成沉淀，影响以后组织块的染色。 固定液的选择要适当,3、固定的方法： 最常用的是浸泡固定， 特殊情况下采用灌注固定 和蒸气固定。,4、固定液的选择与应用 用于固定组织标本的试剂很多。由各种固定剂配制的固定液已多达上百种。 不同固定液有不同的作用。因而,在应用固定液时应根据组织标本的性质、观察或研究的不同目的恰当地选择所需的固定液。,在选择与应用固定液时应注意下述问题： 固定液的性质与作用 各种固定剂，其化学性质及固定作用不同。有的为氧化剂,有的为还原剂；有的能够凝固或沉淀蛋白,固定脂肪或糖元；有的则能溶解或破坏脂肪及糖元；有的能引起组织收缩，有的则引起组织膨胀；对组织的渗透压力及硬化程度的大小等也不相同；有的不仅能够保存组织标本的形态结构及某些物质成分,而且还有媒染作用，有的则无明显的媒染作用,甚至妨碍某些染料的着色。 所以，在固定时，必须注意固定液的化学性质与固定作用，选择最有利于保存或保护所要研究的化学物质的固定剂。如要显示多糖类及核酸DNA或RNA物质，须用Carnoy氏液。,酶类 较好的固定剂为丙酮及中性福尔马林。丙酮为蛋白质沉淀剂,在很大程度上使酶的反应处于原状，不干扰蛋白质的功能。但是因为固定作用快速, 组织皱缩，细胞结构保存不佳,可能使物质重新分布。 用80浓度的丙酮无此副作用.,常用的固定剂：10%中性福尔马林固定液（1份饱和甲醛液+9份PH 7.4,0.01M 的PBS）、Bouin液（70份苦味酸饱和水溶液+25份4甲醛+5份冰醋酸）、Zenker液（升汞5g重铬酸钾2.5g硫酸钠1.0g5ml冰醋酸100ml蒸镏水）、Carnoy改良液（3份无水乙醇+1份冰醋酸）等。,固定液的用量 固定液用量需充足,一般用量应为所固定总体积的十倍以上。某些较贵重的固定液亦不应少于四倍,必须将全部标本淹没。需显示细胞器等微细结构的组织标本，固定时应多次更换固定液或用其他固定液进行二次固定。,固定液的浓度与渗透压。固定液浓度应适宜，要根据不同标本选用不同的浓度。如酒精虽然是保持糖元的较好固定剂，但用无水乙醇固定肝等实质组织时，则其组织表面很快凝固变硬，减弱对组织的渗透能力，造成组织中间空 固定不佳，远远达不到固定目的。结果不但可引起组织严重收缩、变硬、变脆，妨碍切片和观察，而且由于固定不透、不均、糖元也不能得到较好的保存，并易出现糖元颗粒趋于细胞边缘的极化现象。 而80的酒精在低温下固定组织糖元,则可收到优良的效果。胸水、腹水等液体标本则以无水酒精固定为佳,固定的时间与温度,组织固定的时间不宜过长或过短，过短达不到固定的目的;过长,可能造成化学物质的丢失。固定时间的长短因组织种类、大小、固定液的性质及周围环境的温度不同而异。 如组织致密含脂肪较多，或组织标本较大的，就应适当延长固定时间。固定液渗透力较强的即可缩短固定时间。 加温可加速固定液的作用，缩短固定时间，但极易引起组织严重收缩硬脆等不良改变。故除非紧急情况下，一般不采用加温固定的方法。 在低温环境下进行固定，虽然需要延长固定时间，但能抑制很多酶对组织的自溶，对于糖元、抗原、抗体等很多物质的保存及固定都是有益的。组织化学反应及免疫病理学研究，一般都采用低温固定以及冷冻干燥的方法., 常用固定液 固定剂与固定液 固定剂用于固定组织标本的试剂称为固定剂 固定液由固定剂配制成固定组织标本的溶液 称 为固定液。 如甲醛、酒精、丙酮、升汞、重铬酸钾、冰、醋酸、苦味酸、锇酸等固定剂 由上述固定剂可配制出上百种固定液。, 脱水,生物组织中含有大量的水分，它和石蜡是不能相溶的，致使在包埋时石蜡无法渗入组织内部，因此须使用脱水剂将水分除尽。 脱水剂必须能与水以任何比例相混合,常用的脱水剂有酒精.丙酮 酒精：为了避免剧烈的扩散引起的组织的强烈收缩，脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行，一般组织从70乙醇开始，经过80、95、100至完全脱水；对于一些柔软的组织应从30开始。脱水时间依据组织的类型和大小而定，一般各级乙醇中放置45min到1h，如果中间须停顿，应使材料停留在70乙醇中，因为低浓度乙醇易使组织变软、解体，高浓度乙醇有脆化组织作用，放置时间不能过长，另外，脱水必须在有盖瓶中进行，以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底。需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中，如需长期保存，可加入等量的甘油。,丙酮也是很好的脱水剂，其作用和用法与乙醇相同，不过其脱水力和收缩力都比乙醇强。 甘油常用于藻类、菌类及柔弱材料的脱水。二氧六环为无色的石蜡溶剂，对组织没有收缩及硬化等不良后果，但其蒸气有毒，使用时须小心。正丁醇可与水及乙醇混合，亦为石蜡溶剂，其优点是很少引起组织块的收缩与变脆。叔丁醇的性质、作用和用法同于正丁醇，但因其价格昂贵而很少使用。,注意：,组织块在进入下一阶段梯度酒精前要用吸水纸吸干水，尤其从95%酒精进入100%酒精，切记防止带入水分，所有过程要在瓶口加盖，防止水分进入。, 透明,组织块用非石蜡溶剂脱水后必须经过透明。透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织。,透明剂的种类很多，较常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。二甲苯作用较快，透明力强，但组织块在其中停留过久，容易收缩变脆变硬，同时若脱水不净，就会引起不良后果，在应用时必须特别小心。通常将组织块先经纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯，这样可减少上述的缺点。,透明时间应由组织大小而定，般各级停留时间在10min至1h，在纯二甲苯中应更换2次，总时间则以不超过2h为宜。材料经过透明，会显示出前一步脱水的效果如何，若脱水彻底，组织则显现透明状态，如组织中有白色云雾状，说明脱水不净，须返工处理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明时，应避免其挥发和吸收空气中的水分，并保持其无水状态。, 浸蜡与包埋,包埋用的石蜡，熔点在5060之间，应根据材料本身的硬度、切片的厚薄和当时的气温条件来选用。一般动物材料最常用的石蜡熔点为5256，切片薄的用5860的，切片厚的则用5254的；室温1019时选用5254的石蜡可顺利切片，冬季可用熔点4648的石蜡，夏季可选5658的。 浸蜡温度保持在5660 ，温度太高会烧坏组织块，太低石蜡会凝固。,含有杂质的新蜡或用过的废蜡可清洁后再用，方法是将石蜡放入锅内，加热到开始冒白烟，然后用小火继续加热30min（注意别超过发火点），使其去除水分和挥发性杂质，并在温箱中过滤以去除灰尘等颗粒。,浸（透）蜡须在恒温箱中进行，恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3度，使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理。纯石蜡应处理23次，浸（透）蜡的时间依材料性质而定，一般每次需1530min。浸（透）蜡的关键是控制温度的恒定，切忌忽高忽低，温度过低石蜡凝固无法渗透，温度过高使组织收缩发脆。,包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中。 具体做法：先准备好纸盒或包埋底模，将熔蜡倒入盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部，切面朝下，盖好包埋盒，再轻轻提起平放在冷冻台，使其迅速冷却凝固，30min后取出。包埋用蜡的温度应略高于透蜡温度，保证组织块与周围石蜡完全融为一体。石蜡的迅速冷却也很重要，否则包埋块中将会产生结晶。以后切片时引起碎裂。, 粗修包埋好的蜡块,组织块两边的蜡应修掉，上下可以保留一点以利于连片，至组织最大面暴露出来，组织面向下放在冷台上或冰盒上面。, 切片,切片机是用来作各种组织切片的一种专门设计的精密机械，常用的是旋转式切片机，它的夹物部分是上下移动前后推进的，而夹刀部分则固定不动。主要部件是安装切片刀的刀台、安装包埋块的标本台和控制切片厚度的微动装置。切片时切片刀固定不动，转动转轮，标本台上下运动并按调好的切片厚度向前推进一定的距离，组织块上下运动一次，便在刀片上得到一张合乎厚度要求的切片。,夹物部分,夹刀部分,手轮,控制切片厚度的微动装置,切片的质量与切片刀直接相关。切片前必须磨刀，方法是：将切片刀装上刀柄、刀背夹、滴少许石蜡油在平滑的磨刀石上，将刀贴着磨刀石以背向刀口方向磨，使用完毕后应及时用二甲苯将石蜡油擦净。也可以采用一次性刀片（Leica 819）。,切片方法：将所要切的包埋块固定在标本台上，使包埋块外切面与标本夹截面平行，并让包埋块稍露出一截。将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈15左右的夹角，包埋块上下边与刀口平行。,调节微动装置： 根据要求切片的厚度调节微动装置，调节时应注意指针不可在两个刻度之间，否则容易损伤切片机，将刀台移至近标本台处，让刀口与组织切面稍稍接触。 先粗切至组织面完整暴露，用毛刷把蜡屑刷掉，保持工作台面洁净以防污染。当组织块接近刀面时，速度放缓。同时向组织面吹气，防止静电。,注意事项,切片刀要锋利，避开缺口 切片刀放置的角度大小要合适 切片机各部位的零件螺丝要旋紧 用力要均匀,切片中存在的问题及补救方法,石蜡带弯曲不直 A.石蜡块上下两边不平行 B.石蜡块的上下两边不和刀口平行 C.刀口锋利不一，局部产生差异 D.蜡块的一边较另一边为软，或两边的硬度不一致 E.材料未居蜡块正中央 F.材料大而形不正,补救措施: A取下台木，将两边修干 B调节标本台，使两者平行 C移动刀片，改用新的刀口 D待蜡块冷却后再切，或重新包埋 E用刀片切去部分石蜡，使材料居中 F在大的一边切去少许石蜡,切片分离、不能连成带状 A室温过低 B石蜡过硬 C材料边缘留蜡太少 D刀的角度不适合 补救措施： A在切片机上方开一电灯或提高室温 B在蜡块面加一层45的软蜡或用手指蜡摩擦块面 C重新包埋 D矫正刀的角度,切片卷起呈圆筒状 A室温过低 B石蜡过硬 C刀口太钝 D刀的倾角太大 补救措施： 提高室温 ;加软蜡 ;用毛笔将蜡片摊开压住，切23 片即成带; 减小倾角,切片粘附于切片刀，皱摺在一起 A室温过高 B石蜡过软 C刀口上留有一层石蜡 D刀口钝 补救措施： 降低室温; 将蜡块放入冰箱冷冻层10分钟; 切片厚度，改用硬蜡包埋，用二甲苯拭去刀口的石